材料和试剂

动物
出生后第0-2天（P0-P2）的Wistar品系幼崽，并根据机构道德准则进行饲养和维护

文化产品
1. 0.22μm膜滤器（Millipore，目录号： GSWP04700）

2. T-25 ml组织培养瓶（Corning，Sigma ，目录号：CLS430639）

3. 24 - 孔板（赛默飞世尔科技，产品目录号：142475）

4. 13毫米圆形盖玻片（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-519-21G）

5. DNase-1 （Sigma-Aldrich，目录号：11 284 932 00）

6. Hanks的平衡盐溶液（HCMF ，Thermo Fisher Scientific，目录号：14170112）

7. 聚-L-赖氨酸氢溴酸盐（PLL ，Sigma-Aldrich，目录号：P5899-5G）

8. Dulbecco改良的Eagle培养基/ F-12（DMEM / F-12）（GIBCO，美国Invitrogen ，目录号：12500062）

9. L-谷氨酰胺，200 mM溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）

10. 胎牛血清热灭活（FBS-HI）（GIBCO，美国Invitrogen ，商品目录号：10082147）

11. 0.25％胰蛋白酶-EDTA（GIBCO，美国，Invitrogen，目录号：25200）

12. 青霉素链霉素（笔/链球菌； 100x溶液；每个10,000单位/ ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）

13. HEPES（1 M）（赛默飞世尔科技公司，目录号：15630080）

14. MilliQ水

15. HCl （Sigma-Aldrich，目录号：7647-01-0）

16. 乙醇（西格玛奥德里奇，目录号：64-17-5）

17. HBSS

18. 葡萄糖粉

19. 氯化钠

20. 氯化钾

21. Na 2 HPO 4

22. KH 2 PO 4

23. PFA

24. 生长培养基（500毫升）（请参阅食谱）

25. 50毫升FBS-HI（10％v / v）（请参阅食谱）

26. 解剖培养基（500毫升）（请参阅食谱）

27. 解离介质（10毫升）（请参阅食谱）

28. DMEM-胰蛋白酶-EDTA（1：4）（10毫升）（请参阅食谱）

免疫染色
新鲜配制的0.1 M PBS
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
Anti-ChAT（兔多克隆Abcam，目录号：ab18736; 1：500）
抗GFAP（小鼠单克隆，Abcam，目录号：ab24345; 1：500）
抗IBA1（兔多克隆Abcam，目录号：ab1536961：500）
抗小鼠IgG（Cy3偶联; 1：200，Sigma-Aldrich）
抗兔IgG（FITC偶联; 1：200，Chemicon）
PVA-DABCO防褪色固定介质（Sigma-Aldrich，目录号：10981）
P BS 1x （pH-7.4）（请参阅食谱）
PFA，4％（请参阅食谱）

设备

细镊子，Dumont＃5（2），弯曲的（1）（Fine Science Tools）
剪刀（11/2），51/2 in。，直的，可操作的（Fine Science Tools）
剪刀（2个），4 英寸，直的，微解剖的（精细科学工具）
解剖显微镜（Leica Microsystems）
相衬显微镜（Leica Microsystems）
共焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems）
CO 2 培养箱（Eppendorf）
轨道振荡器（新不伦瑞克，埃彭多夫）
离心机（Thermo Scientific）
火抛光玻璃移液器（Fisherbrand）
光源
层流罩
4°C冰箱
-20°C冷冻室
-80°C冷冻室
血细胞计数器

软件

Photoshop CS2（Adobe）
微软办公软件

程序

盖玻片
w ^ 灰，干燥和steriliz Ë通过高压灭菌和/或乙醇处理（95％无水乙醇）之前涂覆的盖玻片。
将干燥的无菌盖玻片与PLL（0.1 mg / ml，在PBS中的终浓度）孵育30分钟，然后用PBS漂洗两次30 s，以防止与过量PLL相关的毒性。
使用前，让盖玻片完全干燥。我们建议使用新涂的盖玻片。或者，可以将预涂的盖玻片在4°C下最多保存3周。

