材料和试剂

玻璃载玻片（Leica，型号：3809299）
苏格兰胶带（1/2"）（3M，Scotch，型号：600）
烟草（一个月大）和大豆幼苗（两周大）
蒸馏水
低熔点琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：16520-050）
3％琼脂糖溶液（见配方）

设备

恒温水浴（40°C）
指尖镊子（Tweezerman，型号：4091833）
冰箱（4℃）（海尔，型号：HT18TS77SP）
光学显微镜（Olympus，型号：BX51）
显微镜（Olympus，型号：UPlanFI）上使用的物镜

软件

ImageJ（版本1.38x或更高版本）

程序

用于筛选表皮的叶子通过数码相机拍照（图1）。使用ImageJ测量总叶面积（LA）。对于使用ImageJ的测量区域，使用直线工具创建线选择对应于刻度尺，并在分析>中输入该距离。设置缩放对话框以设置缩放。然后使用多边形选择工具包围目标区域，然后按M键测量区域

图1.用于筛选表皮的叶的照片。用数码相机拍摄带有标尺的叶子。使用ImageJ测量叶面积。
对于叶表皮的统计分析，叶沿着叶脉分成几个部分（图2），并且使用ImageJ测量每个叶部分（ALP）的面积。

为了测量表皮细胞大小和数量，将叶（烟草）分成几个部分（由黄线分隔），并且将每个叶部分的面积ALP）。蓝色周期表示选择用于观察表皮的叶片。箭头表示选择用于筛选气孔的中心部分。酒吧= 2厘米。
使用以下方法选择在每个叶部分中的一至三片叶片（必须均匀分布）用于观察表皮（图2）。
为了观察脆弱和少毛的叶（例如烟草），基于琼脂糖的表皮印记法如下进行：
1. 将3％琼脂糖溶液在沸水浴中（对于50ml溶液约10分钟）或在微波（在1,000W下对于50ml琼脂糖溶液30秒）完全熔化并保持在40℃水浴中。
2. 用移液管将琼脂糖置于干净的载玻片的表面上以形成薄层（约1mm厚）（视频1）。
  
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  视频1.用于表皮印迹到琼脂糖上的样品制备
  
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3. 将观察到的叶片快速且温和地铺在琼脂糖层上（视频1）。
4. 将载玻片在冰箱中立即在4℃放置3分钟
5. 使用尖锐的镊子小心地剥离叶片（视频2）。
6. 在光学显微镜下观察样品并拍照（图3）
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视频2.展示如何在压印后剥离叶片

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为了观察毛叶（例如大豆），基于带的表皮撕裂方法如下进行：

将苏打带切成片（约0.3×0.3cm）。
在适当的压力下将胶带片紧紧地贴在叶片上，但避免压碎表皮（视频3）。

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视频3.基于胶带的表皮撕裂方法的样品准备

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使用尖锐的镊子从一侧小心地撕下条（表皮粘在磁带上）（视频3）。
如果大量叶肉细胞粘附到表皮，可以使用镊子从一侧轻轻地刮掉。
将表皮条浸在载玻片上的蒸馏水中，避免气泡（视频3）。
在光学显微镜下观察样品并拍照（图4）。

每片叶的平均细胞大小如下测量和计算：

使用ImageJ中的多边形选择工具（图3）选择每个叶片的显微照片中的三个区域（50-100个细胞）。测量区域面积，并计数细胞数量。
计算每个叶部分（CSP）的单元格大小（除以所有区域的总面积在每个叶部分中由所有区域的总细胞数选择）。
平均泡孔尺寸（ACS）使用下式计算：
ACS =ΣCSPn×ALPn/LA

然后计算每片的细胞数（CN）如下：
CN = LA/ACS
为了测量气孔密度和气孔孔径，使用步骤4或5中描述的方法选择每个叶的中心部分用于观察表皮。
使用ImageJ中的多边形选择工具选择显微照片中的三个区域（20-50个气孔）。测量区域面积，计数气孔数，并计算气孔密度（将气孔数除以面积）。还使用ImageJ中的直线工具测量气孔宽度和长度，并计算气孔孔径（将气孔宽度除以气孔长度）。

代表数据

图3.通过琼脂糖印迹筛选叶表皮细胞将叶（烟草）表皮印在琼脂糖上，并在光学显微镜下筛选。具有黄色边缘的多边形表示用于测量叶部分的单元尺寸的选择区域。黑点是用于计算单元格编号的标记（使用ImageJ中的画笔工具创建）。 Bar =200μm。

图4.通过撕裂表皮来筛选叶表皮细胞。使用透明胶带撕下叶（大豆）表皮，并在光学显微镜下筛选。 Bar =50μm。

笔记

使用琼脂糖印迹方法，叶片必须是平的，并放在熔化的琼脂糖非常温柔。否则，表皮的一些细节结构将丢失或甚至不能印在琼脂糖上。
使用表皮撕裂方法，叶肉细胞应从一侧轻轻刮一次，以避免破坏表皮的结构。
年轻和扁平的叶子比用于表皮筛选的老叶和圆叶更好

食谱

3％琼脂糖溶液（50ml）将1.5g低熔点琼脂糖加入到50ml蒸馏水中煮沸直到琼脂糖完全融化
当温度约为40°C时使用
密封和储存在室温（只需要熔化，当需要使用）

致谢

该方案从先前公开的研究（Mathur和Koncz，1997; De Veylder等人，2001; Tao等人，2015）得到改进。这项工作是由中国国家自然科学基金（拨款号：91317306）和植物基因组学国家重点实验室支持。

参考文献

De Veylder，L.，Beeckman，T.，Beemster，GT，Krols，L.，Terras，F.，Landrieu，I.，van der Schueren，E.，Maes，S.，Naudts，。（2001）。细胞周期蛋白依赖性激酶的功能分析拟南芥的抑制剂。植物细胞13（7）：1653-1668。
Mathur，J.和Koncz，C。（1997）。使用琼脂糖制备表皮印记的方法 Biotechniques 22（2）：280-282。

------------------------------------------------------------- 插入文件"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25941315"target ="_ blank">烟草翻译控制的肿瘤蛋白与乙烯受体烟草组氨酸激酶1相互作用，并通过促进细胞增殖来增强植物生长。 Plant Physiol 169（1）：96-114。