材料和试剂

0.22 微米过滤器
70毫升灯丝管
永久标记
盖玻片
单口圆底烧瓶（Sigma-Aldrich，目录号：Z414514）
0.45 Myuemu 注射式过滤器（CSI 一个Nalytical 我Nnovations，目录号：30103）
脊髓钩（精细科学工具，目录号：1016212）
＃10刀片（Albion，目录号：15478491）
5-0可吸收缝线（Assut ，目录号：704031）
4-0缝合线（Assut ，货号：6543）
Sprague Dawley雌性大鼠，200-250克，8-10周大
骨髓间充质干细胞（Lonza，目录号：10HU-217）
培养基DMEM（生物我Ndustries，目录号：01-056-1A）
L-谷氨酰胺（生物工业公司，目录号：03-022-1B）
链霉素-青霉素新霉素（Biological I Ndustries，Catalog Number：03-034-1B）
非鹰MEM必需氨基酸（生物我Ndustries，目录号：01-340-1B）
肝素（Sigma ，目录号：H9267-1MG）
血小板裂解物（以色列拉宾医学中心）
PKH26染料（Sigma，目录号：PKH26GL-1KT）
贫氘水（DDW）（Thermo Scientific）
氢氧化钠（NaOH ）（Sigma，目录号：1310-73-2）
O 酸（西格玛（Sigma），目录号：112-80-1）
棕榈酸（Chem-Implex Int'l，目录号：14036）
HAuCl 4 （Sigma，目录号：27988-77-8）
抗坏血酸（Sigma，目录号：50-81-7）
O-（2-羧乙基）-O '-（2-巯基乙基）七乙二醇（PEG7）溶液（Sigma，目录号：866889-02）
正己烷（Bio-Lab，目录号：110-54-3）
HCl 溶液（Deajung ，目录号：764701-0）
N- 羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐（NHS）（Sigma，目录号：106627-54-7）
N-（3-二甲基氨基丙基）-N- 乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）（Sigma - Aldrich，目录号：25952-53-8）
葡萄糖2（2GF）（D-（+）-葡萄糖胺盐酸盐（Sigma - Aldrich，目录号：66-84-2）
丙酮（Romical ，目录号：19-009001-72）
氯胺酮（Vetoquinol ，目录号：8c0903c）
甲苯噻嗪（欧罗维特，目录号：084697）
异氟烷（Abbott L Aboratories，目录号：6041795）
眼药膏（爱尔康（Alcon），目录号：16D12E）
丁丙诺啡（Medi-market，目录号：V82806J）
0.9％的盐水（Baxter，目录号：18K29E0B）
多碘碘（Fisher博士，目录号：BND0410PT20.2）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：14200067）
4％多聚甲醛（ChemCruz ，目录号：sc281692）
蔗糖（Baker分析，目录号：57501）
Triton X-100（Biolab，目录号：20180501）
Tween-20溶液（Sigma，目录号：P2287）
一抗
NeuN 抗体（Abcam ，目录号：ab104225）
GFAP抗体（Millipore，目录号：AB5804）
TMEM119抗体（NovuBio ，目录号：NBP23055）
二抗
抗兔647山羊（LifeTechnologies ，目录号：A21244）

DAPI （Sigma，目录号：D9592）
牛血清白蛋白（BSA）（密理博，目录号：820451）
蔗糖溶液（请参阅食谱）
阻止解决方案（请参阅食谱）
补间解决方案（请参阅食谱）

设备

Tunstem 硬质合金诺伊斯microscissor （精细的科学工具，目录号：1551412）
Friedman-Pearson Rongeur（精细科学工具，目录号：1602114）
加热垫（Gaymar Industries，型号：TP702）
电动剃须刀（Oster Golden A5 Tw o-speed，型号：07800550002）
吸入的建立（MATRX TM VIP 3000校准汽化器，CA talog 号：V1419556）
漏斗（分液漏斗的250ml /玻璃活栓）（Sigma公司，CA talog号码：64803-U）
真空泵（Millivac -迷你真空泵）（Merck公司，CA talog号：XF5423050）
电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES ）（美国圣克拉拉，安捷伦，型号：5100VDV）
火焰原子吸收光谱法（安捷伦科技公司，型号：SpectrAA 140 ）
Micro-CT扫描仪（Skyscan 高分辨率，型号：1176）
低温恒温器（德国，徕卡，型号：CM1850 ）
共聚焦显微镜（蔡司，型号：LSM700）
超速离心机（贝克曼，型号：Optima XE-90超速离心机）

