材料与试剂

生物材料

人 CD34 脐带血 iPSC [22]
人 LGMD2A 和 LGMD2A 等基因 iPSC [23]
人 DMD iPSC [24,25]
人 CD34 脐带血 iPSC [26]（Gibco ^TM Episomal iPSC Line，目录号：A18945）
HsdCpb：NMRI-Foxn1nu 小鼠（NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu，Janvier，St Berthevin Cedex，法国）

试剂

DMEM/F12（Gibco ^TM，目录号：21331020）
ITS-G（Gibco ^TM，目录号：41400045）
ITS-X（Gibco ^TM，目录号：51500056）
L-谷氨酰胺（Gibco ^TM，目录号：25030081）
非必需氨基酸（NEAA）（Gibco ^TM，目录号：11140050）
视黄酸（Sigma-Aldrich，目录号：R2625）
LDN-193189（Sigma-Aldrich，目录号：1062368-24-4）
CHIR-99021（Biogems，目录号：2520691）
重组人 FGF-basic（bFGF）（Peprotech，目录号：100-18B）
重组人 HGF（Peprotech，目录号：100-39H）
重组人 Sonic Hedgehog （SHH）（Peprotech，目录号：100-45）
重组人 Wnt-1 （WNT1A）（Peprotech，目录号：120-17）
青霉素/链霉素（P/S）（Gibco ^TM，目录号：15070063）
聚（甲基丙烯酸-2-羟乙酯）（Sigma-Aldrich，目录号：P3932）
聚乙烯醇（PVA）（Sigma-Aldrich，目录号：363065）
TeSR ^TM -E8 ^TM（StemCell Technologies，目录号：05990）
StemFlex ^TM介质（Thermo Fischer Scientific，目录号：A3349401）
TrypLE ^TM Select（Gibco ^TM，目录号：12563011）
Y-27632（干细胞技术，目录号：72304）
来自木瓜乳胶的木瓜蛋白酶（Sigma-Aldrich，目录号：P4762）
Corning®Matrigel®生长因子减少（^康宁^，目录号：354230）
Anti-Brachyury（R&D Systems，1:250，目录号：AF2085）
抗 TBX6，1:200（Abcam，目录号：ab38883）
抗 PAX3，1:250（DHSB，目录号：N/A）
抗 PAX7，1:250（DHSB，目录号：N/A）
抗 SOX10，1:125（R&D Systems，目录号：AF2864）
抗 TFAP2A，1:100（DHSB，目录号：3B5）
抗 FastMyHC，克隆 MY-32，1:300（Sigma-Aldrich，目录号：M4276）
抗 SOX2，克隆 Btjce，1:100（Thermo Fisher Scientific，目录号：14-9811-82）
抗肌营养不良蛋白，1:20（Leica，目录号：NCLDYS1）
抗核纤层蛋白 A + 核纤层蛋白 C 抗体，1:150（Abcam，目录号：ab108595）
PE抗人CD82抗体（BioLegend，目录号：342103）
山羊抗小鼠 IgG (H + L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 568，1:1,000（Invitrogen，目录号：A-11063）
山羊抗兔 IgG (H + L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488，1:1,000（Invitrogen，目录号：A32731）
HISTOPRIME 正常山羊血清，无菌（NGS）（BIOZOL，目录号：LIN-ENG1000-100）
罗丹明红^TM -X (RRX) AffiniPure 山羊抗小鼠 IgG，Fcγ 亚类 1 特异性，1:100（Jackson Nutrition Research Laboratories，目录号：115-295-003）
Alexa Fluor 488，山羊抗大鼠 IgG (H + L) 交叉吸附二抗，1:500（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11006）
Alexa Fluor 488，驴抗小鼠 IgG (H + L) 交叉吸附二抗，1:500（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32766）
Alexa Fluor 488，驴抗山羊 IgG (H + L) 交叉吸附二抗，1:500（Thermo Fisher Scientific，目录号：A32814）
Alexa Fluor 568，驴抗兔 IgG (H + L) 交叉吸附二抗，1:500（Thermo Fisher Scientific，目录号：A10042）。
心脏毒素（CTX）（Sigma-Aldrich，目录号：217503-1MG）
二水柠檬酸钠（Fisher Scientific，目录号：15538154）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（CARL ROTH，目录号：8043.2）
一水柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7129）
单细胞 3' 文库和凝胶珠试剂盒 v3（10× Genomics，目录号：PN-1000075）
单细胞 B 芯片套件（10× Genomics，目录号：PN-1000073）
i7 多重试剂盒（10× Genomics，目录号：PN-120262）
牛白蛋白（BSA）组分V（7.5％溶液）（Gibco ^TM，目录号：15260037）
甘氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：G8898）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：168149）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：84100）
Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：11332465001）
Tissue-Tek ^® OCT 化合物（Sakura Finetek，目录号：SA62550-01）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100-100ML）
DAPI 现成解决方案（Sigma-Aldrich，目录号：MBD0015-5ML）
PBS（10×），pH 7,4（Gibco ^TM，目录号：70011044）

