材料和试剂

P ipette提示0.1-20微升（VWR，目录号：613-1067）
移液器吸头1-200 µl（Carl Roth，目录号：7058）
移液管头100-1 ，200微升（Ratiolab ，目录号：2400610）
0.22 µm注射器过滤器（GE Healthcare，Whatman，目录号：10462200）
1 ml和5 ml注射器（Terumo，目录号：SS + 01T1和SS * 05LE1）
1.5 ml反应管（Sarstedt ，目录号：72.690.001）
15毫升和50ml锥形管（格雷纳乙IO- ø NE，产品目录号：188271和227261）
3.5 ml FACS管（Sarstedt ，目录号：55.484）
HiLoad Superdex 200 pg 色谱柱（GE Healthcare，目录号：28989335），在4°C下储存
Jurkat GFP-PIF S -TCR细胞（Yousefi et al。，2019）
链霉亲和素，与DyLight650偶联（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：84547），储存在4°C下；米olecular重量约为53 kDa的
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，货号D8537），储存在4°C
三（2-羧乙基）膦（TCEP）盐酸盐（Carl Roth，目录号：HN95），在4°C下储存
NaN 3 （Carl Roth，目录号：K305），在室温下保存
Indo-1（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：I1223），存储在4°C下
Pluronic F-127（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：P3000MP），在室温下存储
罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）介质（美国生物制药，目录号：R9002），在室温下存储粉末，在4°C下存储溶解介质
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号F7524），在4°C下储存
4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）（Thermo Fisher，目录号：15630-080），在4°C下储存
纯化PHYB-shRNA表达克隆单体（霍纳等人，2020 ，储存在-80℃下; 米olecular 重量约为74 kDa的
NaOH颗粒（Merck，目录号：1064981000）
10％NaN 3 （请参阅食谱）
5 M NaOH（请参阅食谱）
0.5 M TCEP（请参阅食谱）
蛋白质缓冲液（请参阅食谱）
FACS缓冲区（请参阅配方）
刺激介质（请参见食谱）

设备

小管（埃彭多夫（Eppendorf），目录号：3123000900）
ÄKTAexplorer 10S （GE医疗集团，ÄKTAexplorer 10S ）
MACSQuant X流式细胞仪，使用20 mW 355 nm激光和405/20 nm以及530/30 nm发射带通滤光片（Miltenyi Biotec ）定制
5810 R离心机（Eppendorf）
孵化器HeraCell 150i （Thermo Fisher）
无菌罩Safe 2020（Thermo Fisher）
配备660 nm和740 nm LED的pxONE （Opto Biolabs ）
绿色安全灯：Deco flex RGB LED灯带，设置为绿色灯（欧司朗，目录号：76123）

软件

独角兽5.11（GE Healthcare）
的FlowJo 9（树星公司。）
棱镜6（格拉夫派得软件公司。）
插画CC（的Adobe公司。）

程序

植物色素B四聚体（PhyBt ）的生产
按照Hörner 等人的方法纯化生物素化的植物色素B（PhyB-AviTag ）单体。，2020年。
在蛋白质缓冲液中混合10倍摩尔过量的PhyB-AviTag 单体（浓度为1-5 mg / ml）与DyLight650偶联的抗生蛋白链菌素，将其总体积为2.5 ml，并在室温下孵育2 h或在4 下孵育过夜°C 和黑暗中。
使用ÄKTAexplorer10S 色谱系统上的HiLoad Superdex 200 pg 色谱柱，通过尺寸排阻色谱，从过量的PhyB-AviTag 单体中分离出PhyB 四聚体（PhyBt ）。
P erform在4℃下在冷室中的所有步骤，并尽量减少蛋白暴露于光。使用1 ml / min的流速。
用两倍柱体积的新鲜制备的蛋白质缓冲液平衡柱。
使用2 ml样品定量环将蛋白质混合物上样到色谱柱上，并运行两个色谱柱体积，同时收集1 ml馏分。
可以通过280 nm（A 280 ）的吸光度监测蛋白质洗脱，通过650 nm（A 650 ）的吸光度监测PhyB 和DyLight650共轭链霉亲和素，通过365 nm（A 365 ）的吸光度监测PhyB 单体和四聚体。有关纯化运行的示例，请参见图2。
池中的所有PhyBt 含级分，并确定PhyBt 由浓度ΔΔ 的方法：
按照Hörner 等人对PhyB-AviTag 单体所述，对纯化的PhyBt 进行光谱分析。，程序2020中的3。
通过从差分光谱的649 nm处的最大值减去711 nm处的最小值来计算ΔΔA 值。
将ΔΔA 值乘以1.1得到以mg / ml 为单位的PhyB 浓度。所述因子1.1 是从确定ΔΔ 的测量PHYB-shRNA表达克隆通过Bradford测定相关蛋白浓度测量的单体。
划分PHYB 通过的分子量以mg / ml的浓度PHYB-shRNA表达克隆74,000克/ 摩尔，以获得PHYB-shRNA表达克隆以M浓度（mol / 大号）。
划分的PHYB-shRNA表达克隆通过4单体浓度，以获得PhyBt 在M.浓度
使用0.22 µm注射器过滤器过滤等分的PhyBt 溶液。无菌等分试样可在4°C 和黑暗中最多保存4周。
该方案通常以0.5到3 µM的浓度产生80-90％的DyDY650偶联的抗生蛋白链菌素PhyBt 。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902676--1297 Wolfgang Schamel 784708 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

