材料和试剂

一次性手术刀
15毫升和50毫升无菌猎鹰® 锥形管
1.7 ml无菌微量离心管
组织培养处理的24孔和6孔板
鹘® 100微米的细胞过滤（Corning公司，目录号：352360）
分离前过滤器（70 µm）（Miltenyi Biotec 目录号：130-095-823）
与PES（NALGENE快速流量一次性过滤单元的聚醚砜）膜，0.2 微米（Thermo Scientific的，Ç ：564-0020 atalog数）
MS色谱柱（Miltenyi Biotec ，目录号：130-042-201）
Dynabeads TM CD31内皮细胞，人类（Thermo Fisher，目录号：11155D）
Liberase TM （罗氏（Roche），目录号：5401119001 ）
Dispase （Corning，目录号：354235）
胎牛血清（HyClone ，目录号：SH30396.03）
EGM TM -2内皮细胞生长培养基-2 BulletKit TM （Lonza，目录号：CC-3162）
DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX TM Supplement（Thermo Fisher，目录号：10566-016）
纤连蛋白（FN）（Chemicon ，目录号：FC010；储备液= 1 µg / µl）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）10x，不含钙和镁（Lonza，目录号：17-517Q）
100x GPS（L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素，康宁，目录号：30-009-CI）
0.05％胰蛋白酶0.53 mM EDTA，1x（Corning，目录号：25-052-CI）
红细胞裂解缓冲液（罗氏，目录号：11814389001）
FcR 阻断剂，人类（Miltenyi Biotec ，目录号：130-059-901）
CD133 MicroBead 试剂盒（Miltenyi Biotec ，目录号：130-050-801）
Dynabeads TM 泛小鼠IgG（Thermo Fisher，目录号：11041）
的Dynabeads ® M-270链亲和素（赛默飞世，目录号：65305）
人类GLUT1抗体（R＆d 小号ystems，目录号：MAB1418）
人类PDGFRβ生物素化抗体（R＆d 小号ystems，目录号：BAF385）
氯化钙2 ·2H 2 O
MgSO 4 ·7H 2 O
葡萄糖
柠檬酸钠
柠檬酸
牛血清白蛋白
Na 2 CO 3
二甲基亚砜
热灭活的FBS（hiFBS ）（请参阅食谱）
Liberase TM 储备液（0.5 mg / ml）（请参阅食谱）
分配储备液（50 U / ml，100 ml）（请参阅食谱）
10x钙和镁（Ca 2+ / Mg 2+ ）溶液（请参阅食谱）
收集介质（请参见食谱）
消化缓冲液（请参阅食谱）
6％柠檬酸葡萄糖溶液，溶液A（ACD-A）（请参阅食谱）
缓冲区A（请参阅食谱）
缓冲区B（请参阅食谱）
EGM-2培养基（请参阅食谱）
纤连蛋白（FN）涂层缓冲液（请参见食谱）
用纤连蛋白（FN）包被培养板（见食谱）
淬火/解冻介质（请参见食谱）
冷冻介质（请参见食谱）

设备

镊子
移液器
杵（Thomas Scientific，目录号：3431D94;光滑的杵为44 mm x 22 mm）
冰箱
离心机仪（Eppendorf，米Odel等：5804）
水浴（Fisher Scientific公司，米奥德尔：2223）
MiniMACS 分离器（Miltenyi Biotec ，目录号：130-042-102）
DynaMag TM -2磁铁（Thermo Fisher，目录号：12321D）
-80°C冷冻室
-20°C无霜冰柜

程序

IH标本应在机构审查委员会（IRB）批准的人类受试者规程下获得。临床诊断应通过组织病理学证实。应遵循用于人体组织的生物安全2级程序。在组织均质化，抗体介导的选择和细胞培养的每个步骤均应使用无菌技术和无菌溶液。