解决方案

涂层溶液 (100 mL)（参见配方）
分化培养基 1 (Di-CL) (100 mL)（参见配方）
分化培养基 2 (Di-CLF) (100 mL)（参见配方）
分化培养基 3 (Di-CLFR) (100 mL)（参见配方）
分化培养基 4 (Di-LSW) (100 mL)（参见配方）
分化培养基 5 (Di-HF) (100 mL)（参见配方）
分化培养基 6 (Di-H) (100 mL)（参见配方）
FACS 缓冲液 (25 mL)（参见配方）
封闭缓冲液 (20 mL)（参见配方）
木瓜蛋白酶溶液 (30 mL)（参见食谱）
柠檬酸钠溶液 (0.1 M)（参见配方）
柠檬酸溶液 (0.1 M)（参见配方）
EFTA 库存溶液 0.5 M pH 8.0

食谱

包衣溶液（100 mL）

试剂	最终浓度	数量或体积
乙醇	95%	95毫升
水蒸气	不适用	5毫升
聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)	120毫克/毫升	1.2克
全部的	不适用	100毫升

混合后的包衣溶液不进行灭菌，因为高乙醇含量使得污染的可能性不大。应用于培养皿后，通过紫外线处理进行灭菌。或者，可以通过 0.25 μm 过滤器对涂层溶液进行灭菌。

分化培养基 1 (Di-CL) (100 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
DMEM/F12	不适用	96毫升
L-谷氨酰胺	2毫米	1毫升
ITS-G	不适用	1毫升
国家环境局	不适用	1毫升
压力/压力	500单位/毫升	1毫升
CHIR-99021	3μM	100微升
LDN-193189	0.5μM	100微升
全部的	不适用	100毫升

分化培养基 2 (Di-CLF) (100 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
DMEM/F12	不适用	96毫升
L-谷氨酰胺	2毫米	1毫升
ITS-G	不适用	1毫升
国家环境局	不适用	1毫升
压力/压力	500单位/毫升	1毫升
CHIR-99021	3μM	100微升
LDN-193189	0.5μM	100微升
成纤维细胞生长因子	10纳克/毫升	50微升
总计（可选）	不适用	100毫升

分化培养基 3 (Di-CLFR) (100 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
DMEM/F12	不适用	96毫升
L-谷氨酰胺	2毫米	1毫升
ITS-G	不适用	1毫升
国家环境局	不适用	1毫升
压力/压力	500单位/毫升	1毫升
CHIR-99021	3μM	100微升
LDN-193189	0.5μM	100微升
成纤维细胞生长因子	5纳克/	25微升
视黄酸	10纳米	10微升
全部的	不适用	100毫升

分化培养基 4 (Di-LSW) (100 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
DMEM/F12	不适用	96毫升
L-谷氨酰胺	2毫米	1毫升
ITS-G	不适用	1毫升
国家环境局	不适用	1毫升
压力/压力	500单位/毫升	1毫升
LDN-193189	0.5μM	100微升
SHH	34纳克/毫升	100微升
WNT1A	20纳克/毫升	200微升
全部的	不适用	100毫升