软件

斐济：ImageJ
GraphPad棱镜7
Matlab的
SkyScan CT体素（“ CTVox ”）
SkyScan CT体积（“ CTVol ”）

程序

外泌体的产生与纯化
在DMEM培养基中培养人骨髓间充质干细胞，该培养基富含1％L-谷氨酰胺，1％青霉素-链霉素-新霉素，1％MEM-eagle非必需氨基酸，0.04％肝素和10％无外泌体的血小板裂解液，持续3天。
每T75烧瓶中的收集10毫升培养基的当细胞在80 - 90％汇合（3×10个6 ..细胞/瓶），共110毫升介质的执行外来体分离的使用标准差速离心协议，在4℃的简要在300，离心机介质XG 10 min.Centrifuge定子在2000 ×g下以10,000rpm进行10分钟，再离心XG 通过0.22 30分钟，然后在真空微米filter.Centrifuge所收集的束以100,000 ×g离心70分钟（转子：TI-45 Beckman； 70 ml毛细管），用70 ml PBS洗涤沉淀，然后以100,000 xg离心70分钟，将最终沉淀重悬于200μl 无菌PBS中。

用GNP或PKH26标记外来体
合成GNP
a。在带有搅拌磁铁的单颈圆形英语（美国）底部烧瓶中，加入100 ml贫氘水（DDW）和油酸（2.437 ml），棕榈酸（600 mg）和乙醇（15 ml，99％）的混合物）。

b。在另一个试管中搅拌NaOH（200 mg）和DDW（30 ml），直到溶液溶解，然后将其添加到上述混合物中。

c。在搅拌溶液的同时，添加HAuCl 4 （100 µl，50 mg / ml），然后非常缓慢地逐滴添加抗坏血酸（5 ml，0.05 M），在搅拌的同时再等待5分钟。

d。向GNP溶液中添加15. O-（2-羧乙基）-O ' -（2-巯基乙基）七乙二醇（PEG7，2.26 x 10 -3 g），然后搅拌1 h。

e。用NaOH使混合物的pH = 9，然后再搅拌1小时。

f。加入正己烷（80毫升），然后将溶液搅拌1小时。

g。使用HCl溶液（100 µl，37％）将pH调节至7。

H. 在一个漏斗（分液漏斗250 毫升/玻璃旋塞阀，Si Gma）中，在室温下对混合物进行相分离（水和有机物）（图1 ），重复相分离4次，直到只剩下水溶液。

图1.相分离。以下5 纳米GNP形成一个漏斗，以便将有机相（上面，白色）和水相之间分离使用（底部，紫色）被重复。这步骤直到包含纯水溶液剩余的GNP。

我添加溶液无线个N- 羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐（2.12 X 10 -3 克），N-（3-二甲基氨基丙基）-N ' - 乙基碳二亚胺盐酸盐（1.87 X 10 -3 克），和葡萄糖胺（D-（ +）-氨基葡萄糖盐酸盐）（1.75 x 10 -3 g），搅拌3小时。

j。将酵母添加到GNP溶液（GNP：Aceton 1：4的比例）中，并在24°C，20,000 xg 下离心30分钟，用移液管轻轻抽出沉入管底的颗粒。

k。将颗粒的面纱连接到真空泵（Millivac- Mini真空泵，Merck）上，以蒸发液体中剩余的所有细胞。

l。使用ICP-OES测量颗粒的浓度，金的浓度应为30-35 mg / ml。

将总共2.8 x 10 10 MSC-Exo（在1 ml盐水中的200μl 外泌体）与涂有葡萄糖的GNP（35 mg / ml，100μl ）在37°C下孵育3 h。
在4°C下以100,000 xg 离心MSC-Exo 2小时，然后将GNP标记的MSC-Exo重悬于200 µl PBS中。
对于PKH26标记，将2.8 x 10 10 MSC-Exo与PKH26染料在37°C下混合5分钟。用70 ml PBS 在100,000 xg ，4°C下超速离心2 h 洗涤。将PKH26标记的MSC-Exo重悬于200微升PBS。

