材料和试剂

培养皿：直径90毫米x深15毫米（Thermo Fisher Scientific，目录号：101R20）
15 ml聚丙烯管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
50 ml 聚丙烯管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
1.5 ml离心管
0.2 Myu M 注射器过滤器
3.5毫升移液器（SARSTEDT，目录号：86.1171.001）
96孔柔性未经处理的聚氯乙烯通用测定板（Corning，Sigma-Aldrich ，目录号：CLS2595）
96孔牢固的平底透明板（兼容Attune自动进样器，例如，通过Invitrogen的Nunc）
BD Plastipak公司偏心鲁尔-Slip注射器（Fisher Scientific公司，目录号：300866）
血清移液管（Fisher Scientific，目录号：13-676-10J）
柠檬酸三钠BP 3.8％w / v（Martindale Pharmaceuticals，目录号：MS156）
葡聚糖T500（Pharmacosmos ，目录号：5510-0500-9007）
0.9％盐水（氯化钠）（Baxter Healthcare Corporation ，目录号：UKF124）
Percoll （GE Healthcare，目录号：17-0891-02）
RPMI 1640介质（Lonza，目录号：BE12-702F）
汉克的平衡盐溶液（Gibco，生命技术，目录号：14170-112）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442）
青霉素链霉素（Gibco，Life Technologies，目录号：15140122）
1x磷酸盐缓冲盐水（Gibco，Life Technologies，目录号：10010023）
重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）（PeproTech ，目录号：300-03）
绿脓素（如前所述制备（Usher 等，2002），现在可从许多供应商处购买）
膜联蛋白结合缓冲液（ABB）（BD Pharmingen，BD Biosciences，目录号：556454）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
PE共轭膜联蛋白V（BD Pharmingen，BD Biosciences，目录号：556421）
TOPRO-3（分子探针，生命技术，目录号：T3605）
已发布的激酶抑制剂组（PKIS）（可商购（Elkins 等，2016）。
EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
绝对乙醇（Fisher Scientific，目录号：10428671）
Kwik-Diff解决方案2（Thermo Fisher Scientific，目录号：9990706）
KWIK - DIFF溶液3（赛默飞世尔科技，产品目录号：9990707）
6％的Dextran解决方案（请参阅食谱）
90％Percoll （请参阅食谱）
70％乙醇溶液（请参阅食谱）
媒体（请参阅食谱）
膜联蛋白结合缓冲液（ABB）（请参阅食谱）
PE缀合的膜联蛋白V（1:20稀释）（请参阅食谱）
TOPRO-3（1：7,500稀释度）（请参阅食谱）

设备

BD Vacutainer Safety-Lok采血器（Becton，Dickinson and Company，目录号：367282）
水浴（NE1-8，Nickel-Electro Ltd，英国滨海韦斯顿）
II类微生物安全柜（沃克安全柜，目录号：50-600-467）
多通道移液器（Alpha实验室，目录号：AP80300）
贺利氏Biofuge 壁画（Thermo Fisher Scientific，目录号：75005521）
大容量离心机（DBJ Labcare Ltd.，型号：MSE Mistral 3000i ）
CO 2 培养箱（三洋电机株式会社，型号：MCO-17AIC）
细胞计数室（VWR，目录号：630-1510）
Attune流式细胞仪（Attune，Applied Biosystems，Life Technologies，英国佩斯利）
细胞离心涂片器4 细胞离心（热Fisher Scientific公司，目录号：A78300003）

小号oftware

FlowJo 流式细胞仪数据分析软件（FlowJo ，LLC）
GraphPad Prism 8（GraphPad软件，加利福尼亚州圣地亚哥）

程序

第一部分：从外周血中分离中性粒细胞

经当地伦理委员会批准并获得志愿者的知情同意后，从健康受试者中采集血液。所有处理血液和血液制品的科学家均接受了乙型肝炎疫苗的接种。除采血和离心步骤外，在II类生物学内进行所有工作安全柜。