DIS 新生儿脊髓节
准备冰- 冷解剖培养基（请参阅食谱）。
仔细麻醉幼崽。用70％的乙醇擦拭身体，并在手术刀的帮助下迅速断头。
在下背部切开切口，露出椎骨柱。与成年动物相比，新生大鼠的皮肤和椎骨组织很柔软，可以相对容易地解剖。
在弹簧剪刀和细镊子的帮助下，小心地将脊柱切开以暴露脊髓，从尾端到头端。轻轻但迅速地取下脊髓，然后将其放入冰中- 冷解剖介质。对于解剖过程的描述，我们建议先前由Gal 等人发表的方案。，（2016年）。
使用细镊子的尖端将脊髓的脊髓彻底分开，并最大程度地减少组织损伤。
在手术刀的帮助下，将组织切成小块，然后在层流气流罩（LAF）中进行研磨。

混合的胶质文化
将组织转移到每毫升1 ml的离解培养基中，在37°C下放置15分钟。胰蛋白酶有助于组织的解离，而DNase的添加则可通过消化从受损细胞释放的粘性DNA来辅助。
通过添加预热的生长培养基（补充有10％FBS-HI的DMEM / F-12）并以400 xg离心3分钟来终止反应。
用生长培养基代替上清液，并轻轻地通过1 ml火抛光的玻璃移液器8-10次以进行机械研磨。应注意避免气泡。
让未分离的组织沉淀下来，并将上清液转移到另一个小瓶中。添加新鲜的培养基，并重复机械研磨过程2次以上，直到组织解离为止。最佳剪切应力使组织以移去成一个单- 细胞悬浮液。但是，严酷的磨碎可能会由于细胞死亡而导致产量下降。
沉淀下来的单- 从而在400获得的细胞悬浮液XG 3分钟。
重悬于新鲜培养基中。
使用血细胞计数器和平板在T-25组织培养瓶中接种密度为2.5 x 10 4 细胞/ ml 的细胞进行计数。在无菌的细胞培养箱中于37°C，5％CO 2 和95％湿度下孵育。
注意：由于神经胶质细胞牢固粘附，因此在播种前无需用PLL覆盖烧瓶。根据我们的经验，在未包被的烧瓶中撒种可进一步确保富集。

每天更换介质3-4天，以确保正确清除残留的碎屑。然后，根据需要补充介质。由天体外（DIV）7，将培养开始达到汇合时，和由DIV 12，与fringent，相明亮的体细胞小胶质细胞的群体可以看出在星形胶质细胞的顶部生长（图URE 1）

图1 。从大鼠脊髓分离出的混合胶质细胞培养物。A和A'分别代表生长的（DIV 7）和融合的（DIV 12）文化。图B描绘了存在于星形胶质标记GFAP标记的细胞之上的不同的小胶质标记Iba-1 阳性细胞的存在。标有比例尺。

星形胶质文化
建立并允许混合文化达到融合（8-10 DIV）。每隔一天更换一次介质。在第11个DIV上，将培养瓶以200 rpm的速度放置在定轨振荡器上3-4 h，保持在37 °C 。吸出含有从星形胶质细胞顶部脱落的粘附较少的小神经胶质细胞的所得培养基。
可以将在此阶段获得的包含小胶质细胞的培养基进一步以400 xg离心3分钟，以沉淀小胶质细胞。可以将此小胶质细胞群体重悬于DMEM / F-12中，并以所需的接种密度接种在合适的培养皿中，以备将来实验。但是，必须小心避免脱落的非小胶质细胞，包括星形胶质细胞，因为它很容易导致交叉污染。此外，我们采用了另一种更有效的方法来培养小胶质细胞（Saura 等人，2003年），该方法可提供更高的产量并减少污染，如下所述。
用PBS彻底清洗完整的星形胶质层，然后在0.25％胰蛋白酶-EDTA中孵育1-2分钟，以确保细胞正确分离。
监视的单元的舍入和与停止胰蛋白酶消化的等量的生长培养基的分离完成时。
将细胞以400 xg 沉淀3分钟，然后重悬于新鲜的生长培养基中。Replate在2.5×10密度4 在24上的圆形盖玻片细胞/ ml - 孔板中并与实验（图进行URE 2）。