脊髓损伤模型
注意：所有动物实验均应由当地伦理委员会审查和批准。

雌性Sprague Dawley大鼠（200-250 g）保持12 h光照/黑暗周期，随意获取食物和水。
确保手术前约一周的适应期。
在整个过程中，确保手术台和工具干净无菌，以最大程度地减少感染风险。
通过腹腔注射氯胺酮（60-90 mg / kg）和甲苯噻嗪（10-15 mg / kg）混合物麻醉大鼠，并以1 L / min 的流速吸入1-2％异氟烷。
将麻醉的大鼠仰卧在加热垫上，以保持核心体温在37 °C。
确保有足够的麻醉，如在捏或角膜反射时没有爪子缩回，这表明。
在两只眼睛上涂抹眼药膏以保护眼睛。
使用电动剃须刀剃除背部的皮毛（约5厘米x 6厘米）。
当大鼠的躯干弯曲时触诊突出处，并使用永久性标记物标记该点。
使用多碘溶液消毒该区域，然后用70％乙醇溶液消毒两次。
皮下注射丁丙诺啡（0.01-0.05 mg / kg），以最大程度减少术后疼痛。
使用＃10解剖刀以中点确定的点为中心执行2 cm矢状正中切口。
分离椎旁肌肉以暴露椎骨突。
使用Rongeur暴露脊髓以除去T10椎体。
使用脊髓钩提起脊髓。
使用微剪刀进行全横切。
使用0.9％的盐水灌溉受伤的田地。
清洁血液以使手术视野清晰。
提起已切断的脊髓残端并在间隙内通过脊髓钩以确保脊髓根管底部和外侧无残留纤维，从而确保病灶完整。
使用4.0缝线逐层缝合肌肉和皮肤。
轻轻地将大鼠置于温控的补充氧气的恢复室中，以使其完全恢复。
三小时后损伤，用于显微CT ，FAAS和ICP研究，使用微量移注入10 微升GNP标记的外来体以鼻孔的一侧，等待2分钟注入另一个10之前微升剂量其他side.This 步骤重复再次2分钟后，对于20个的最终体积微升外泌体注入到每个side.For免疫荧光研究，用微量移注入10 微升PKH26-lableled外来体以鼻孔的一侧，等待2分钟注入之前另一个10 向另一侧注入µl 剂量。此步骤在2分钟后再次重复。
每8小时轻轻按摩膀胱并皮下注射丁丙诺啡（0.0 1-0.05 mg / kg）。
组织处理和microCT 成像采集
GNP标记的外泌体处理后二十四小时，通过建筑物提供的CO 2 设置，在CO 2 安乐死室内使用CO 2 对大鼠实施安乐死。
用咬骨钳和剪刀切除周围的骨骼结构后，轻轻收集嗅球，全脑和脊髓组织。
在4 °C下将解剖的组织浸入4％多聚甲醛（PFA）中过夜。
使用1x PBS清洗组织5分钟。
使用microCT 扫描仪（Skyscan 高分辨率型号1176）扫描组织，成像参数如下：45 kV管电压，0.2 mm铝滤光片和35μm 标称分辨率。在GPU加速的SkyScanNRecon 软件中使用改良的算法（Feldkamp ）进行重建。使用25％的光束硬化校正，3％的高斯平滑和减少环形伪影。在SkyScan CT-Voxel（“ CTVox ”）和SkyScan CT-Volume（“ CTVol ”）软件中使用 RGBA传递函数来生成体积渲染的三维图像。

