材料与试剂

注意：除非另有说明，所有试剂均储存在室温（RT，15-25 °C）下。

P81 Whatman 纤维素层析纸（Sigma-Aldrich，目录号：Z753645），2 x 2 cm 片
注：应有与条件一样多的方格，加上 9 个额外的对照方格，全部一式三份。所有衣物均应在洗涤后用铅笔标记以区分它们。
7 ml 共聚物塑料瓶，无衬里白色聚乙烯螺旋盖（RPI，目录号：125509）
Eppendorf 管（1.5 毫升和 2 毫升）
0.45 µm 过滤器
雄性小鼠（8-20周龄）
70%乙醇
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris 碱）（Cicarelli，目录号：1131214）
Triton X-100（Neo Lab，目录号：01685）
氯化钠（Cicarelli，目录号：750）
MgCl ₂（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物（ATP）（Sigma-Aldrich，目录号：A7699），储存于-20°C
原钒酸钠（Na ₃ VO ₄）（Sigma-Aldrich，目录号：450243），储存于-20°C
β-甘油磷酸二钠盐水合物（G3P）（Sigma-Aldrich，目录号：G6251），储存于-20°C
对硝基苯基磷酸酯（NPP）（开曼化学品，目录号：400090）
cOmplete ^TM，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物（蛋白酶混合物）（Roche，目录号：4693132001），储存于 4 °C
无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906），储存于 4 °C
腺苷3′,5′-环单磷酸钠盐一水合物（cAMP）（Sigma-Aldrich，目录号：3A6885），或者可以使用8-BrcAMP或db-cAMP，储存在-20°C
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）（Sigma-Aldrich，目录号：I5879），储存于-20°C
Kemptide（Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly）（Sigma-Aldrich，目录号：K1127），储存于-20°C
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
三氯乙酸（TCA）（BioChemica，目录号：PAA1431）
正磷酸 85%（Merck，目录号：100573）
ATP (ATP- ³² Pγ) 3000 Ci/mmol；10 mCi/ml（Perkin Elmer，目录号：BLU502A）
实验中待测试的特定药物（抑制剂、激动剂等）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：S-7653）
丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：P-4562）
CaCl ₂ ·2H ₂ O（Sigma-Aldrich，目录号：C-7902）
KH ₂ PO ₄（Sigma-Aldrich，目录号：P-5655）
MgSO ₄ ·7H ₂ O（Sigma-Aldrich，目录号：63138）
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G-6152）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）

解决方案
有关如何准备以下解决方案的详细说明，请参阅“配方”标题：

1 M Tris pH 7.4
3M 氯化钠
1 M 氯化镁₂
1 毫摩尔ATP
100 mM Na ₃ VO ₄
800 mM 3-磷酸甘油醛 (G3P)
500 mM对硝基苯磷酸酯 (NPP)
50 毫克/毫升 BSA
5 mM 肯普泰德
200 mM HEPES pH 7.3
40%三氯乙酸
5 mM 正磷酸
H-TYH 培养基（参见食谱）
裂解缓冲液（参见配方）
100 mM IBMX（参见配方）
激酶缓冲液（参见食谱）

设备

闪烁计数器（LKB Wallac Rackbeta 1209，目录号：090161）
纽鲍尔室
手术剪刀（WPI，目录号：14393）
镊子
轨道震动
孵化器
离心机