分化培养基 5 (Di-HF) (100 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
DMEM/F12	不适用	96毫升
L-谷氨酰胺	2毫米	1毫升
ITS-G	不适用	1毫升
国家环境局	不适用	1毫升
压力/压力	500单位/毫升	1毫升
肝细胞生长因子	10纳克/毫升	100微升
成纤维细胞生长因子		50微升
全部的	不适用	100毫升

分化培养基 6 (Dix-H) (100 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
DMEM/F12	不适用	96毫升
L-谷氨酰胺	2毫米	1毫升
智能交通系统X	不适用	1毫升
国家环境局	不适用	1毫升
压力/压力	500单位/毫升	1毫升
肝细胞生长因子	10纳克/毫升	100微升
全部的	不适用	100毫升

FACS 缓冲液 (25 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
PBS 1×	不适用	18.24毫升
乙二胺四乙酸	2毫米	0.1毫升
牛血清白蛋白	2%	6.66毫升
全部的	不适用	25毫升

封闭缓冲液 (20 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
PBS 1×	不适用	18.24毫升
牛血清白蛋白	2%	5.33毫升
山羊血清 (NGS)	10%	2毫升
全部的	不适用	20毫升

木瓜蛋白酶溶液 (30 mL)

试剂	最终浓度	数量或体积
DMEM/F12	不适用	30毫升
木瓜蛋白酶	0.3M	36毫克
乙二胺四乙酸	2%	8毫克
L-半胱氨酸	10%	8毫克
全部的	不适用	30毫升

柠檬酸钠溶液 (0.1 M)

试剂最终浓度数量或体积

柠檬酸钠 0.1M 29.41克

水蒸气不适用 1,000 毫升

全部的不适用 1,000 毫升
柠檬酸溶液 (0.1 M)

试剂最终浓度数量或体积

柠檬酸 0.1M 21.1克

水蒸气不适用 500毫升

全部的不适用 500毫升

实验室用品

细胞培养板，24孔，表面：标准，平底（SARSTEDT，目录号：83.3922）
细胞过滤器 40 μm（SARSTEDT，目录号：83.3945.040）
封口膜（Bemis，目录号：11772644）
血清移液器，带吸头，塞住，5 mL，无菌（SARSTEDT，目录号：86.1253.025）
血清移液器，带吸头，带塞，10 mL，无菌（SARSTEDT，目录号：86.1254.025）
组织培养皿，35 × 10 mm，表面：标准（SARSTEDT，目录号：83.3900）
组织培养皿，100 × 20 mm，表面：标准（SARSTEDT，目录号：83.3902）

设备

细胞培养显微镜（奥林巴斯，型号：CKX41）
徕卡模块化体视显微镜（徕卡，型号：MZ10F）
CryoStar NX50（Thermo Scientific，目录号：957210）
FACS 分选机（Beckman Coulter，MoFlo Astrios EQ Cellsorter，目录号：B52102）
Neubauer 室（Marienfeld，目录号：0640131）
蔡司玻片扫描仪（卡尔蔡司显微镜，型号：Axio Scan.Z1）
蔡司共焦激光扫描显微镜（卡尔蔡司显微镜，型号：LSM 800）
Eppendorf 离心机 5804R（Eppendorf，目录号：EP022628146）

软件和数据集

Summit（贝克曼库尔特，版本：6.3.1）
Kaluza 分析（Beckman Coulter，版本：2.1）
Zen Lite Blue（卡尔蔡司显微镜，版本：4.0.3，2021 年 6 月）
R v4.2（https://www.r-project.org/，2022年 4 月）