图2 。通过尺寸排阻色谱法从PhyB 单体中纯化PhyB 四聚体（PhyBt ）。PHYB 势必DyLight650共轭的链亲和素是从过量的分离PHYB 单体上的的HiLoad 的Superdex 200 皮克柱。在280nm处监测总蛋白吸光度，在365nm处检测PhyB 的吸光度，并在650nm处跟踪PhyB 和DyLight650 的组合吸光度。结果显示n > 3的一项实验。

光依赖性PhyBt 与T细胞表面的GF P-PIF S - TCR 结合
根据标准Jurkat 细胞培养条件培养Jurkat GFP-PIF S -TCR细胞（参见例如Yousefi 等人，2019 ）。实验前，细胞的密度应保持在每毫升0.5至100万个细胞之间。
将每个样品的3 x 10 5 Jurkat GFP-PIF S -TCR细胞转移到FACS管中。
在4°C下以300 xg 离心样品4分钟。
在冰上（或在4°C的房间里甚至更好）用冷缓冲液执行以下步骤。
通过抽吸或倾析丢弃上清液，并将细胞重悬于1 ml FACS缓冲液中。
重复上述离心和上清液去除步骤。
在离心步骤中，在FACS缓冲液中将PhyBt 稀释至终浓度100 nM 。稀释的PhyBt 溶液的总体积取决于样品数量，每个样品需要50 µl。
将PhyBt 溶液分成两部分，用饱和量的6 60 nm光照射一半，得到PhyBt （660），而用饱和量的7 40 nm光照射另一半，得到PhyBt （740）。以100 µmol / m 2 s 的光照5分钟就足够了。
应在绿色安全光下执行以下处理步骤，以防止PhyB 光转换。防止任何白光（阳光或室内光）照射样品至关重要。
将细胞样品重悬于50 µl PhyBt （660）或PhyBt （740）中，并在冰上和黑暗中孵育30分钟。
按照步骤B3-B5 所述将样品洗涤两次。
将细胞重悬于200 µl FACS缓冲液中，并在流式细胞仪中测量PhyBt （DyLight650 ）荧光。代表性的结果见图3。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902676--1297 Wolfgang Schamel 784708 \ Figs jpg \ Fig3.jpg

图3 。PhyBt与T细胞表面GFP-PIF S -TCR 结合的测量。一。用PBS（灰色），PhyBt （740）（红色）或PhyBt （660）（橙色）处理Jurkat GFP-PIF S -TCR细胞，并通过流式细胞仪通过DyLight650 荧光测量PhyBt的表面结合。结果显示了一个n > 3（au 。，任意单位）的实验。乙。如在（A）中所测量的，对中值荧光强度（MFI，蓝色）和与PhyBt 结合的细胞的百分比（绿色）进行定量。只有PhyBt （660）表现出与T细胞的显着结合。结果描述了n > 3 中一个实验重复测量的平均值±SD 。