软件

Microsoft® Office Excel (Microsoft Office 365) 或类似^软件

程序

使用当天准备裂解缓冲液（配方 2）。将蛋白酶抑制剂混合物留在使用前添加。将缓冲液置于冰上。
计算所需激酶缓冲液的体积，考虑每个反应管 10 µl，并考虑到每个条件（和对照）将一式三份进行。制备激酶缓冲液（配方 4）时，添加除 Kemptide、蛋白酶抑制剂和 ATP- ³² Pγ 之外的所有成分，这些成分将在使用前添加。
从小鼠精子提取物中分离不溶性 PKA 组分
注意：本节介绍如何从小鼠精子提取物的 Triton 不溶性组分中获得 PKA，以用作活性测定中的 PKA 来源。
1. 安乐死 1 只雄性小鼠（8-20 周龄）并进行手术，从两个附睾中提取尾部区域（图 1）。去做这个：
  1. 将安乐死的小鼠放在解剖板上。
  2. 用70%乙醇喷洒腹侧，防止干毛脱落
  3. 使用剪刀，从腹壁切开皮肤和肌肉组织，暴露下腹部内脏（图1A）。
  4. 使用镊子去除覆盖睾丸的脂肪垫，使附睾暴露（图1A）。
  5. 识别附着在睾丸上的附睾，将其切除，并定位尾部区域（图 1B，红色区域）。将其从头和体区域（图 1B 灰色区域）和脂肪组织（图 1B 蓝色区域）中取出。
  6. 用镊子夹住尾部的同时，使用手术剪刀进行 3 至 4 个切口（图 1C）。
2. 将两个附睾放入含有 500 µl H-TYH 培养基的圆底 2 ml Eppendorf 中（图 1D），并在 37°C 下孵育 15 分钟。
  
  图 1. 精子制备。A. 腹侧切口切除附睾。注意镊子夹住附睾尾，附着在睾丸上（红色圆圈）。B. 整个附睾切除。红色，尾部；灰色、caput和语料库；蓝色，脂肪组织。尾部区域用于精子游出。C.在让精子游出之前，应在每个尾部切三到四个切口。D. 将两个附睾放入含有 500 µl H-TYH 培养基的圆底 Eppendorf 管中。
3. 将精子悬浮液（500 µl）转移至新的圆底 2 ml Eppendorf 管中，留下附睾。
4. 通过在 Neubauer 室中计数来检查精子浓度。在 H-TYH 培养基中将浓度调整至 25 x 10 ^{6精子/ml。}
5. 将游出液转移至 1.5 ml Eppendorf 管中。
6. 将精子悬浮液在 RT 下以 10,000 xg离心 3 分钟
7. 弃去上清液。如果 1 ml 中游出的精子量为 25 x 10 ^{6 个}精子，则在使用前将沉淀重悬于 330 µl 补充有蛋白酶抑制剂混合物的冰冷裂解缓冲液中。如果使用不同数量的精子，请相应地修改缓冲液添加量。
8. 将细胞在裂解缓冲液中冰上孵育 30 分钟
9. 将细胞在 4°C 下以 10,000 xg离心 10 分钟。
10. 弃去上清液，将沉淀重新悬浮在 330 µl 裂解缓冲液（或步骤 C7 中使用的相同量）中，并添加新鲜添加的蛋白酶抑制剂混合物。该部分含有 PKA。每个具有 10 µl 级分的条件将从7.5 x 10 ⁵精子中提取可溶性PKA级分。考虑到每种情况至少需要1.5 x 10 ^{5 个精子，应一式三份进行测试。}
11. 保持冰上进行 PKA 活性测定。从现在开始，这个分数被称为PKA 分数。
激酶反应测定
1. 根据需要考虑尽可能多的管，记住每个条件应进行三次实验，加上以下对照：
  1. 阴性对照：含有除PKA组分外的所有反应试剂，用裂解缓冲液代替。它用于测定在不存在 PKA 的情况下由^{32 P 标记的 Kemptide 的量。}
  2. 阳性对照：它是最大PKA活性的对照，即存在1mM cAMP和100μM IBMX时。
2. 添加 10 µl 含有待分析药物的裂解缓冲液。考虑到反应时它将被稀释 3 倍。无论要测试的药物是什么，都必须考虑在与添加此 10 µl 裂解缓冲液相对应的 10 µl 范围内。
3. 向每个管中添加 10 µl PKA 级分，阴性对照除外，其中 PKA 级分应替换为 10 µl 裂解缓冲液。
4. 将所有管子置于冰上直至使用。
从步骤 D5 开始，程序必须在放射性同位素室中执行。请注意，使用放射性物质时必须采取安全措施。需要对人员进行适当的防护，并根据机构规定进行适当的废物处理。
1. 通过添加适量的 ATP- ³² Pγ（参见表 1）来完成激酶缓冲液的制备，同时考虑衰减时间和生产日期，然后添加 1 µCi/测定。
  