组织收集和消化
切除后尽快将IH组织转移到装有5-10 ml收集培养基的无菌容器中。将组织放在冰上，并带到实验室。
用无菌PBS冲洗组织两次以去除表面血液。
如有必要，使用无菌手术刀和镊子将内部软IH组织与外部粗糙表皮分开。
用无菌的一次性手术刀将IH组织切成约2 mm 3的小块。
将切碎的IH组织转移到50 ml锥形管中，并用温和的移液器与新鲜制成的Digestion Buffer混合。每克肿瘤组织使用5体积的消化缓冲液（即5毫升消化缓冲液/ 1克切碎的IH）。
在37°C下孵育混合物。轻敲试管，每5-10 分钟混合一次。40-50分钟后，组织应显得柔软，溶液应变浑浊。不要过度消化（即超过1小时），因为样品会由于细胞裂解和DNA释放而变得粘稠。
用铁氟龙杵轻轻匀浆IH组织消化液。挤压50毫升试管时，上下移动杵并扭转。让肿瘤碎片沉淀到试管底部，然后将上清液转移到冰上的新试管中。
5毫升收藏品添加Ñ 中等至剩余的组织在原管和重复的均质化; 再重复一次。结合了3个上清液。
过滤器的组合的上清液通过一个100 微米的无菌细胞滤网。
用5-10 毫升的Colle ction培养基洗涤细胞滤网，以冲洗通过滤网的细胞。
在282 xg ，室温（RT）下将细胞悬浮液离心5分钟。
小心吸出上清液，并用5-10 ml缓冲液A重悬细胞沉淀。
离心细胞悬液在240 xg ，室温下5分钟。小心吸出上清液。
可选：红血细胞（红细胞）的很红的裂解（即，血液填充）样本
重悬的细胞在1 ml的PBS 和混合以及与7 毫升冰冷的RBC裂解缓冲液。
轻轻摇动于4°C孵育10分钟。
离心机在240 X 克，RT FO - [R 5 分钟。吸出上清液。
将细胞沉淀重悬于1 ml缓冲液A中。确定细胞数。可以从0.5 cm 3 IH样本中获得1 x 10 6 -2 x 10 6个细胞。将一半的细胞用于HemSC 纯化（过程B），另一半用于HemEC 和HemPericyte 纯化（过程CE）。有关细胞纯化策略的示意图，请参见图1。

D：\陈丹工作\ 1902882--1252 JoyceBischoff 811375 \ Figs jpg \ Fig1.jpg

˚F 使用顺序抗体包被的磁珠igure 1.细胞分离。示意图显示了从IH组织中分离出四种细胞类型的工作流程。

HemSC 纯化（有关其他信息，请参见Miltenyi Biotec 方案）
离心细胞悬液于240 x g，室温离心5分钟。吸出上清液。
将细胞重悬于300 µl冰冷的缓冲液A中。
加入100 µl人FcR 封闭剂，上下吹打2-3次以充分混合。
加入100 µl CD133微珠，充分混合。
在冰箱（2-8°C）中孵育30分钟，每5-10 分钟轻轻敲打一次试管。
加入9.5 ml冰冷的Buffer A洗涤细胞。
于240 x g 离心细胞，室温离心5分钟。吸出上清液。
将细胞重悬于500 µl冰冷的缓冲液A中。
预洗MS 柱通过将所述MS 柱中的磁场和漂洗用500 微升缓冲液A. 等待直到所述列储层是空的。
放置一个70 微米的细胞滤网上的顶部的列容器。负载细胞悬液，并让它运行通过细胞过滤器和输入MS 柱举行中的磁铁。
收集的污水。
洗的MS 柱用4× 500 微升缓冲液A.
收集所有废水馏分并合并在一起；保存为CD133阴性细胞。
除去所述柱从所述磁分离器和放置其上一个1.7 毫升无菌微量离心管中。
移液管1 ml的卜FFER甲上到柱上，收集CD133阳性细胞的通过牢固地推动柱塞（提供）到塔的顶部。
可选：要提高CD133阳性细胞的纯度，可将释放的细胞级分加载到第二个MS色谱柱上，然后重复CD133选择。
确定CD133阳性和CD133阴性细胞级分中的细胞数。将细胞悬液以240 x g的速度离心5分钟。除去上清液。如Yu 等人报道，CD133 +细胞的数量在消化的肿瘤细胞总数的0.2％到2％之间变化。，2004。产量取决于样本的大小，酶消化和抗CD133包被的珠子的批次。
在1 ml EGM-2 培养基中重悬CD133阳性细胞。将它们放在预先涂有1 µg / cm 2 FN 的24孔板的一个孔中。CD133阳性的HemSC 将在7-10天后开始在培养物中快速生长，并且将表现出间充质形态（图3）（Khan 等，2008）。
板CD133阴性细胞在一个良好的6-W Ê LL 板预涂覆有1 微克/厘米2 FN。在原代培养后，可以冷冻保存细胞以备将来使用（程序H），例如CD133阴性级分可用于选择CD31 + 和/或PDGFRβ + 细胞。