图2 。来自混合文化的丰富的星形胶质文化。A，A'，C，C'。培养物主要由扁平/原生质形态组成。B，D-E'。纤维形态在非刺激性培养物中偶见，但在具有炎症刺激的培养物中则常见。B，B ' 。一个ST rocytes进一步传代（20-25 DIV）没有表现出他们的生存能力和反应能力的显著变化。如Iba-1染色（FF“）和ChAT染色（GG”）所示，培养物对小胶质细胞呈阴性。标有比例尺。

小胶质细胞培养
如上所述，从Wistar大鼠幼崽中获得混合的神经胶质细胞培养物，然后使用温和的胰蛋白酶消化法进行小胶质细胞培养。
在培养物达到汇合后，允许培养成熟了几天，同时不断补充一个- 半媒体用新鲜培养基每隔一天。不要完全卸下旧媒体与胶质因素的限制，因为这些因素允许的小胶质细胞的最佳生长。
完整的星形胶质单层细胞成熟一段时间后，对神经胶质培养物进行温和的胰蛋白酶-EDTA处理。以每瓶1：4的比例添加4-6毫升的胰蛋白酶EDTA-DMEM / F-12，足以覆盖细胞。温和的胰蛋白酶消化步骤去除了星形胶质细胞单层，揭示了其下方生长的小胶质细胞层，而DMEM / F-12在整个过程中提供了营养。该过程通常需要10-15分钟。在相衬显微镜下定期检查单层的分离情况，并标准化时间以实现最佳分离。
一旦星形胶质细胞层完全脱离，丢弃含有星形胶质细胞层的培养基，并用DMEM / F-12彻底清洗培养皿，以去除痕量的非微胶质细胞。
检查培养物的纯度。然后，使用直接在圆形盖玻片的细胞，或replate在24 - 孔板中，或者作为每requiremen 实验T（图URE 3）。

图URE 3 。来自混合培养物的丰富的小胶质细胞培养物。A-A''，B-B''。健康的文化主要表现出处于未刺激状态的过程形态。然而，作为对外部刺激的小胶质细胞反应，可以观察到中间阶段（A'''，B'''）和反应性吞噬阶段（A''''，B''''）。培养物染色为星形胶质细胞污染（C-C''）。标有比例尺。

固定和免疫染色
用无菌PBS洗涤含有细胞的盖玻片，然后在室温下使用4％PFA固定15分钟。抽吸PFA并用PBS 彻底清洗后再进行免疫染色。
抗原回收步骤是可选的，应根据每种抗体的指南进行标准化。对于本研究中使用的抗体，既不需要也不进行抗原修复。
继续用3％BSA封闭1小时，然后在4°C与所需的一抗孵育过夜。初步孵育后，将盖玻片分别洗涤3次，每次5分钟，然后添加适当的荧光标记的二抗。在室温下孵育2小时后，将盖玻片用PBS洗涤三次，每次5分钟，然后将其安装在带有PVA-DABCO防褪色固定介质的干净载玻片上。幻灯片完全干燥后，请使用共聚焦显微镜进行成像。

数据分析

研究了混合胶质细胞培养物，以及使用这些方案获得的主要星形胶质和小胶质细胞培养物，并通过一系列测定比较了它们的纯度和个体反应。GFAP，Iba-1和DAPI染色显示星形胶质细胞和小胶质细胞培养物均富集> 98％（Mishra 等人，2017 和2016）。但是，该分析超出了该协议的范围，并且已经发布。因此，没有讨论数据分析。