通过光依赖的PhyBt 结合，通过Ca 2+内流激活T细胞的分析
将5 x 10 6 新鲜分裂的Jurkat GFP-PIF S -TCR细胞转移到15 ml锥形管中。
在室温下以300 xg 离心细胞4分钟。
吸除上清液，将细胞重悬于1 ml刺激培养基中。
细胞应通过轻轻移液重悬，切勿涡旋重悬，因为这可能已导致细胞活化并损害Ca 2+内流测量。
重复上述离心和去除上清液的操作。
通过将5 µl Pluronic F-127与4 µl Indo-1和1 ml刺激培养基混合，在离心步骤中准备Indo-1染色溶液。
将细胞重悬于1 ml染色溶液中，将细胞悬液转移至1.5 ml反应管中，并在细胞培养箱中孵育15分钟，保持盖子打开。
孵育15分钟后，关闭反应管的盖子，将试管短暂颠倒5-10次，再将细胞孵育15分钟。
重复离心和除去上清液如步骤小号C2和C3和重悬细胞于500μl4℃寒冷刺激平台。
在开始测量之前，将细胞在冰上和黑暗中放置15分钟。
对于每次测量，将50 µl染色的细胞与950 µl 37°C预热的刺激培养基在FACS管中轻轻混合，以新鲜制备1 ml稀释的细胞悬液。
将FACS管转移到pxONE 孵育和照明设备中，然后将设备插入流式细胞仪中。可以在制造商的网站（www.optobiolabs.com）上找到有关pxONE 设备使用的详细信息，并提供了一段视频，其中提供了有关原型的逐步说明（Brenker 等，2016）。
测量1种分钟基线荧光，然后2和200之间添加纳米ö ˚F任PhyBt （660）或PhyBt （740），测量在暗处另外5分钟。图4描绘了这样一个实验的例子。
根据您的具体实验问题改变PhyBt 浓度和光照条件。可以在Yousefi et al 。，2019中找到针对各种实验问题的不同照明方式的示例。

D：\ Reformatting \ 2020-1-6 \ 1902676--1297 Wolfgang Schamel 784708 \ Figs jpg \ Fig4.jpg

图4 。用光配体-TCR系统在光依赖性刺激下测量钙的流入量。一。如图所示，在加入20 nM PhyBt （740）或PhyBt （660）后，通过Indo-1荧光测量流入Jurkat GFP-PIF S -TCR细胞的钙流入量。刺激是在黑暗中进行的，刺激的添加如箭头所示。结果显示了一个n > 3的实验。B 。如数据分析部分所述，从（A）中定量反应细胞的百分比。结果显示，n > 3的一项实验。与PhyBt （740）处理的细胞相比，用PhyBt （660）处理的T细胞显示钙流入在250 s左右达到峰值。

数据分析

Unicorn软件套件用于控制Äkta 色谱系统并分析所得数据。FlowJo 用于分析所有流式细胞仪数据。所描述的流式细胞术结果仅使用活细胞群体。通过结合Ca 2+的Indo-1（405/20 nm滤光片）和不含Ca 2+的Indo-1（530/30 nm滤光片）的比例对细胞内钙进行定量。在图4A所示的应答细胞的百分比是从衍生的FlowJo的由模块使用90动力学个百分30米60秒之间的基线测量。对于图2、3B和4B，量化数据分别从Unicorn和FlowJo 导出，并使用Prism显示。图3A和4A是直接从FlowJo 导出的。所有图都是使用Illustrator编译的。

笔记

通过用铝箔覆盖PhyB 或调暗房间（如果可能），保护PhyB 免受强光照射，例如白光或直射阳光。每当不应该改变PhyB 的构象时，请在绿色安全光下工作，该光应处于PhyB的最低吸光度。白色房间的光线或阳光具有与660 nm照明相似的效果，并将PhyB 转换为ON 状态。
PHYB 是对氧化敏感，因此应保持在由例如脱气溶液和加入0.5还原缓冲毫TCEP，β - 巯基乙醇或二硫苏糖醇。每当实验条件禁止使用的还原剂，期望和监控的下降博士YB 以PIF在几个小时的过程中结合活性。
如Yousefi 等（美国国家科学院，2003年）中所述，连续660 nm的光照可阻止PhyBt 与GFP-PIF S -TCR结合。（2019）。因此，我们可以使用低660 nm的光强度，也可以使用介于两者之间的暗周期的脉冲照明。强度增加的660 nm光照射导致PhyBt 与GFP-PIF S -TCR的结合半衰期缩短。
由于PhyB 的光生物学特性，我们660 nm光源的饱和照明导致80％的分子处于PhyB ON状态，而20％的分子处于PhyB OFF状态。饱和照明与我们的740nm的光源，得到1％PHYB ON和99％PHYB OFF。具有变化的发射光谱的不同光源将导致不同的PhyB ON：OFF比率，有关详细信息，请参见Smith 等。（2016）。