GLUT1阳性内皮细胞纯化（有关更多信息，请参见Pan Mouse IgG Dynabeads 方案）
离心的其它半的细胞悬浮液在240 X 克，RT 5分钟。
在80 µl冰冷的缓冲液A中重悬细胞（最多10 6 ）。
加入20 µl 人FcR 封闭剂。
孵育为10 分钟在该冰箱（2-8 ℃）。
添加1 微克的小鼠抗人GLUT1 抗体到100 微升细胞悬浮液- 1 微克抗体/ 10 6 个细胞/ 100 微升缓冲液。
孵育为30 分钟在该冰箱（2-8 ℃）。混合通过轻轻拍打该管每隔5-10 分钟。
加入10 ml 冰冷的缓冲液A，混合均匀。
离心机在240 X 克，RT 为5分钟。重悬的细胞沉淀在100 微升冰冷的缓冲液B.
预洗的Dynabeads ：转移5 微升的所述泛小鼠的IgG 的Dynabeads 到一个1.7 毫升无菌微量离心管中。加入1 ml 冰冷的缓冲液B 并混合。放置在管中一个磁体为1 分钟和抽吸上清液。
除去所述管从所述磁体和重悬的洗涤的Dynabeads 用5 微升冰冷的缓冲液B.
将洗涤过的珠子以1.5 µl 珠子/ 10 6 细胞/ 100 µl 缓冲液的量添加到经抗GLUT 1 处理的细胞中。混合好并孵育为10 分钟在该冰箱（2-8 ℃）。所述胎圈到细胞比可以被提高至2.5 微升珠/ 10 6 个细胞/ 100 微升缓冲液但避免增加的温育时间，因为这可能会增加非特异性结合。
添加1 ml的冰冷的缓冲液B. 将所述管在所述磁铁为1 分钟。抗GLUT1结合细胞会移动朝的磁铁离开的GLUT1阴性细胞释放的悬挂。轻轻收集的GLUT1阴性细胞级分成一个新的15 ml的锥形管中。
除去所述管从所述磁体。加入1 ml 冰冷的缓冲液B 并充分混合。放置的管回至所述磁体，收集和结合所述未结合的细胞中的同一15 ml的试管中。
重复此洗涤步骤两次。
后的最终洗涤，除去所述管从所述磁铁到释放的珠结合的GLUT1阳性细胞通过加入1 ml的EGM-2 培养基，以悬浮细胞。确定的细胞数量。板的细胞在一个良好的24孔板预涂用1 微克/厘米2 FN。
的GLUT1阴性细胞将被进一步纯化，使用抗CD31 磁性珠选择如描述在该下一个部分。
可选：为了提高所述收率的GLUT1阳性细胞，一第二轮的抗小鼠IgG抗体磁珠选择可以被应用在GLUT1阴性细胞级分。重复磁分离和板的细胞在一个新井的24孔板。难道不是从第一选择相结合的细胞。培养10-12天后，GLUT1阳性内皮细胞将开始增殖（Huang 等，2015）。