笔记

补充来自wistar大鼠腓肠肌的肌肉提取物在步骤D7促进运动神经元的生长，并且如果需要在混合培养物中运动神经元的存活，则应该这样做（Shobha 等，2007）。
混合培养物可以通过胰蛋白酶消化进一步继代培养或分离星形胶质细胞和/或小胶质细胞，以进一步提高产量。在这种情况下，应在计划实验之前对文化进行标准化和特征化。此外，所有实验都必须在相同的传代状态下进行和重复，以避免引起任何因传代培养而产生的表型变异。
继代培养进一步确保了培养物的纯度。可将星形胶质细胞传代培养3-4次，而不会明显丧失特性。高密度电镀进一步消除了交叉污染。
在步骤F2中，至关重要的是使星形胶质单分子层成熟并保持完整。未成熟的层可能无法有效分离，从而导致小胶质细胞培养物的不正确分离和/或交叉污染。通常在培养物达到汇合后的5-7天，最好进行轻度的胰蛋白酶消化。
在我们的手中，步骤F3中使用的胰蛋白酶-EDTA-DMEM / F-12比例为1：4，可有效去除15-20 DIV培养的星形胶质单层。然而，取决于培养条件，该比例可以进一步增加至1：3至1：2，并且必须标准化。此外，EDTA 对于确保选择性去除星形胶质细胞，同时保持完整的小胶质细胞层至关重要。为了获得更多见解，我们建议阅读Saura 等人的文章。（2003），该协议首次被描述。
考虑到获得纯度，洗涤步骤在步骤F4是至关重要的，因为保留在培养皿中的星形胶质细胞可以有效地重新附着和增殖，从而导致星形胶质细胞污染。
如此获得的小胶质细胞可以在无血清的DMEM / F-12中繁殖过夜，并在第二天铺板用于实验。小胶质细胞可以在胶质/星形胶质混合条件培养基中生长更长的时间。如何以往，小胶质细胞是动态的，并很快在他们的环境丝毫的变化做出反应体外。因此，为了获得最佳，公正的结果，我们建议尽早使用这些文化。
在步骤F3中分离的星形胶质单分子膜可以进一步传代培养。但是，由于汇合的星形胶质层具有很高的营养需求，因此必须经常补充培养基以确保健康的亚培养。确定培养物健康状况的一种方法是监视层的分离，因为不健康或饥饿的星形胶质层会在有或没有轻度胰蛋白酶消化的情况下非常迅速地分离。我们建议标准化和检查继代培养的星形胶质细胞的完整性，然后再将其用于进一步的实验。在我们手中，第二传代培养产生可行的，星形胶质细胞原生质即积极响应炎症刺激（图小号1和B-B'）。此外，以高密度重新培养可确保健康和丰富的星形胶质细胞培养。与星形胶质细胞不同，小胶质细胞不能继代培养。

菜谱

Ñ OTE ：媒体准备工作应在层流罩下进行，以确保无菌。

培养基制备将
DMEM / F-12粉末培养基包装到800毫升高压灭菌的MilliQ中
0.11％HEPES 和碳酸氢钠，使用1 N HCl将pH设置为7.4

10 ml的1x抗生素混合物（100000 IU青霉素，0.05％链霉素和0.002％两性霉素B）

使最终体积最大至1 L，并使用0.22 µm的膜滤器在4°C下无菌过滤介质，直至进一步使用

生长培养基（500毫升）45 0 毫升DMEM / F-12 50毫升FBS-HI（10％v / v）过滤并储存在4°C

解剖培养基（500 ml）
487 ml 1x HBSS
5 ml 1 M HEPES（0.1 M溶液）3 g葡萄糖粉（6 mg / ml）5 ml Pen / Strep溶液（100 U / ml）过滤并储存在4°C

解离培养基（10 ml）
HBSS 10 ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA DNase 100μg/ ml

DMEM-胰蛋白酶-EDTA（1：4）（10 ml）将
2 ml的2.5％胰蛋白酶EDTA溶于8 ml DMEM / F-12，新鲜制备
PBS 1 x ，（pH-7.4）
NaCl 8 g （0.137 M）KCl 200 mg （0.0027 M）Na 2 HPO 4 1.44 g（0.01 M）KH 2 PO 4 240 mg （0.0018 M）补足1 L用MilliQ水调节pH

PFA 4％（50毫升）
20毫升双蒸馏水中2毫克PFA
调节pH至7.4
用水和25 ml 2x PBS稀释50 ml

致谢

在DBT和ICMR（政府）的资助下，对这些协议进行了标准化。印度。PM是政府在UGC / CSIR奖学金计划下的初级/高级研究员。印度。该协议用于Mishra 等人发表的两项独立研究中。（201 6和201 7 ）。作者还要感谢Josep Saura博士和Kumarasamy Murali博士对丰富的小胶质细胞培养进行故障排除和标准化。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

伦理

建立规程所用的所有动物程序均得到机构动物伦理委员会的批准（AEC / 44/264 / NP和AEC / 55/343 / NP）。

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