制备
准备II级生物安全柜，以用70％的乙醇或类似清洁剂清洗使用。
在设置为37°C的水浴中预热6％的Dextran溶液。
将90％Percoll 溶液放入机柜，使其达到室温。
通过添加5 ml的3.8％柠檬酸三钠作为抗凝剂，准备一个50 ml的血液采集管。
注意：柠檬酸三钠浓度=总体积的11％。

采血
使用BD Vacutainer Safety-Lok血液采集套件通过静脉穿刺获得外周全血样品，将40毫升血液收集到50毫升注射器中。
注意：血液通常在一天的同一时间（上午8时至10时之间）获得。

立即将血液转移到装有柠檬酸三钠的50毫升试管中，使血液缓慢流过试管侧面以避免形成气泡，缓慢倒转几次以进行混合。

中性粒细胞分离
20时以323 x g 离心血液 ℃， 20分钟（图1，自旋1）。
这导致将血液样本分离为富血小板血浆（PRP）和血细胞的两个不同层（图1A）。

使用血清移液管，再用巴斯德移液管，将PRP转移到新的50 ml管中，避免干扰接口。
将PRP在20°C下以896 xg的速度离心20分钟（图1，旋转2）以沉淀血小板，将PRP离心后，将上清液（PPP ，图1B ）转移至新的50 ml管中。可以丢弃。
在此离心步骤中，将6 ml预热的6％葡聚糖溶液加至Ste p C 1 剩余的血细胞层中，并加满50 ml盐水，放回盖子并倒置轻轻混合。盖上盖子，并使用巴斯德移液器清除管顶部周围或盖子上形成的任何气泡。
松开盖子，在室温下静置20-30分钟，并应看到清晰的界面。
右旋糖酐沉淀后（图1C），使用血清移液管和巴斯德移液管将浅白色上层白细胞层转移至干净的50 ml管中，注意不要打扰界面。
在20°C下以224 xg离心6分钟（图1，旋转3）。
在离心步骤中，制备了不连续的血浆/ Percoll 梯度。
将两个单独的15 ml管分别标记为“上相”和“下相”。
要制备下层相，请添加1.02 ml的90％Percoll （配方2）和0.98 ml的PPP ，向上或向下吹打小心混合，避免产生气泡。
注意：为确保准确性，请使用p1000移液器制作渐变层。

要制备上层相，请将0.84 ml的90％Percoll 与1.16 ml的PPP混合，并按上述小心混合。
用巴斯德移液器吸取全部2 ml的上层相，并非常缓慢地将其沉积在下层相的顶部，将装有下层相的试管以45°角保持，以使液体缓慢向下流到试管的侧面并位于较低阶段的顶部。
注意：避免形成气泡。

离心（步骤C7）完成后，除去并弃去上清液，然后通过使管以圆周运动缓慢旋转，将白细胞沉淀轻轻重悬于2 ml PPP中。
注意：细胞沉淀是柔软的，处理时需要格外小心。

使用与步骤C 8d 相同的谨慎技术，将所有2 ml重悬的白细胞群体沉积在梯度上相的顶部（图1D）。
在无制动器的情况下，在20°C下以271 xg的速度离心含有梯度的试管11分钟（图1，旋转4）。
注意：这将产生三层细胞：残留在管底部的红细胞，中层的粒细胞和最靠近顶部的外周血单核细胞（PBMC）（图1E）。

使用巴斯德吸管，将PBMC层移入干净的50 ml管中，确保除去尽可能多的细胞，因为残留的PBMC可能污染粒细胞层。
注意：PBMC 可以重新悬浮在介质中，并用于其他协议，也可以在不需要时丢弃。