注意：增殖的IH中几乎所有GLUT1阳性细胞都是内皮细胞（参见Huang等人，2015 图1C），即它们表达内皮标记物CD31，VE-钙黏着蛋白和VEGRR2。在2-3周的体外培养和扩增后，细胞转变为间充质表型（图3）（Huang等，2015 ）。

GLUT1阴性内皮细胞纯化（有关其他信息，请参见抗人CD31 Dynabeads 方案）
Determi 甲肾上腺素的在GLUT1阴性级分的细胞的数目。于240 x g 离心细胞悬浮液，室温离心5分钟。吸出上清液。
重悬细胞我Ñ 200 微升冰冷的缓冲液B.
预洗的Dynabeads ：传输5 微升抗人CD31 的Dynabeads 到一个1.7 毫升无菌微量离心管中。加入1 ml 冰冷的缓冲液B 并混合。放置在管中一个磁体为1 分钟和抽吸上清液。
除去所述管从所述磁体和重悬洗涤珠与5 微升冰冷的缓冲液乙加入2μl洗涤的抗人CD31 的Dynabeads 至细胞中并在冰箱（2-8℃）孵育10分钟。
注意：每个细胞5-8个珠子是选择的最佳选择（图2）。如果有太多的珠子结合，它将减少内皮细胞与FN涂层培养皿的附着。孵育时间不要超过10分钟，因为这可能会导致非特异性结合并降低纯度。

D：\陈丹工作\ 1902882--1252 JoyceBischoff 811375 \ Figs jpg \ Fig2.jpg

˚F igure 2.抗CD31珠结合的细胞

添加1 ml的冰冷的缓冲液B. 将所述管在所述磁体和保持为1 分钟。抗CD31 Dynabead 结合细胞将移动朝向所述磁体（累积上的壁的所述管）离开的未结合的细胞，所述CD31阴性细胞级分，游离在悬浮液中。轻轻收集的CD31阴性细胞级分成一个新的15 ml的锥形管中。
除去所述管从所述磁体。加入1 ml 冰冷的缓冲液B 并充分混合。重复磁分离。收集和组合珠未结合的细胞进入的同一15 ml的试管中。
重复洗涤步骤2 更多倍。
后的最终洗涤，除去所述管从所述磁体和释放的珠结合的CD31阳性细胞在1 ml的EGM-2 培养基（图2）。确定的细胞数和板细胞在一个良好的24孔板预涂用1 微克/厘米2 FN。
GLUT1负HemECs 将需要7-10 天，以开始迅速扩散。如果需要的话，重复的抗CD31 的选择，以增加对内皮细胞的纯度。GLUT1阴性的HemEC 显示典型的内皮形态（图3）。
可选：为了提高所述收率的CD31阳性细胞，一第二轮的抗CD31 珠选择可以被应用在对CD31阴性细胞级分。重复磁分离和板的细胞在一个新井的24孔板。不要不结合细胞从的第一选择。