用于FAAS和ICP研究的组织处理
GNP标记的外泌体治疗后二十四小时，使用CO 2 安乐死大鼠。
收获并称重嗅球，全脑，脊髓组织，肺，肝，肾，心脏和脾脏（使用钳子和剪刀去除嗅球，全脑和脊髓组织周围的骨骼结构；收集整个肺和心脏胸腔和腹腔的肝脏，肾脏和脾脏）。
对于FAAS研究，消化肺，肝，肾，心脏和脾用1ml王水酸（硝酸的混合物（Biolab公司有限公司）和盐酸（Daejung ，CAS：7647010）以1:1的体积比为1:3 ）。让溶液在室温下在化学通风橱中蒸发24小时，然后加热半小时至60 °C ，并用DDW稀释至4 ml总溶液。通过0.45过滤红枫μm注射器过滤器。使用线性校准曲线测量金浓度，该线性校准曲线是使用已知金（Au）浓度为0.1、1、2和5 mg / ml的溶液制备的。
为ICP研究中，燃烧嗅球和大脑和脊髓组织，在550 ℃进行5小时。1％HNO添加5毫升3 至消化的组织和过滤器通过0.45 微米注射器filters.Measure金浓度的试样，在与金标准曲线的相关性。

用于免疫荧光研究的组织处理
PKH26标记的外泌体治疗后二十四小时，使用CO 2 安乐死大鼠。
使用咬骨钳取下周围的脊柱后，收集脊髓组织，并将组织浸入4 °C下5 ml 4％PFA中过夜。
用1x PBS冲洗组织2分钟，然后将组织浸入4 °C的10 ml 30％蔗糖溶液中过夜。
将组织嵌入最佳切割温度溶液中。
组织纵向节20 MYU 中号厚度。
在100 µl 0.5％Tween溶液中透化组织切片。
用1x PBS冲洗组织切片三次，每次洗涤5分钟。
在室温下，用100 µl 5％BSA封闭组织1 h。
在4 °C下，用在5％BSA中稀释的50 µl 一抗孵育组织过夜。
用1x PBS冲洗组织切片三次，每次洗涤5分钟。
在室温下，将组织与50 µl 用1x PBS稀释的二抗孵育1小时。
用1x PBS冲洗组织切片三次，每次洗涤5分钟。
用盖玻片安装组织切片。
使用共聚焦显微镜（蔡司）扫描组织切片。

数据分析

GNP-外来体quantificatio ñ
测量嗅球和整个大脑，脊髓组织，肺，肝，肾，心脏和脾脏的重量。
使用ICP测试，测量嗅球和整个大脑以及脊髓组织中的GNP浓度；使用FAAS测试，测量肺，肝脏，肾脏，心脏和脾脏中的GNP浓度。
比较受伤和健康大鼠之间嗅球以及整个大脑，脊髓组织，肺，肝，肾，心脏和脾脏中每毫克组织的GNP浓度（表1）。

表1.脊髓组织的ICP测试结果

样品

每毫克组织毫克金（n = 3）

健康脊髓

6.44E-08±1.54E-08

脊髓受伤

1.20E-07±1.30E-08

PKH26标记的外体定量
染色冰冻切片用鼻内PKH26-外来体处理的损伤的脊髓组织，使用针对抗体的NeuN ，GFAP，或TMEM119分别。
拍摄那些被标记的组织的免疫荧光图像（图2 ）。

图2 。免疫荧光染色脊髓延髓头端要的病变。A.神经元。B. 星形胶质细胞，和C. 小胶质细胞是在绿色和外来体在红色。比例尺= 25 MYU M.

在每组免疫荧光图像中，使用Matlab 代码如下计算与NeuN 或GFAP或TMEM119 共定位的PKH26信号（图3 ）。

清除全部;

关闭全部;

[ 文件名，路径名] = uigetfile （'*。*' ，'Select Image' ）;

im = imread （strcat （pathname，filename ），' tif ' ）;

imgsize = size（im ）;

imgpixX = imgsize （2）;

投资回报率= 垄断（im ）;

imR = double（im （：，：，1））。* ROI / 255;

imG = double（im （：，：，2））。* ROI / 255;

％imG = double（im （：，：，2））。* ROI / 255;

％imR = double（im ）。* ROI / 255;

％imG = double（im ）。* ROI / 255;

imBWR = im2bw（imR，0.2）;

imBWG = im2bw（imG，0.1）;