菜谱

10％NaN 3
将NaN 3 溶于水
室温保存
5 M氢氧化钠
通过将NaOH颗粒缓慢加入水中将其溶解在水中（放热反应）
室温保存
TCEP 50万
将TCEP溶于脱气水中
用5 M NaOH将pH调节至7.4
在-20°C下以1 ml等分试样储存
蛋白质缓冲液
PBS
从0.5 M的储备溶液中添加0.5 mM TCEP
通过0.22 µm过滤器并脱气
不要储存蛋白质缓冲液，但要始终准备新鲜
FACS缓冲区
PBS
1％FBS
0.02％NaN 3 （从10％的库存中稀释）
储存在4°C
刺激培养基
RPMI
1％FBS
10毫米HEPES
储存在4°C

致谢

我们感谢Signalhaus 机器人设施的Susan Lauw 和Johannes Kaiser 运行机器人平台（INST 39 / 899-1 FUGG）进行钙实验，并感谢Opto Biolabs 为其定制的照明设备。这项工作是由德国资助研究联合会（DFG）在德国的卓越战略，通过EXC294（的BIOS - 中心生物登陆阿灵学），EXC2189（CIBSS- 中心综合生物信号研究，项目编号390939984），SFB854（B19），SCHA976 / 7-1，SCHA976 / 8-1和Project-ID 403222702- SFB 1381（A9）。该协议文件中详细描述的过程来自eLife （Yousefi et al。，2019）中的文章。