D：\陈丹工作\ 1902882--1252 JoyceBischoff 811375 \ Figs jpg \ Fig3.jpg

˚F igure 3. IH细胞在原代培养物

PDGFRβ阳性细胞的纯化（参见磁珠® 用于附加信息M-270链霉亲和协议）
确定的数目的细胞中的CD31阴性细胞级分。离心该细胞悬浮液在240 X 克，RT 为5 分钟。吸出上清液。
重悬的细胞在80 微升冰冷的缓冲液A.
加入20 µl 人FcR 封闭剂。
孵育为10 分钟在该冰箱（2-8 ℃）。
添加1 微克的生物素化的抗PDGFRβ 抗体到所述100 微升细胞悬浮液。
孵育为30 分钟在该冰箱（2-8 ℃）。混合通过轻轻拍打管每隔5-10 分钟。
加入10 ml 冰冷的缓冲液A，混合均匀。
在240 x g ，RT f 或5min下离心细胞悬液。吸上清液和重悬的细胞在100 微升冰冷的缓冲液B.
预洗的Dynabeads ：传输5 微升链霉亲和耦合的Dynabeads 到一个1.7 ml的微量离心管中。加入1 ml 冰冷的缓冲液B 并混合。放置在管中一个磁体为1 分钟和抽吸上清液。除去所述管从所述磁体和重悬的洗涤珠粒与5 微升冰冷的缓冲液B.
添加1.5 微升洗涤链亲和素偶联的Dynabeads 到所述细胞中，混合好并孵育为10 分钟在该冰箱（2-8 ℃）。
添加1 ml的冰冷的缓冲液B. 将所述管在所述磁铁为1 分钟。PDGFRβ阳性细胞将移动朝向所述磁体离开的PDGFRβ阴性细胞级分游离在悬浮液中。轻轻收集的PDGFRβ阴性细胞级分成一个新的15 ml的锥形管中。
除去所述管从所述磁场。加入1 ml 冰冷的缓冲液B，然后通过移液轻轻混合。放置的管回至所述磁体，收集和结合所述未结合的细胞中的同一15 ml的试管中。
重复洗涤步骤2 更多的时间，收集并结合PDGFRβ阴性细胞。
后的最终洗涤，收集PDGFRβ阳性细胞在1 ml的EGM-2 培养基，确定细胞数和板到一个良好的24孔板预涂用1 微克/厘米2 FN。
注：PDGFRβ阳性细胞- HemPericytes - 将会开始后5-7天（图3）扩大。

确定的数目的PDGFRβ阴性细胞。板的细胞进入一个孔的6孔平板precoate d用1微克/厘米2 FN和填充有2毫升EGM-2培养基。这些是基质细胞。
备选地，如Boscolo 等人，2013中所述，可将下周周膜平板接种在10％FBS-DMEM中的未涂覆的皿上。

Ë xpanding 珠选择的IH细胞
铺板后48小时，用移液管小心除去培养基和非贴壁细胞。在每个孔中加入新鲜的EGM-2培养基。您应该看到附着的单个单元格和/或单元格群集。
每2-3 天更换一次介质。

IH传代细胞
到通道单元，第一制备FN涂覆的板在浓度0.1 微克/厘米2 。
注意：这比用于初始电镀的板上的FN量低10倍。

洗板用无菌PBS 两次之前使用。在PBS 从在第二洗应该被删除的权利之前的细胞都准备好要进行电镀。
用PBS 洗涤细胞单层两次。
吸PBS 和添加预热的胰蛋白酶-EDTA （0.8 ml的/ P60，1.5 ml的/ P100，5 ml的/ P150）。轻轻摇动该板，以均匀地分布的胰蛋白酶-EDTA。
孵育在该37 ℃的培养箱中进行1-2 分钟。轻轻敲击所述板到分离细胞。
灭活的胰蛋白酶与淬火/解冻介质（5 ml的/ P60，8 ml的/ P100; 15 ml的/ P150），转移的胰蛋白酶处理细胞，以一个无菌管中。
回收剩余的细胞从所述板通过加入淬火/解冻介质来漂洗所述板。收集的冲洗和结合的细胞进入的同一管中。
确定细胞数，将细胞悬液以24 0 x g 离心，室温离心5分钟，然后吸出上清液。
将细胞重悬在EGM-2培养基中，然后以5,000细胞/ cm 2 （稀疏）或10,000细胞/ cm 2 的细胞密度将细胞铺板在经过FN涂层的组织培养物处理过的培养皿上。
HemSC ，GLUT1阳性的HemEC 和HemPericyte 通常以5,000细胞/ cm 2 接种。90％融合的p100板具有5 x 10 6 -6 x 10 6个细胞。
GLUT1阴性的HemEC 通常以10,000细胞/ cm 2 接种。90％融合的p100板具有3 x 10 6 -4 x 10 6个细胞。