使用巴斯德吸管，将粒细胞层移入干净的50 ml管中，以吸收尽可能多的细胞，但要避免干扰红细胞沉淀。
向试管中加入10 ml PPP，用Hank的平衡盐溶液（HBSS）加满40 ml，并颠倒混合以确保均匀的细胞悬浮液。
使用细胞计数室对细胞进行计数。
在20°C下以504 xg离心6分钟（图1，旋转5）。
除去浓缩液，将细胞沉淀轻轻重悬于培养基中（配方4），使其终浓度为5 x 10 6 细胞/ ml。
新鲜分离的嗜中性粒细胞细胞离心（300 转，3分钟，细胞离心涂片器4 细胞离心）显微镜载玻片上，并用郭建义差速器染色dyes.The 预备的纯度通过细胞形态学评估（图2A）确定。这些幻灯片也可使用根据形态变化来鉴定凋亡的中性粒细胞（图2B）。
注意：最近以200 rpm，3分钟培养的中性粒细胞。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1903060--1414 LynnePrince 843882 \ Figs jpg \图1.jpg

图1.中性粒细胞分离方案的流程图

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1903060--1414 LynnePrince 843882 \ Figs jpg \图2.jpg

图2. 健康和凋亡的中性粒细胞形态分离后（A），中性粒细胞很健康，核裂片通过串状染色质桥连接（红色箭头），凋亡的中性粒细胞（B，蓝色箭头）可以通过四舍五入来识别。通过油浸显微镜在Kwik-Diff染色的细胞离心玻片上观察到细胞核并没有染色质桥。

第二部分：高通量激酶抑制剂凋亡测定

注意：请参见图3，以了解该协议部分的示意图。

图3.细胞凋亡筛选方案流程图

A. 测试化合物的制备

将溶解在DMSO中的已发布的激酶抑制剂套装（PKIS）化合物预先分装到96孔板中。使用多通道移液器将每种化合物的等分试样转移到干净的96孔板中，并在培养基中稀释以达到最终10倍浓度子库存（在这种情况下为625 µM）。
在无菌的E ppendorf管中，准备对照试剂的稀释液（在这种情况下为氰化蛋白和GM-CSF，它们分别加速和抑制中性粒细胞凋亡），以达到10倍的最终浓度子储备液（对于氰化蛋白为500 µM，对于GM为500 U / ml）-CSF ）。通过以与对照试剂相同的比率（v / v）稀释培养基中的DMSO来制备DMSO。
将所有试剂放在冰上，直到需要为止。
注：一个Lternative 抑制剂库和控制化合物可以更适合用户试验。

B. 播种板

取两个无菌的96孔柔性，未经处理的聚氯乙烯通用测定板并标记对照板：A和测试板：B。
将50 µl培养基添加到A板的8个孔中（请参阅下面的A板模板）。
注意：图板A包括用于技术控制的孔，包括未染色的样品以及膜联蛋白V和TOPRO-3的单一染色质控制，由于膜联蛋白V的结合是钙依赖的过程，因此还包含一个包含EDTA的其他控制。

在相应的成对的孔板b。添加激酶抑制剂化合物[62.5μM]和测定对照化合物（媒体，DMSO（载体对照），GMCSF [50 U / ml的]和绿脓菌素[50μM]）（见板乙模板）。使用用多通道移液器向含有40μl培养基的孔中添加10μl每种激酶抑制剂化合物子储备液（请参阅步骤A 1）。分别添加10μl的花青素，GM-CSF和DMSO子储备液（请参见步骤A 2 ）到含有40 µl培养基的孔中。最后包括2个含有50 µl 培养基的孔。
30×10重悬6 新鲜在6ml温暖介质中的最终密度分离嗜中性粒细胞5×10 6 / ml的（见小号TEP Ç 17 P 艺术我）。
将细胞悬液转移至无菌培养皿中，并使用多通道移液器，将50 µl细胞悬液转移至板A 的8个孔和板B的所有孔中。
在37 °C 和5％CO 2 的潮湿培养箱中孵育6小时。
注意：Ç 抑制剂化合物和对照化合物的oncentrations基于100微升每孔的终体积计算，因为加入50μl中性粒细胞悬浮液中加入制备100微升的总体积（图3）。每个孔含有2.5×10 5 细胞。