利益争夺

Opto Biolabs 为我们提供了pxONE 设备。

参考文献

Andersen，PS，Geisler，C.，Buus，S。，Mariuzza，RA和Karjalainen，K。（2001）。T细胞受体配体亲和力在细菌超抗原激活T细胞中的作用。生物化学杂志276（36）：33452-33457。
Baaske，J.，Mühlhäuser，WWD，Yousefi，OS，Zanner，S.，Radziwill，G.，Hörner，M.，Schamel，WWA和Weber，W.（2019）。整合素-基质相互作用的光遗传学控制。COMMUN 生物学2：15。
鲍尔（PA），丁（J.），帕特（Patel），E。，索劳斯（N.），霍顿（H.），乔治（Jierut ），斯卡夫（Scarfo），I。，乔杜里（R.），基纳（Kiner），O。，B.，Morath，A.，Baldeviano ，GC，Quinn，J.，Tavares，P.，Wei，Q.，Weiler ，S.，Maus，MV，Getts ，D.，Schamel ，WW和Hofmeister，R. （2019）。合成的TRuC受体与完整的T细胞受体结合，可产生有效的抗肿瘤反应。Nat Commun 10（1）：2087。
Brenker ，K.，Osthof ，K.，Yang，J. and Reth ，M.（2016年）。LED热流-将光遗传学与流式细胞术相结合。J Vis Exp （118）。土井：10.3791 / 54707。
更正件，M.，Slanetz ，AE，博伊德，LF，Jelonek ，MT，希利科，S.，AL-拉马迪，BK，金，YS，马赫，SE，博思韦尔，AL和格丽斯，DH（1994）。T细胞受体-MHC I类肽相互作用：亲和力，动力学和特异性。科学265（5174）：946-949。
Daniels，MA，Teixeiro ，E.，Gill，J.，Hausmann，B。，Roubaty ，D.，Holmberg，K.，Werlen ，G.Hollander ，GA，Gascoigne，NR和Palmer，E。（2006）。胸腺选择阈值由Ras / MAPK信号的区室化定义。自然444（7120）：724-729。
戴维斯，MM，博尼法斯，JJ，帝国，Z.，里昂，D.，Hampl ，J.，阿登，B。和简，Y。（1998）。αβT细胞受体对配体的识别。Annu 启免疫学16：523-544。
Goglia ，AG和Toettcher ，JE（2019）。光明的未来：光遗传学剖析细胞行为的时空控制。Curr Opin Chem Biol 48：106-113。
PD的Holler和DM的Kranz（2003）。TCR / pepMHC亲和力和CD8对T细胞活化的贡献的定量分析。免疫18（2）：255-264。
霍纳，M.，优素菲，OS，Schamel ，WWA和韦伯，W。（2020）。用于细胞外光遗传学的重组生物素化植物色素B的生产，纯化和表征。生物协议10（5 ）：e 3541 。
Kolar，K.和Weber，W.（2017年）。光学控制细胞信号传导的合成生物学方法。Curr Opin Biotechnol 47：112-119。
Levskaya ，A.，Weiner，OD，Lim，WA和Voigt，CA（2009年）。使用光开关蛋白相互作用的细胞信号时空控制。自然461（7266）：997-1001。
Lyons，DS，Lieberman，SA，Hampl ，J.，Boniface，JJ，Chien ，Y。，Berg，LJ和Davis，MM（1996）。与激动剂相比，TCR以较低的亲和力和更快的解离速率与拮抗剂配体结合。免疫5（1）：53-61。
Mancinelli ，AL（1994）。植物色素作用的生理学。植物的光形态发生。
Matsui，K.，Boniface，JJ，Reay，PA，Schild ，H.，Fazekas de St Groth ，B。和Davis，MM（1991）。肽-MHC复合物与T细胞受体的低亲和力相互作用。科学254（5039）：1788-1791。
Matsui，K.，Boniface，JJ，Steffner ，P.，Reay，PA和Davis，MM（1994）。T细胞受体结合肽/ I-Ek复合物的动力学：解离速率与T细胞反应性的相关性。PROC国家科科学院科学USA 91（26）：12862-12866。
McKeithan，TW（1995）。T细胞受体信号转导中的动力学校对。PROC国家科科学院科学USA 92（11）：5042-5046。
Minguet ，S.，斯瓦米，M.，Alarc ó N，B.，Luescher ，IF和Schamel ，WW（2007）。T细胞受体的完全激活需要在CD3处聚集和构象变化。免疫26（1）：43-54。
Schamel ，WW，Alarc ó N，B。和Minguet ，S。（2019）。TCR是一种变构调控的大分子机械，在工作时会改变其构象。免疫修订291（1）：8-25。
Smith，RW，Helwig ，B.，Westphal，AH，Pel ，E.，Horner，M.，Beyer，HM，Samodelov ，SL，Weber，W.，Zurbriggen，MD，Borst，JW and Fleck，C.（2016年））。发掘感光体构象异构体之间的转变速率。BMC Syst Biol 10（1）：110。
Spear，TT，Evavold ，BD，Baker，BM和Nishimura，MI（2019）。了解TCR亲和力，抗原特异性和交叉反应性，以改善用于癌症免疫治疗的TCR基因修饰的T细胞。癌症免疫免疫其他。
斯瓦米，M.，Beck- 加西亚í 一个，K.，Beck- 加西亚í 一个，E.，Hartl的，FA，Morath，A.，优素菲，OS，Dopfer ，EP，莫尔纳，E.，舒尔茨，AK，兰科，R.，Borroto ，A.，马丁-Blanco的，N.，Alarcon的，B.，Hofer的，T.，Minguet ，S。和Schamel ，WW（2016）。基于胆固醇的T细胞受体磷酸化的变构模型。免疫力44（5）：1091-1101。
Sykulev ，Y.，Brunmark ，A.，Jackson，M.，Cohen，RJ，Peterson，PA和Eisen，HN（1994）。抗原特异性T细胞受体与肽-MHC复合物之间反应的动力学和亲和力。免疫力1（1）：15-22。
Tan，国会议员，Dolton，总经理，Gerry，AB，Brewer，JE，Bennett，AD，Pumphrey，NJ，Jakobsen，BK和Sewell，AK（2017）。与CD8 + T细胞相比，人白细胞抗原I类重定向的抗肿瘤CD4 + T细胞需要更高的T细胞受体结合亲和力才能获得最佳活性。临床实验免疫学187（1）：124-137。
Toettcher ，JE，Weiner，OD和Lim，WA（2013）。使用光遗传学来询问Ras / Erk模块对信号传输的动态控制。细胞155（6）：1422-1434。
Weber，S.，Traunecker ，A.，Oliveri ，F.，Gerhard，W。和Karjalainen ，K。（1992）。可溶性T细胞受体对主要组织相容性复合物加肽的特异性低亲和力识别。自然356（6372）：793-796。
优素菲，OS，冈瑟，M.，H ö rner ，M.，Chalupsky ，J.，弗兰克韦斯，M.，布兰德，SM，史密斯，RW，斑点，C.，昆克，T.，Zurbriggen，MD，Hofer的， T.，Weber，W. and Schamel ，WW（2019）。光遗传学控制表明动力学校对调节T细胞受体的活性。Elife 8：e42475 。