冷冻IH来源的细胞
当细胞是汇合时，冲洗所述单层两次用PBS。
胰蛋白酶化的细胞，收集的细胞悬浮液和确定细胞数。
于240 x g 离心细胞悬浮液，室温离心5分钟。
用通过次数（+1），单元格编号和日期标记一个冷冻管。
暂停在细胞沉淀1 X 10 6 - 5×10 6 细胞在1ml冷冻介质和等分0.5-1 毫升每冷冻管。
将冷冻管到的“先生。冰霜” 并在-80 °C下放置过夜。
在接下来的一天，移动冷冻管到所述液体氮罐用于长期存储。

解冻IH衍生的细胞
准备FN涂层的，经组织培养处理的板（0.1 µg / cm 2 ），预热的EGM2培养基和淬灭/融化培养基。
准备15 毫升Falcon 管。向每个管中添加5 ml 淬灭/解冻介质。
用PBS 洗涤FN包被的板两次。
迅速解冻冷冻的细胞直接后除去从液体氮通过放置在一个37 ℃的水浴中为1-2 分钟。轻轻晃动的管，以方便解冻。
将细胞转移到预装有淬灭/解冻介质的15 ml 管中（避免剧烈吸液）。确定单元格编号。
于240 x g 离心细胞悬浮液，室温离心5分钟。
抽吸淬火/解冻介质。将细胞重悬于EGM-2培养基中，并平板接种在FN包被的组织培养物处理过的培养皿中（3 ml / p60; 10 ml / p100; 25 ml / p150）。
标记的涂板用细胞类型，通道号，日期，和缩写。
细胞应在接种后4-6 小时内附着。每隔2-3 天添加新鲜的媒体。

资料分析

在第2-3代通过流式细胞仪，免疫荧光和qPCR分析细胞表型和纯度。HemSC 对于CD90和VEGFR1 是阳性的，而对于CD31是阴性的（Khan 等，2008）。GLUT1 + HemECs 最初通过qPCR对CD31，VE-钙粘着蛋白和VEGFR2呈阳性，但随着培养时间的推移，不再检测到这些内皮标志物，而是细胞表达间充质标志物CD90（参见Huang 等人，2015）。GLUT1- 阴性/ CD31 + HemEC 表达CD31，VE-钙黏着蛋白和VEGFR2，不表达CD90 （Huang 等，2015 ），半绒毛细胞表达PDGFRβ，NG2，钙蛋白，α-平滑肌肌动蛋白，NOTCH3但不表达CD31 （Boscololo 等人，2013）。根据需要对细胞进行重新分析，例如在体内实验之前，以验证表型。我们通常使用的细胞通路小号4和10 。

笔记

CD133 +细胞的百分比在不同的IH标本中有所不同（Yu 等，2004）。
超过1岁患者的IH标本中GLUT1 + 内皮细胞的百分比降低（Huang 等，2015 ）。
PBS中的1％明胶可以代替FN，用于覆盖培养板。
始终使用新鲜制备的EGM2培养基，以确保单因子（VEGF-A，碱性FGF，EGF和IGF1）中生长因子的活性完全一致。制备好介质后，可以将其等份保存在-20°C下直至使用。准备或解冻后的3-4天内应使用2-8 °C 储存的培养基。

菜谱

热灭活FBS（hiFBS ）
将500 ml的HyClone FBS 瓶在温水中解冻（持续数小时）或在4°C下过夜。
将解冻的FBS放入56°C的预热水浴中30分钟（确保水覆盖瓶中的所有FBS。每隔10分钟摇动/倒置一次，将FBS混合在瓶中，以使整个过程中温度均匀） 500毫升瓶。
让FBS冷却到室温。
等分试样45毫升到无菌的50ml管并储存于- 20℃的非除霜冰箱中。
在使用前，将37 ml热灭活（hi）-FBS的45 ml冷冻等分试样解冻约20分钟或4°C过夜。
Liberase TM 储备液（0.5mg / ml）
5 mg 冻干的Liberase TM