图（1）

imagesc （imBWR ）;

图（2）

imagesc （imBWG ）;

greenAndred = imBWR 。* imBWG ;

图（3）

imagesc （greenAndred ）;

Total_red = sum（sum（imBWR ））;

redINgreen = sum（sum（greenAndred ））;

百分比= 100 * redINgreen / Total_red ;

fid = fopen （'exosome.csv' ，'a +' ）; Excel文件的％name

fprintf （fid，'％s，％f，％f，％f \ n' ，filename，Total_red，redINgreen，precentage ）;

fclose （fid）;

比较NeuN ，GFAP或TMEM119染色组织之间的共定位。

图3 。Matlab的分析中的外来体共定位的神经元。A.外泌体信号。B.神经信号，而C.共定位信号泌体与神经元之间。

要分析两组之间的数据，请使用学生t 检验或单因素方差分析与事后土耳其多重比较检验进行两组以上的数据，数据以平均值±标准差表示。显着性水平：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。

菜谱

蔗糖溶液
30克蔗糖

加入100毫升PBS

阻塞解决方案
2.5克BSA

加入50 ml PBS

补间解决方案
200 µl 吐温20

加入40毫升PBS

致谢

这项工作得到了J＆J Shervington 基金会（SL），以色列脊髓损伤基金会（SL）和以色列科学基金会ISF 749/14 （RP）的支持。我们感谢Brainboost 项目以奖学金的形式支持N Perets。我们还要感谢高等教育理事会和以色列科学技术与空间部为奖学金获得者O Betzer提供的支持。该工作改编自先前的工作（Guo et al。，2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