请参阅下面建议的用于染色对照和测定板的模板（表1-2）：

1个

2

3

四个

五

6

7

8

9

十

11

12

一个

ü

ü

A5

A5

EDTA

EDTA

T3

T3

乙

C

d

Ë

F

G

H

表1.板A模板（流式细胞仪对照）

U = 未染色；A5 = PE-Annexin V单染对照，T3 = TOPRO-3单染对照

表2. B板模板（测试板）

1个

2

3

四个

五

6

7

8

9

十

11

12

一个

中号

中号

d

d

G

G

P

P

一世

一世

一世

一世

乙

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

C

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

d

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

Ë

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

F

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

G

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

H

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

一世

M = 介质； D = DMSO； G = GMCSF； P = 菁花色素，I =抑制剂化合物

C. 染色细胞用于流式细胞仪凋亡测定

温育后，使用多通道移液器轻轻上下吸移2-3次以重悬细胞，并将细胞悬液转移至与Attune自动进样器兼容的牢固的96孔板中，并将板置于冰上。
在4 °C下以378 xg 离心平板6分钟。
使用多通道移液器，小心去除污染物，而不会干扰细胞并丢弃污染物。
使用多通道移液器，添加150 µl冰冷的PBS，轻轻重悬细胞以如上所述洗涤和离心平板。
在离心过程中，准备以下工作：
通过稀释10 x ABB来获得1x ABB（膜联蛋白结合缓冲液）（请参阅配方5 ）

PE共轭膜联蛋白-V（请参见配方6 ）

离心之后，移除颜料，立即加入50 微升稀释的PE缀合的膜联蛋白-V，除了未染色和TOPRO-3单染色对照孔的所有孔（见下面的表3 ），并混合gently.To EDTA控制瓦特厄尔添加EDTA至终浓度为0.02M。

表3.细胞死亡探针染色条件

条件

PE-Annexin V

TOPRO-3

媒体（M）

+

+

二甲基亚砜（D）

+

+

GMCSF（G）（抗凋亡）

+

+

绿脓素（P）（促凋亡）

+

+

抑制剂化合物（一）

+

+

未染色（U）

--

--

Annexin V单一污渍对照

+

--

EDTA控制

+

--

TOPRO-3单一污渍控制

--

+

覆盖与板铝箔最小化暴露于光并孵育在黑暗中在室温下20分钟。
在孵育期间，准备1x ABB溶液中的TOPRO-3溶液（1：7,500 v / v）（请参见第7条）。
在温育期之后，向除未染色，膜联蛋白-V单染和EDTA对照孔之外的所有孔中添加150 Myu L 的TOPRO-3溶液（请参见上表3 ）。
到每个未染色，膜联蛋白-V单染色和EDTA对照孔中，添加150 微升1×ABB的。
将样品从A板孔中转移到相应的1.5 ml离心管中。管中未染色的单个菌株对照将用于在样品采集过程中设置细胞仪参数。

D. 流式细胞仪样品采集

执行与样本采集Attune的TM 使用流式细胞仪Attune的TM 式微软件按建议的协议。

从试管中采集样品以进行不染色和单染色控制，以设置参数设置。
基于典型的前向（FSC）和侧面（SSC）散射曲线的门嗜中性粒细胞（见图4A ）（Prince 等，2012 ）。
使用内置的自动进样器执行样品采集，该自动进样器根据预设程序以机器人方式从96孔板中采集样品。设置流式细胞仪以从中收集预定义数量（例如10,000）的门控事件常规地从A1至H12孔读取板。
注意：每个96孔板大约需要60分钟才能完成采集，因此我们建议限制采样板的数量，以免采集时间过长而影响结果。

