材料和试剂

细胞系
HEK-293T野生型细胞（ATCC ，目录号：CRL-3216）
HEK-293T TARDBP敲除细胞（根据要求提供）

细胞培养
1.5毫升微管（Eppendorf，目录号：022363204）
60 µm权杖吸头用于细胞计数（Milipore -Sigma，目录号：PHCC60050）
10 cm组织培养板，用于繁殖细胞系（Thermo Scientific，目录号：12-556-002）
用于剪接测定的6孔组织培养板（Thermo Scientific，目录号：14-832-11）
70 µm细胞过滤器（Corning ，Falcon，目录号：08-771-2）
5 ml圆底聚苯乙烯管（Corning ，Falcon，目录号：14-959-1A）
SH800S流式细胞仪设置磁珠（Sony Biotechnology，目录号：LE-B3001）
HyClone DMEM高葡萄糖（GE Healthcare，目录号：SH30081FS）补充：
10％FBS（亚特兰大生物公司，目录号：S11150H）
1 mM丙酮酸钠（Gibco ，目录号：11-360-070 ）。
2 mM L-谷氨酰胺（Gemini Biosciences，目录号：400106）
1个MEM非必需氨基酸（Gibco，目录号：11-140-076）
40 U / ml青霉素和40 µg / ml链霉素（Gemini Biosciences，目录号：400109）
pH 7.4的无菌1x PBS （Sigma-Aldrich，目录号：P3813-5x10PAK）
胰蛋白酶-EDTA（Gemini Biosciences，目录号：400150）
X-tremeGENE9转染试剂（罗氏（Roche），目录号：06365787001）
OptiMEM （Gibco ，目录号：31985-070 ）。

质粒（除非另有说明，请访问https://www.addgene.org/Rajat_Rohatgi/）
仅剪接报告基因：pHBS1389 IBB-GFP-mCherry3E（Addgene ，目录号：118803）
阳性对照：pHBS1503 [IBB-GFP-mCherry3E]-[BFP-TDP43 WT]（Addgene ，目录号：133327）
阴性对照：pHBS1501 [IBB-GFP-mCherry3E]-[BFP-TDP43 ∆RRM]（Addgene ，目录号：133325）
收集TDP43广泛的CTD突变体的接续记者（例如，Addgene公司，目录号小号：133328- 133333）
将CTD突变体亚克隆到剪接报告基因的骨架：pHBS1224 [IBB-GFP-mCherry3E]-[BFP-TDP 43 ∆CTD EcoRV ]（可根据要求提供）
探头补偿：哺乳动物表达载体和BFP，GFP和mCherry的插件（例如，Addgene公司，目录号：54 665，54759和54563）
配套设备

单通道移液器（Rainin 或类似产品）
细胞培养培养箱（Thermo Scientific或同等产品）
权杖细胞计数器（Milipore -Sigma）或等效的手动/自动细胞计数器
Sony SH800S细胞分选仪（Sony Biotechnology）或等效的细胞分选仪，配备405 nm，488 nm和561 nm激光器以及适当的滤光片
用于数据分析的计算机（例如，具有16 GB RAM的3.1 GHz Intel i7处理器）

软体类

SH800S用于数据收集的操作软件（Sony Biotechnology）或用于等效流式细胞仪的操作软件
Mathematica版本11.3或更高版本（Wolfram Research）+定制数据分析管道：
脚本' CSA_Gating.nb '（可从https://github.com/RohatgiLab/TDP43-analysis获得）。
脚本' CSA_Plotting.nb '（在https://github.com/RohatgiLab/TDP43-analysis上提供）。

程序

细胞接种
注意：在组织培养罩中工作以防止污染，将所有HEK-293T野生型和TARDBP敲除细胞培养在DMEM高葡萄糖加补充剂中（请参见材料）。

通过胰蛋白酶消化收获HEK-293T野生型和TARDBP敲除细胞，并使用Scepter（或等效的手动/自动细胞计数器）确定细胞数。
为了设置和校准流式细胞仪，将标准六孔组织培养板的四个孔分别接种400,000个HEK-293T野生型细胞（补偿样品）。
对于阳性和阴性对照，在标准六孔组织培养板的另外四孔中分别接种400,000个HEK-293T TARDBP敲除细胞（对照样品）。
对于每个要测试的TDP43变体，在标准六孔组织培养板的两个孔中分别接种400,000个HEK-293T TARDBP敲除细胞（实验样品）。
让细胞在细胞培养箱中于37°C和5％CO 2 下粘附过夜。