程序

人类多能干细胞维护
1. 将人 PSC 作为菌落培养在 35 mm 培养皿上，涂有 4% 基质胶和 TeSR ^TM -E8 ^TM或 StemFlex ^TM培养基。细胞在70%汇合时传代。
2. 第-3天：将70%汇合的hiPSC培养物的细胞按1:3/1:4的比例分裂。
  1. 丢弃培养基并用 PBS 冲洗培养皿以去除未贴壁的细胞，并将其与 TrypLE 一起在 37°C 下孵育 3-5 分钟以进行化学解离。
  2. 使用基础培养基 DMEM/F12 停止解离。
  3. 以 400 rpm 旋转细胞 5 分钟，丢弃重悬的 DMEM/F12，并将补充有 10 µM Y-27632 的TeSR ^TM -E8 ^TM中的细胞铺在新的 Matrigel 包被的 35 mm 培养皿上。（将 0.5 mL 的基质胶溶解在 24.5 mL 的 DMEM/F12 中。将 2 mL 溶液添加到 35 mm 培养皿中，并在 37°C 下聚合基质胶 2 小时或在室温 (RT) 下过夜，然后进行紫外线灭菌。使用。）
  4. 培养细胞两天并每天更换 TeSR ^TM -E8 ^TM。将 2 mL 介质用于 35 mm 培养皿。
拟胚体（EB）的产生和类器官的分化
1. 第-4天：通过向每个24孔板孔中添加150μL包被溶液来制备低附着包被板。让乙醇蒸发过夜并将板储存在室温下直至使用。
2. 第-3/-2天：使用酶解方法以1:3/1:4比例传代hiPSC培养物，达到70%–80%汇合度。第二天，刷新不含 Rock 抑制剂的培养基，并且，如果：
  1. 培养达到 30%–40% 汇合，第二天继续生成 Ebs。
  2. 培养达到50%以上汇合，刷新不含Rock抑制剂的培养基后当天继续产生Ebs，并培养细胞至少4-5小时，然后再次解离以进行悬滴法产生Ebs。
3. 第-1天：通过悬滴法生成Eb：
  1. 将 40 mg PVA 溶解在 10 mL 的 TeSR ^TM -E8 ^TM /StemFlex ^TM中，然后通过过滤（0.25 μM）灭菌，并补充 10 μM Y-27632 和 1% P/S。
  2. 丢弃培养基，用 PBS 冲洗培养皿以去除未贴壁的细胞，然后将其与 TrypLE 一起在 37°C 下孵育 3-5 分钟以进行化学解离。
  3. 使用基础培养基 DMEM/F12 停止解离。
  4. 以 400 rpm 旋转细胞 5 分钟，丢弃 DMEM/F12，并在补充有 10 μM Y-27632 和 1% P/S 和 PVA 的TeSR ^TM -E8 ^TM /StemFlex ^{TM中重悬。}
  5. 计数细胞并将细胞密度调整至 200,000 个细胞/mL (=4,000 个细胞/20 μL)。
  6. 使用 10 cm 细胞培养皿的盖子，将 20 μL 滴到其上。用 PBS 填充培养皿以达到湿润条件，然后再次盖上培养皿的盖子。
  7. 对于 EB 形成，将 10 cm 细胞培养皿在 37 °C 和 5% CO _{2 的}培养箱中孵育过夜。
4. 第 0 天：
  1. Eb 的尺寸应为 200–250 μm。
    
    注意：如果 EB 周围有一团死亡的单细胞，且 EB 的大小低于 200 μm，则在重复步骤 B3 时，将 Rock 抑制剂的浓度增加到 1.5–3 倍以增强细胞存活率。
  2. 在冰箱的冰上解冻基质胶；它应该保持低温（<4°C）以避免整个过程过早聚合。
  3. 使用 DMEM/F12 将 Ebs 清洗到盘子中。
    
    注意：对使用区域进行彻底消毒后，在引擎盖外的立体镜下进行以下步骤。在介质中应用 1.5× P/S 可防止可能的污染。
  4. 使用 200 μL 移液器将单个 Eb 放置到 Parafilm ^®嵌入表面上。去除多余的介质，但切勿让 EB 没有介质（应保留约 5 μL 的 DMEM/F12）。结构良好的 Ebs 不应受到任何伤害。
  5. 将 30 μL 基质胶滴置于每个 EB 上，重悬以确保基质胶滴内的 Eb 均匀混合，并使用 200 μL 移液器将 EB 置于滴的中心。
    