  表 1. 用于制备激酶缓冲液的储备液和浓度注意
  
  ：
  1. 除非另有说明，所有试剂均溶解在蒸馏水中。
  2. 添加蛋白酶抑制剂混合物以制备 2x 浓缩缓冲液，因为 PKA 级分已包含混合物。
  3. 添加 BSA 是为了帮助在添加 TCA 后沉淀所有蛋白质，但保持 Kemptide 可溶。
2. 依次向所有管中添加 10 µl 激酶缓冲液，并将其置于 37°C。每 30 秒添加 10 µl 激酶缓冲液开始新反应。跟踪所有管的顺序。这对于在指定时间准确停止反应至关重要。
3. 将管在 37°C 孵育 30 分钟。
4. 30 分钟后加入 10 µl 40% TCA 终止反应。请注意，现在每个管中的总体积为 40 µl。
5. 将管在冰上孵育 20 分钟。
6. 在 RT 下以 10,000 xg离心3 分钟。
7. 对于每个管，取 10 µl 上清液，点到 P81 纸的中心，同时用镊子夹住它（图 2A 和 2B）。每张P81纸都应该用铅笔标记，以便以后识别。等待 5 秒，让液滴被吸收，然后将其释放到含有 1 L 5 mM 正磷酸的 5 L 烧杯中（图 2C）。
8. 每次使用 1 L 5 mM 正磷酸将所有纸张一起清洗 6 x 5 分钟，将烧杯放在轨道摇床上。
9. 当进行步骤 D12 中的清洗时，将 1 µl 激酶缓冲液点在 P81 纸上。使用 3 张不同的纸重复三次，然后将每张纸直接插入不同的塑料瓶中，无需清洗。此步骤对于数据分析计算最初存在于反应介质中的总 ATP- ³² Pγ总量是必要的。
10. 清洗后，将 P81 纸放在塑料托盘上，彼此之间不接触，并让它们风干至少 2 小时（图 2D）。在此步骤中，您可以停止该方案直至第二天。在点样反应混合物之前，根据写在纸上的铅笔标记来识别纸。
11. 干燥后，将纸张单独放入装有 1 ml 闪烁计数器液体的塑料小瓶中，并在小瓶计数器上记录每分钟计数(CPM)。
  
  图 2. P81 纸张打斑。A. 准备 2 x 2 厘米 P81 纸，标有铅笔标记。B. 在每张纸上点样 10 µl 离心后反应混合物的上清液（步骤 D11）。请注意，清洗是在放射性同位素
  室的防护罩后面进行的。C. 将所有纸张一张一张地放入装有 1 L 5 mM 正磷酸的同一烧杯中（步骤 D11）。D. 让所有部件风干，不要相互接触。

数据分析

在 Excel 文件中，记下在步骤D15中获得的每个条件的每分钟计数(CPM) 值（表 2）。这些测量值对应于 P81 纸上点样的 10 µl 反应混合物上清液。表 2.体外PKA 激酶测定数据分析。数据处理步骤AH的示意图。