所有实验步骤均已通过以色列以色列理工学院的伦理委员会审查和批准（IL1130817，有效期：01.01.2018至01.01.2022）。

参考文献

Alvarez-Erviti，L.，Seow，Y.，Yin，H.，Betts，C.，Lakhal，S.和Wood，MJ（2011）。通过全身注射靶向外来体将siRNA递送至小鼠大脑。Nat Biotechnol 。 29（4）：341-345。
Betzer，O.，Barnoy，E.，萨丹，T.，Elbaz的，I.，布雷弗曼，C.，刘，Z。和Popovtzer，R。（2019）。在成像策略进展为在体内的外来体的跟踪。威利Interdiscip Rev Nanomed纳米生物技术：e1594。
O.Betzer，N.Perets，N.，Angel.A。，Motiei，M.，Sadan，T.，Yadid，G.，Offen，D. and Popovtzer，R.（2017）。使用金对囊泡进行体内神经成像。纳米颗粒 ACS纳米11（11）：10883-10893。
Betzer，O.，Perets，N.，Barnoy，E.，Offen，D.和Popovtzer，R.（2018）。使用金纳米颗粒标记和跟踪大脑中的外泌体.SPIE BiOS ，2018，旧金山，加利福尼亚州，美国状态
A. Busato，R. Bonafede，P. Bontempi，Scambi，I.，Schiaffino，L.，Benati，D.，Malatesta，M.，Sbarbati，A.，Marzola，P.和Mariotti，R.（ 2016）。干细胞的超小型超顺磁性氧化铁标记的外泌体的磁共振成像：获得标记的外泌体的新方法。Int J Nanomedicine 11：2481-2490。
A.Busato，R.Bonafede，P.Bontempi，I.Scambi，I.Schiaffino，L.，Benati，D.Malatesta.M。，Sbarbati，A.，Marzola，P。和Mariotti，R。（ 2017）。从脂肪干细胞分离的外泌体的标记和磁共振成像 .Curr Protoc Cell Biol 75：3 44 41-43 44 15。
Faruqu，FN，Wang，JT，Xu，L.，McNickle，L.，Chong，EM，Walters，A.，Gurney，M.，Clayton，A.，Smyth，LA，Hider，R.，Sosabowski，J.。and Al-Jamal，KT（2019）。外来体的膜放射性标记，用于免疫能力强和免疫缺陷的小鼠的比较生物分布分析-新型通用方法治疗学9（6）：1666-1682。
Grange，C.，Tapparo，M.，Bruno，S.，Chatterjee，D.，Quesenberry，PJ，Tetta，C.和Camussi，G.（2014）。间充质干细胞衍生的细胞外囊泡在通过光学成像监测急性肾损伤。国际分子医学杂志33（5）：1055-1063。
Guo，S.，Perets，N.，Betzer，O.，Ben-Shaul，S.，Sheinin，A.，Michaelevski，I.，Popovtzer，R.，Offen，D.和Levenberg，S.（2019）。负载磷酸酶和张力蛋白同源siRNA 的间充质干细胞来源的外泌体的鼻腔内递送修复了脊髓的完全损伤 .ACS Nano 13（9）：10015-10028。
Hu，L.，Wickline，SA和Hood，JL（2015）。淋巴结中黑色素瘤外泌体的磁共振成像 .Magn Reson Med 74（1）：266-271。
Jia，G.，Han，Y.，An，Y.，Ding，Y.，He，C.，Wang，X.和Tang，Q.（2018）.NRP-1靶向和载有货物的外泌体有助于同时成像脑胶质瘤的治疗以及体内和体外。生物材料178：302-316。
Jiang X，Zong，S.，Chen C.，Zhang，Y.，Wang，Z. and Cui，Y.（2018）。金碳点用于癌症来源的外泌体细胞内成像。纳米技术29（ 17）：175701。
Kamerkar，S.，LeBleu，VS，Sugimoto，H.，Yang，S.，Ruivo，CF，Melo，SA，Lee，JJ和Kalluri，R.（2017）。外泌体促进胰腺癌中致癌性KRAS的治疗靶向。自然546（7659）：498-503。
Lai CP，Kim，EY，Badr，CE，Weissleder，R.，Mempel，TR，Tannous，BA和Breakefield，XO（2015）。使用多重报告基因可视化和跟踪肿瘤细胞外囊泡的递送和RNA翻译.Nat Commun 6 ：7029。
DM的Pegtel，K.Cosmopoulos，DA的Thorley-Lawson，MA的van Eijndhoven，Hopmans，ES，Lindenberg的JL，de Gruijl的TD，Wurdinger的T.和Middeldorp的JM（2010）。病毒miRNA的功能性递送。经由外来体。国家科学院院刊USA 107（14）：6328-6333。
Perets，N.，Betzer，O.，Shapira，R.，Brenstein，S.，Angel，A.，Sadan，T.，Ashery，U.，Popovtzer，R. and Offen，D.（2019）。金黄外泌体。选择性地针对神经退行性疾病和神经发育障碍的脑部病理。Nano Lett 19（6）：3422-3431。
Shen，L.-M.，Quan，L.和Liu，J.（2018）。在体外和体内追踪外泌体以阐明其生理功能：对诊断和治疗纳米载体的意义.ACS Applied Nano Materials 1（6）： 2438-2448。
Suetsugu，A.，Honma，K.，Saji，S.，Moriwaki，H.，Ochiya，T.和Hoffman，RM（2013）。在原位裸鼠模型中，从乳腺细胞转移到间质转移部位的基质进行成像。。先进药物Deliv版本65（3）：383-390。
Valadi，H.，埃克斯托姆，K.，Bossios，A.，Sjostrand，M.，李，JJ和Lotvall，JO（2007）的mRNA和微小RNA的.Exosome介导的转移是细胞之间的遗传交换的新机制。纳特Cell Biol 9（6）：654-659。
van Niel，G.，D'Angelo，G.和Raposo，G.（2018）。揭示细胞外囊泡的细胞生物学。Nat Rev Mol Cell Biol 19（4）：213-228。
杨Y，沉国光，王虹，李海，张天，陶涛，丁新，于宇（2018）。干涉等离子成像和单信号检测。。外来体国家科学院院刊USA 115（41）：10275-10280。
Yong，T.，Zhang，X.，Bie，N.，Zhang，H.，Zhang，X.，Li，F.，Hakeem，A.，Hu，J.，Gan，L.，Santos，HA and Yang ，X.（2019）。肿瘤基于外泌体的纳米颗粒是化疗的有效药物载体。Nat Commun 10（1）：3838。