    注意：为确保基质胶聚合均匀：上下重悬 2-3 倍，仅将 EB 放入基质胶内。由于立体镜的光源，基质胶聚合得更快。
  6. 将嵌入的 Eb 在 37°C 的培养箱中孵育 20-25 分钟。
    
    注意：以下步骤在细胞培养罩下进行。
  7. 使用 DMEM/F12 将 Ebs 清洗到 10 厘米细胞培养皿中。
    
    注意：嵌入的 EB 液滴因基质胶而呈现微红色。当使用截止 1,000 μL 移液器吸头收集它们时，使用新鲜的 DMEM/F12 以获得更好的可视化效果。在整个实验过程中，在处理细胞、Ebs 或 SMO 之前，移液器吸头不会被涂覆。
  8. 准备 Di-CL 介质并将 1 mL 放入每个低附着涂层板孔中，然后在培养箱中加热。
  9. 使用一个截止 1,000 μL 移液器吸头将嵌入的 Ebs 转移到低附着涂层板孔中，并在 37 °C 和 5% CO ₂下孵育它们。
  10. 每天交换部分媒体。
    
    注意：正在发育的类器官非常小。如果类器官仍然存在，则在更换培养基后进行控制。为避免在更换培养基期间破坏类器官，请将培养板保持在 45 度，并通过指向孔顶部并缓慢吸气来小心地去除培养基。更换培养基期间类器官绝不能变干。
    
    重要提示：由于肌生成和迁移发生在基质胶液滴内，因此应始终避免在更换培养基期间损坏基质胶。
    
    注意：此步骤需要格外小心，以免丢失或破坏正在发育的类器官，这对于所有类器官协议的初学者来说都是一个挑战。嵌入式 EB 的可见性较差是一个重要的标准。细胞培养板下方的深色底座有助于更容易识别。将板向实验者倾斜略低于 45° 会导致类器官移动到下边缘，从而降低损坏它们的可能性。
5. 第 3 天：通过移除 75% 并添加相同体积的介质，将介质从 Di-CL 更改为 Di-CLF 介质。
6. 第 5 天：通过移除 75% 并添加相同体积的介质，将介质从 Di-CLF 更改为 Di-CLFR 介质。
7. 第 7 天：通过移除 75% 并添加相同体积的介质，将介质从 Di-CLFR 更改为 Di-LSW 介质。每隔一天更换一次介质。
8. 第 11 天：通过去除 75% 并添加相同体积的介质，将介质从 Di-LSW 更改为 Di-HF 介质。每隔一天更换一次介质。
9. 第 15 天：通过去除 75% 并添加相同体积的介质，将介质从 Di-HF 更改为 DiX-H 介质。每隔一天更换一次介质。
10. 从第 30 天开始：每三天更换一次介质。
  
  步骤 5-10 在图 1A 和 3A 的协议概要中描述。
  
  图 1.骨骼肌类器官发育不同阶段的代表性图像。 A. 生肌发育阶段的明场图像，以及相应的细胞因子/生长因子应用。 B. 早期中胚层、神经、轴旁中胚层和神经嵴起源的代表性免疫细胞化学图片。 C.代表性免疫细胞化学图片描绘了类器官培养进展后更成熟阶段的神经谱系停滞、肌源性祖细胞迁移和骨骼肌类器官形成。虚线表示初始 EB 嵌入位点和迁移发生前的生长。比例尺：(C) 为 500 μm，A（第 18 天至第 60 天）和 B（第 17 天）为 200 μm，A（第 -1 天至第 17 天）和 B（第 5 天、第 7 天、第 7 天）为 100 μm 11)（根据 Mavrommatis 等人修改[18]）。
不同阶段类器官的免疫染色
1. 将来自不同阶段的类器官固定在 4% PFA（PBS 中）中，在 4°C 下摇动条件过夜。
2. PFA 固定后，用 PBS 中的 30% 蔗糖溶液将类器官脱水过夜，并将其包埋在 Tissue-Tek ^® OCT 化合物中。
3. 在冷冻机上获得 20-30 μm 厚度的冷冻切片。
4. 对于免疫染色过程，用 PBS 对冷冻切片进行再水化，首先用 PBS 中的 0.1% Tween-20（10 分钟）对其进行透化，然后用 1× PBS 冲洗 3×。
5. 用 PBS 中的 0.1% Triton X-100 进一步透化冷冻切片（10 分钟），并用 PBS 冲洗 3 次。
6. 在 RT 下用封闭缓冲液封闭冷冻切片 1 小时。
  