细胞转染
常规工作流程：在组织培养罩中工作以防止污染。每次转染时，小心地将3 µl X-tremeGENE9转染添加到250 µl OptiMEM中，而不接触微管壁，并在室温下孵育20分钟。每次转染，混合1将微克报告质粒与250微升OptiMEM 置于另一个微管中。孵育后，合并反应并小心地将混合物分散在指定孔中的细胞中。

要制备补偿样品，请用1 µg BFP，GFP或mCherry哺乳动物表达构建体转染一孔HEK-293T细胞。请注意，有意将一孔保持未转染状态。
要制备对照样品，请用pHBS1501或pHBS1503分别用1 µg 转染HEK-293T TARDBP敲除细胞的两个孔。
为了制备实验样品，将两个孔的HEK-293T TARDBP敲除细胞分别用1 µg所需的构建体转染。可在剪接报告子背景中获得TDP43 CTD突变体的参考收藏，网址为https://www.addgene.org。 / Rajat_Rohatgi /。
将所有样品在细胞培养箱中于37°C和5％CO 2 下孵育24小时。

流式细胞仪的设置和校准
注意：以下仅给出了SH800S设置和校准过程的基本概述。有关其他问题和故障排除，请查阅手册或联系技术服务。

在启动流式细胞仪之前，请检查鞘液和ddH 2 O的水平（如有必要，请补充）并排空废物。
确保将鞘液容器和管路密封，然后打开压缩机。
打开SH800S流式细胞仪并启动操作软件。
在芯片加载和流体检查步骤中，按照提示进行操作。我们使用100 µm芯片分析HEK-293T细胞。在出现提示时，选择405 nm，488 nm和561 nm激光器。
在芯片对准步骤中按照提示进行操作。由于分析仪模式已足够，因此无需进行校准。
在设置过程中，通过胰蛋白酶消化收获四个补偿样品。确保将样品量保持在较低水平，以防止细胞悬浮液不必要的稀释（我们通常每孔使用250μl胰蛋白酶，并通过添加250μl完整DMEM淬灭）。将细胞滤网放入5毫升的圆底聚苯乙烯试管中，将试管放在冰上直至进一步使用。
设置完成后，在操作软件中创建一个新实验。在``测量设置''窗格中，仅选择FSC（正向散射），BSC（侧向散射），FL1（BFP），FL2（GFP）和FL3（mCherry）通道出现提示时，启动补偿向导并按照步骤进行操作。此时将需要补偿样品。
补偿步骤完成后，设置完成，可以准备剩余的样品。

通过流式细胞仪制备和分析样品
收获控制和实验样品通过胰蛋白酶消化所描述的我Ñ步骤C 6，过滤器的每个样品通过细胞过滤网分为A 5毫升的圆底聚苯乙烯试管，保持样品在冰上直至进一步使用。
首先分析控制样本以设置门并了解预期效果的大小。
在BSC-A对FSC-A密度图中，请确保补偿期间设置的细胞群门仍然适用（门1 ；图2A）。
在Gate 1中，创建FSC-H与FSC-A密度图，以进一步为单个细胞进行浇口（Gate 2 ;图2B）。此过滤器利用了与单个细胞相比的细胞团的面积和高度之间的比例失调（Hazen 等人，2018）。
在Gate 2中，创建FL1-A（BFP），FL2-A（GFP）和FL3-A（mCherry）直方图.BFP信号与总TDP43量成正比.GFP信号与总剪接报告基因水平成比例，反映mCherry信号反映TDP43的剪接活性。
要预览TDP43的剪接效率，请在FL1-A直方图中首先对BFP阳性细胞进行门控（3号门;图2C）。此步骤仅选择成功转染的细胞。转染效率（即BFP的分数） -阳性细胞）应大于或等于50％，然后在3号门中创建FL2-A（GFP）与FL3-A（mCherry）密度图。阳性对照和阴性对照的位置应存在显着差异注意：这些门仅用于数据预览，而不能用于最终数据分析（图2D）。
在3号门中为每个对照和实验样品至少收集50,000个事件。确保单击``记录''按钮以确保在数据收集过程中保存了数据。作为参考，我们建议对上述指定图进行截屏对于数据采集后的每个样本，不幸的是，这必须针对每个样本手动完成，右键单击工作表区域以调出快速访问菜单，然后选择“复制工作表图片”，将图片粘贴到一个简单的图像处理器中，例如作为Microsoft Paint并保存。
分析完所有样本后，通过在“活动实验”面板中右键单击实验，将数据导出为fcs文件。
按照关闭向导的指示关闭流式细胞仪和软件，可以在“细胞计数仪”选项卡中找到。
仪器关闭后，请关闭压缩机并释放鞘管中的压力。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1903009--1363 Hermann Schmidt 837314 \图jpg \图2 .jpg