溶于10毫升无菌ddH 2 O
取0.5 毫升等分试样并储存在-20 °C
分配储备液（50 U / ml，100 ml）
制作5毫升等分试样，并在-20°C下储存

10x Ca 2+ / Mg 2+ 溶液500 ml
927毫克氯化钙2· 2H 2 O （最终浓度：1.26 mM）

1.0 g MgSO 4 ·7H 2 O （最终浓度：0.8 mM）

溶于无菌ddH 2 O ，最终体积为500 ml
过滤器（0.2 微米），并储存在室温下
收集介质100毫升
87 ml DMEM（高葡萄糖，GlutaMAX TM 补充剂）

10 ml 10x Ca 2+ / Mg 2+ 溶液

2 ml高FBS

1毫升100x GPS

混合和过滤器（0.2 微米）
分装至5或10 ml /管，并在-20°C下保存长达3个月
消化缓冲液6毫升（新鲜配制）
解冻5毫升收集培养基
加入0.5 ml Liberase TM （0.5 mg / ml）（1:10；工作浓度：50 µg / ml）
加入0.5 ml Dispase（50 U / ml）（1:10; 工作浓度：5 U / ml）
6％ACD-A溶液，1 L
22.3克葡萄糖

22.0克柠檬酸钠

8.0克柠檬酸

溶解ddH 2 O至终体积1 L
过滤器（0.2 微米），并存储在4℃下
缓冲液A （PBS / 0.6％ACD-A / 0.5％BSA）500毫升
2.5克BSA

50 ml 6％ACD-A溶液

450毫升PBS

溶解，过滤器（0.2 微米），并存储在4℃下

缓冲液B （PBS / 0.6％ACD-A / 0.1％BSA），500毫升
0.5克BSA

50 ml 6％ACD-A溶液

450毫升PBS

溶解，过滤器（0.2 微米），并存储在4℃下

EGM-2培养基500毫升
445毫升EBM-2

50毫升hiFBS

5毫升100x GPS

EGM-2单Q UOT 补充剂（除了氢化可的松）

过滤器（0.2 微米），等分试样（45 毫升/管），并储存在-20 ℃下直到需要或在4个商店℃，并使用在3-4 天

纤连蛋白（FN）包被缓冲液（0.1 M Na 2 CO 3 ），500毫升
5.3克Na 2 CO 3

溶于ddH 2 O，最终体积为500 ml
用12 N HCl将pH调节至9.4
过滤（0.2 µm）并在室温下保存
用纤连蛋白（FN）包被培养板
计算所需的FN量；库存为1 µg / µl
使用1 微克/厘米2 为新鲜分离的细胞和0.1 微克/厘米2 为EXP 原代培养细胞的安森
将FN稀释到恰好足以覆盖板的FN涂层缓冲液中
充分混合并用无菌移液器添加板
在37 °C的培养箱中孵育30分钟或最多过夜（如果蒸发，可以添加更多的包被缓冲液过夜孵育）
淬火/解冻介质（500毫升）
445 ml DMEM（高葡萄糖，GlutaMAX TM 补充剂）

50毫升hiFBS （最终10％）

5毫升100x GPS

过滤（0.2 µm）并储存在4°C

EGM-2介质也可以用于淬灭，但比DMEM贵

冷冻介质（使新鲜）
95％hiFBS

5％二甲基亚砜

过滤（0.2 µm）并储存在4 °C

致谢

在发展中的方法描述在这个手稿是支持通过的NHLBI 的的国家研究院的健康下授予数量R01 HL096384 到J.B. 的内容是完全的责任的的作者和它不必然代表了官方观点的对国家机构的健康。

利益竞争

作者没有要披露的金融和非金融竞争利益。

伦理

用于这些隔离程序的IH组织是根据IRB批准的规程从波士顿儿童医院临床研究委员会（04-12-175R; 11/11/2010 – 6/6/2020）获得的。从受试者的父母或监护人那里获得了知情同意。

参考文献

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