E. 数据分析

将数据导出到文件.fcs和分析通过流式细胞仪分析软件的FlowJo 。
基于门中性粒细胞的典型前向（FSC）和侧面（SSC）散射曲线（请参见图4A ）。
根据膜联蛋白V和TOPRO-3阳性事件的象限分布分析门控中性粒细胞（参见图4B ），确定每个象限中出现的细胞百分比。
通过膜联蛋白-V阳性和膜联蛋白-V / TOPRO-3双重阳性事件的总和计算凋亡百分比。
计算至少三个独立实验的平均凋亡百分比。
与DMSO对照相比，计算抑制剂化合物的凋亡倍数变化。
注意：在优化实验中，我们确认了通过高通量流式细胞术测定的凋亡百分率与通过光学显微镜测量的凋亡密切相关。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1903060--1414 LynnePrince 843882 \ Figs jpg \图4.jpg

图4.评估中性粒细胞凋亡的流式细胞术门控策略A. 中性粒细胞首先根据前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）特性进行门控。FSC-A与SSC-A的分布为以伪所示彩色散点图。（B）门控嗜中性粒细胞然后分析基于所述膜联蛋白-V与TOPRO-3分布轮廓，和凋亡的膜联蛋白-V阳性单的求和计算的（Q1）和膜联蛋白-V / TOPRO -3次双重阳性（Q2）事件，代表性实例显示，膜联蛋白V / TOPRO-3在经培养基和绿脓素处理的中性粒细胞中的分布。

数据分析

该方案通常产生白细胞总数超过95％的中性粒细胞，其他细胞包括嗜酸性粒细胞，单核细胞，淋巴细胞和红细胞，这在我们的实验中通过细胞离心和用Kwik-Diff染色2和5染色最终细胞进行评估。图3中的细胞可以鉴别血细胞，不包括纯度小于95％的嗜中性白细胞的分离，更多细节见原始文献（Rahman 等，2019）。

每次嗜中性白细胞的分离均在单个供体的全血样品上进行，每个供体的数据均视为独立实验（即n = 1）。数据集的最小值为n = 3，并计算平均值±SEM使用GraphPad Prism 8（GraphPad Software，San Diego，CA）进行统计分析，并在P < 0.05 接受显着性。更多细节请参见原始引文（Rahman et al。，2019）。

菜谱

6％葡聚糖溶液
3克葡聚糖

50毫升盐水

在37°C将C溶解在水浴中并过滤，使用50 ml 注射器和0.2 MYU中号注射器˚F 我大号泰尔。一旦做出，解决方案可以保存在2-8℃长达两周

90％Percoll
9毫升Percoll 高汤

1毫升无菌盐水

70％È THANOL溶液
用蒸馏水准备70％v / v乙醇溶液

媒体
500毫升RPMI 1640

10％胎牛血清（加热灭活）

1％青霉素-链霉素

将重构的介质保持在4°C，远离光线

膜联蛋白结合缓冲液（ABB）（30毫升）
3毫升10x ABB

27毫升蒸馏水

建议重新准备

PE共轭膜联蛋白V（1:20稀释;足以用于100孔）
4.75毫升ABB（47.5 x 100 = 4,750微升）

250 µl PE共轭膜联蛋白V

TOPRO-3（1：7,500稀释度）
20毫升ABB

2.66微升TOPRO-3

致谢

联邦奖学金委员会资助的Atiqur Rahman 博士生，该协议改编自先前的工作（Haslett 等，1985）。

利益争夺

作者没有竞争利益要声明。

伦理

根据南谢菲尔德研究伦理委员会的指南（针对年轻健康受试者;参考号STH13927），对从健康供体外周血样本中分离出的嗜中性白细胞进行了体外实验。遵照国家研究伦理服务（NRES）委员会约克郡和亨伯（参考编号：10 / H1016 / 25）的要求，还使用了患有慢性阻塞性肺疾病的患者和年龄匹配的健康对照者。参考号：10 / H1016 / 25。解释了研究的性质和可能的后果。

参考文献

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