  注意：对于山羊来源的一抗，请使用仅含有 2% BSA 的封闭液。
7. 与一抗在 4°C 下孵育过夜，与二抗在 RT 下孵育 2 小时。
8. 使用含有 DAPI 的安装介质安装冷冻切片。
9. 在共焦显微镜上采集图像并使用 Zen Lite Blue 对其进行分析。冰冻切片可在冰箱中稳定数月；然而，这不能推广到所有抗体。代表性图像如图 1B 和 1C 所示。
通过单细胞 RNA 测序分析成熟阶段的骨骼肌类器官
1. 用木瓜蛋白酶溶液孵育 1 小时来制备单细胞。或者，在 37°C 下与 TrypLE Select 一起孵育 15 分钟，然后在重悬时使用 1000 μL 移液器上下移液进行机械解离，也可生成适合 scRNAseq 管道的单细胞。
  
  注意：对于 TrypLE 温和解离，请在重悬之前剪断 1 mL 移液器吸头。
2. 解离后，估计细胞数量和活力。将细胞重悬于含有 0.5% BSA 的 PBS 溶液中，以达到每 μL 390 个细胞的浓度。
3. 使用 Chromium Single Cell 3' Reagent kit (v3)（Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v3、Single Cell B Chip Kit 和 i7 Multiplex Kit）或等效方法根据制造商的说明制备 cDNA 文库。
4. 使用 Illumina HiSeq 3000 或等效方法使用 150 bp 双端读数对 cDNA 文库进行测序。
5. R 中的下游生物信息学分析示例如图 2 所示。
  
  图 2. 骨骼肌类器官发育过程中成熟阶段晚期胎儿肌原祖细胞的代表性单细胞 RNA-seq 分析。 A.分化后 12 周时颜色编码聚类（n = 4323 个细胞）的t -SNE 可视化突出显示骨骼肌谱系的主要存在，由对应于肌源性祖细胞的簇代表（n = 1625 个细胞，占总细胞群的 37%）在非分裂（n = 1317 个细胞）和有丝分裂（n = 308 个细胞）状态下，成肌细胞（n = 731 个细胞）、肌细胞（n = 1147 个细胞）和肌管（n = 442 个）。此外，间充质和神经谱系分别由两个较小的纤维脂肪形成祖细胞（n = 165 个细胞）和神经祖细胞（n = 213 个细胞）代表。 B.颜色编码聚类的t -SNE 图可视化表明肌源性祖细胞亚簇具有不同的分子特征：“休眠”PAX7^高/CHODL^高/FBN1^高、“激活”CD44^高/CD98 ⁺ /MYOD1 ⁺和“有丝分裂”KI -67 ⁺ /CDK1+/TOP2A。 C. 圆形图说明了人类骨骼肌类器官发育第 12 周时所有簇的聚合细胞间通信网络。圆圈大小与每个小区组中的小区数量成正比，边缘宽度表示通信概率。 D. 肌源祖细胞和成肌细胞对应簇的伪时间排序突出了促进肌源承诺和自我更新的不同发育轨迹。 E. 肌源性祖细胞在体内或体外阶段的发育评分分布的岭图，基于人类参考图谱上调的卫星细胞和胚胎标记之间的差异，在周（Wk）-5-18胚胎和胎儿阶段，年（ Yr)-7–42 成体卫星细胞和骨骼肌类器官（根据 Mavrommatis 等人修改[18]）。
SMO 衍生的骨骼肌祖细胞的体内潜力
1. CD82 阳性骨骼肌祖细胞的 FACS 分离。
  1. 使用 TrypLE Select 在 37°C 下解离 SMO 45 分钟，包括在 25 和 45 分钟后使用 1000 μL 移液器上下移液进行机械解离步骤。第 84 天的 SMO 凸起富含祖细胞（图 3B，第 84 天）。
  2. 每 15-20 分钟上下移液 3-4 次有助于将 SMO 解离成单细胞悬浮液。
  3. 通过添加 3-4 倍体积的 TrypLE Select 来停止 FACS 缓冲液的反应。
  4. 通过 40 μm 细胞滤网过滤丢弃细胞团块，然后进行离心步骤。
  5. 在 FACS 缓冲液中用 PE 抗人 CD82 抗体和 APC 抗人 CD56 (NCAM) 抗体标记细胞（100 μL FACS 缓冲液中每种抗体 5 μL，用于 1 × 10 ^{6 个}细胞），并将细胞悬浮液在冰上孵育1 小时，然后在室温下以 400 rpm 离心 5 分钟。
  6. 在补充有 DAPI 的 FACS 缓冲液中重悬细胞。
  7. 使用未染色的 SMO 细胞作为基线对照，以排除自发荧光，并使用 FACS 分选器对染色细胞进行分选（图 3C）。
  8. 使用 Summit 软件捕获 FACS 数据并使用 Kaluza Analysis 软件进行分析。
2. CD82阳性细胞的移植。
  1. 在移植前 24 小时注射 10 μL CTX (40 ng/mL)，对 2-3 个月大的雄性 HsdCpb:NMRI-Foxn1nu 小鼠的胫骨前 (TA) 肌肉造成损伤。
  2. 在麻醉下，将 1 × 10 ^{5 个}细胞注射到小鼠一侧的 TA 肌肉中。
    