图2数据采集过程中的示例数据和门控策略A.BSC -A与FSC-A密度图显示所有检测到的事件以及为细胞选择的门1 B.FSC-H与FSC-A密度图和门2 选择单个细胞.C.FL1- A（BFP）直方图和Gate 3 选择转染的细胞.D.FL3-A（mCherry）vs.FL2-A（GFP）密度图用于全长野生类型（WT）的TDP43和TDP43缺少其RNA结合域（∆RRM）。

资料分析

注意：下面概述的数据分析管道使用专门为分析Sony SH800软件生成的fcs文件而编写的Mathematica脚本，并且如果不调整代码，可能无法立即与其他计算机的fcs文件兼容。

为了分析剪接数据，将每个细胞的mCherry信号归一化为同一细胞的GFP信号以量化剪接效率（图3A）。为了进一步归一化至该细胞的TDP43水平，相对于BFP信号。我们已经开发了Mathematica脚本（可从https://github.com/RohatgiLab/TDP43-analysis获取），该脚本可从标准fcs文件中提取每个观测值的原始测量值，对细胞进行门控并计算剪接率（脚本' CSA_Gating.nb ），以及绘制数据（“ CSA_Plotting.nb ”）。

首先在Mathematica中打开' CSA_Gating.nb '脚本，在' Step 0'下指定分析门（图3B）。尝试使用预定义的值或参考参考屏幕截图以设置适当的边界条件。通过评估单元格，在``步骤1''中指定数据文件在硬盘驱动器上的位置。为参数`` RandomFile ''将文件路径分配给包含实验中fcs文件的文件夹中的随机文件（图3C）。评估单元格以确认; 将返回所有找到的fcs文件的列表。最后，评估名为'Step 2'的单元格。在此分析循环中，将加载，门控和分析数据（图3C）3D）。对于每个样本，将导出分析摘要以及带有原始数值的csv文件。

为了进一步分析和绘制数据，请在Mathematica中打开' CSA_Plotting.nb '脚本，首先将上述分析的csv文件的文件路径归因于参数' RandomFile '（图3E），并评估单元格以要确认，然后评估下一个单元格以重新格式化数据以进行进一步分析。要绘制以mCherry与GFP信号之比表示的TDP43 拼接效率与总细胞TDP43浓度（BFP信号）的关系，请评估该单元格要更改图的轴，请更新“ yScale ”，“ xStart ”和“ xEnd ”参数（图3F），然后重新评估单元格。此步骤将为每个图生成两个单独的图自动渲染和保存的样本（请参见图3G中的示例）。脚本中的最后两个单元允许在参数“开始”和“结束”定义的TDP43级别范围内比较TDP43的拼接效率，从而产生小提琴图（图3G）。要手动重新排列原点在图中的r个样本中，在称为“ OrderedData ” 的列表中指定所需的样本顺序并评估单元格（图3H）。

D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1903009--1363 Hermann Schmidt 837314 \图jpg \图3 .jpg

图3.剪接分析数据的分析和绘图A.分析管线的概述流式细胞仪用于测量和解聚群体中单个细胞的mCherry，GFP和BFP荧光信号。使用自定义脚本，剪接效率为通过将给定细胞的mCherry与GFP信号之比（图1）与同一个细胞的TDP43水平（BFP信号）进行比较来计算得出.B。屏幕截图突出显示了在其中更改门边界和截止点的位置“ CSA_Gating.Nb ”脚本。C.截图，它指示了提供文件路径FCS原始数据中的“ CSA_Gating.Nb ”脚本。D.实例密度生成的评估中的“情节期间CSA_Gating.Nb ”脚本形象化E. 屏幕截图显示了在CSA_Plotting.nb 脚本中的位置，以提供在评估CSA_Gating.nb 脚本期间生成的csv文件的路径。F .屏幕截图突出显示了在何处调整绘图比例小号在“ CSA_Plotting.Nb ”脚本。G中密度图生成由“ CSA_Plotting.Nb ”脚本描绘剪接效率与水平TDP43 野生型（WT）和DerutaRRM TDP43变体（顶部）和实例小提琴突出显示已定义的BFP信号范围内的拼接效率的曲线图（底部）H 。“ CSA_Plotting.nb ”脚本的屏幕截图，指示在何处定义用于比较拼接效率的小提琴图的BFP信号范围。

致谢

这项工作得到了Deutsche Forsc Hungsgemeinschaft （SCHM 3082/2-1 到HBS）和国立卫生研究院（DP2 GM105448和R35 GM118082到RR）的支持。原始协议发表在Schmidt 等人（2019）中。

竞争利益

作者宣称没有利益冲突。

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