考虑实验三次，计算每个条件的平均值 ( mean )。
通过从除激酶缓冲液平均值之外的所有平均值中减去阴性对照平均值来获得校正平均值。
将校正平均值乘以 4，将每个条件的平均 CPM 值调整为测定的总体积 (40 µl) ，因为您将 40 µl 中的 10 µl 放在 P81 纸上。
^{使用激酶缓冲液平均 CPM 确定每个反应管中存在的 ATP- 32} Pγ总量。这将用于解决纳入 Kemptide的³² P数量。为此，首先将激酶缓冲液的平均 CPM 值乘以稀释因子（在本例中，稀释因子为 10，因为您从反应中的 10 µl 激酶缓冲液中发现了 1 µl）。
为了确定混合物中有多少 [CPM/ρmol ATP]（在表 2 中记为“b”），除以添加的 ATP 总摩尔数（在本例中，反应混合物含有 800 pmol ATP，记为“a”）表 2）。
要确定每种条件下掺入了多少 ρmol ATP，请将每种条件的总 CPM 除以混合物的 [CPM/ρmol ATP]。
要确定每分钟在每种条件下掺入了多少 ρmoles ATP，请将最后一个值除以反应时间。在本例中除以 30，因为反应持续了 30 分钟。
报告该值时考虑每种情况下使用的精子量。结果示例请参见表 3。

表 3. 结果示例。该表举例说明了使用 PKA 抑制剂 H-89（Sigma #B1427，在 DMSO 中稀释）在指定浓度下获得的结果。
注意：在此示例中，所有管均含有 cAMP 和 IBMX（参见表 1）。

食谱

H-TYH 培养基
一般组成：
119.3 mM NaCl
4.7 mM KCl
0.8 mM 丙酮酸钠
1.71 mM CaCl ₂
1.2 mM KH ₂ PO ₄
1.2 mM MgSO ₄
5.4 mM 葡萄糖
20 mM HEPES
pH = 7.2-7.4
要制备 25 ml 缓冲液，重量：
NaCl 174.3 mg
KCl 8.76 mg
CaCl ₂ ·2H ₂ O 6.28 mg
KH ₂ PO ₄ 4.08 mg
MgSO ₄ ·7H ₂ O 7.39 mg
HEPES 119.15 mg
1. 将所有试剂溶解在 Mili-Q 水中，最终体积为 25 ml
2. 使用 0.45 µm 过滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下保存长达 1 个月
3. 使用当天，添加 2.20 毫克丙酮酸钠和 24.78 毫克葡萄糖
4. 用新鲜制备的 5 N NaOH 将最终 pH 调节至 7.2-7.4
裂解缓冲液（准备当天使用）
一般成分：
25 mM Tris pH 7.4
150 mM NaCl
1x 鸡尾酒蛋白酶抑制剂（不含 EDTA，SIGMA）
1% Triton X-100
制备 900 µl 缓冲液：
1 M Tris，pH 7.4 22.5 µl
3 M NaCl 45 µl
25x 鸡尾酒蛋白酶抑制剂 36 µl
Triton X-100 9 µl
蒸馏水 787.5 µl
100 mM IBMX
将 22.22 mg 溶解在 1 ml DMSO 中
激酶缓冲液
准备 3x 激酶缓冲液，因为它将通过添加 1 体积 (10 µl) 的 PKA 级分加 1 体积的缓冲溶液(10 µl) 稀释 3 倍，占 30 µl 反应管（参见表 1）。考虑到每个管中添加 10 µl 激酶缓冲液，计算以下体积以制备 30 个反应管（10 种不同条件，一式三份）所需的缓冲液量。

致谢

这项工作由 Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica 资助，PICT 2015-3164 和 2017-3217 授予 DK。称为 Kemptide 的七肽由 Kemp 等人首次合成，用于研究 PKA 对其底物的特异性（Kemp等人，1977）。Visconti 等人首次使用了该手稿中描述的改编方案。(1997)

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

伦理

从 C57BL/6 年轻成年雄性小鼠（8-20 周龄）收集附睾尾，并在 Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de Rosario (UNR) 动物护理和使用委员会的监督下处死（批准方案编号 7298/532 ））。

参考

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