    注意：注射的应用有条不紊，如 Feige & Rudnicki [27]，图 4 所示。
  3. 六周后，处死小鼠并隔离 TA。
  4. 将 TA 固定在 4% PFA（PBS 中）中，然后嵌入 OCT 复合介质中。
  5. 使用 CryoStar NX50 将嵌入的 TA 切成 10-20 μm 厚度的横截面。
  6. 用 PBS 对切片进行再水合，在柠檬酸盐缓冲液中加热（最终浓度 19 nM，混合 82 mL 柠檬酸钠溶液和 18 mL 柠檬酸溶液加 900 mL ddH ₂ O）直至缓冲液沸腾，并在 95 ℃ 下连续煮 15 分钟。 °C 用于抗原热修复。
  7. 用 AffiniPure Fab 片段山羊抗小鼠 IgG 在室温下处理切片 60 分钟，以防止非特异性结合。
  8. 在 PBS 中使用 1%（体积/体积）Triton X-100 和 125 mM 甘氨酸在 RT 下透化切片 20 分钟。
  9. 在 RT 下用封闭缓冲液封闭 60 分钟后，将载玻片与一抗在 4 °C 下孵育过夜。
  10. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟后，将载玻片与二抗在 RT 下孵育 2 小时。
  11. 使用 Zeiss Scan.Z1 扫描载玻片并使用 Zen Lite Blue 对其进行处理（图 3D）。
图 3. 骨骼肌类器官 (SMO) 衍生的骨骼肌祖细胞的体内潜力。 A. 分化方案的图示，包括培养基添加和因子孵育的时间线（C：CHIR99021，L：LDN193189，F：bFGF，H：HGF，R：视黄酸，S：Sonic hidehog，W：WNT1A）。 B. iPSC 衍生的 SMO 在 84 天培养期的选定日期的明场显微镜图像（比例尺：100 μm）。 C. 类器官来源的 CD82 阳性骨骼肌祖细胞的 FACS 和 D. 移植到免疫缺陷小鼠 CTX 损伤的胫骨前肌后 6 周进行的评估 [用 huLamin A/C（绿色）、肌营养不良蛋白（红色）、DAPI 染色）（蓝色的）;比例尺 50 μm]。

协议验证

该协议的可重复性已在相应文章 Mavrommatis 等人的各个段落中进行了描述。（2023）。使用具有独立遗传背景的 6 个 hiPSC 系对类器官方法进行了评估，每个系具有超过 5 个独立衍生，而对照系 (CB CD34+) 具有超过 20 个衍生，总是获得相似的结果。类器官在其发育过程中显示出非常可重复的尺寸（Mavrommatis 等人的图 1B [18]）。为了进一步评估类器官发育的可重复性，在早期阶段应用了基于 qPCR 的 32 个基因表达分析的扩散图分析，并对来自四个独立 iPSC 系的类器官发育成熟阶段的 scRNAseq 数据集进行了综合分析。数据表明，所有状态下的肌源性祖细胞以及骨骼肌肌纤维、纤维脂肪祖细胞和神经祖细胞相关簇都具有高度保守的簇表示（图 4，补充图 6，Mavrommatis 等人[18]）。

数据分析

Mavrommatis 等人制作的 RNA 测序数据集。 2020、2023 [17,18] 保藏在基因表达综合数据库 (GEO) 中，登录号为 GSE147514。要查看 GEO 登记号 GSE147514：请转至https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE147514。

致谢

我们感谢相应 eLife (2023) 手稿的所有共同作者在项目开发过程中做出的贡献和支持。该协议的建立得到了波鸿鲁尔大学医学院 FoRUM F873-16、Deutsche Gesellschaft für Muskelkranke eV（DGM 基金会）、弗莱堡和 Deutsche Duchenne Stiftung、Duchenne Deutschland eV 的研究资助的支持

利益争夺

作者声明，本文的发表不存在利益冲突。

道德考虑

所有动物实验均经地方当局批准 (81-02.04.2020.A476)，并按照动物护理和使用道德行为准则进行。

参考

Sterneckert, JL、Reinhardt, P. 和 Schöler, HR (2014)。使用干细胞模型研究人类疾病。纳特。吉内特牧师。 15（9）：625-639。https://doi.org/10.1038/nrg3764
Borchin, B.、Chen, J. 和 Barberi, T. (2013)。从人多能干细胞中衍生和 FACS 介导的 PAX3+/PAX7+ 骨骼肌前体的纯化。干细胞报告1(6)：620–631。https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2013.10.007
Chal, J.、Oginuma, M.、Al Tanoury, Z.、Gobert, B.、Sumara, O.、Hick, A.、Bousson, F.、Zidouni, Y.、Mursch, C.、Moncuquet, P. ，等人。（2015）。多能干细胞分化为肌纤维以模拟杜氏肌营养不良症。纳特。生物技术。 33（9）：962-969。https://doi.org/10.1038/nbt.3297
Chal, J.、Al Tanoury, Z.、Hestin, M.、Gobert, B.、Aivio, S.、Hick, A.、Cherrier, T.、Nesmith, AP、Parker, KK、Pourquié, O. 等等人。（2016）。在体外从人类多能干细胞产生人类肌肉纤维和卫星样细胞。纳特。协议。 11（10）：1833-1850。https://doi.org/10.1038/nprot.2016.110
Hicks, MR、Hiserodt, J.、Paras, K.、Fujiwara, W.、Eskin, A.、Jan, M.、Xi, H.、Young, CS、Evseenko, D.、Nelson, SF 等。（2017）。 ERBB3 和 NGFR 标志着人类发育和 hPSC 中独特的骨骼肌祖细胞。纳特。细胞生物学。 20（1）：46-57。https://doi.org/10.1038/s41556-017-0010-2
Shelton, M.、Metz, J.、Liu, J.、Carpenedo, RL、Demers, SP、Stanford, WL 和 Skerjanc, IS (2014)。来自人和小鼠胚胎干细胞的 PAX7 阳性肌肉祖细胞的衍生和扩增。干细胞报告3(3)：516–529。https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.07.001
Xi, H.、Young, CS 和 Pyle, AD (2020)。生成 PAX7 报告细胞以研究人类多能干细胞的骨骼肌生成。 STAR 协议。 1（3）：100158。https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.100158 [HZ1]
Kim, H. 和 Perlingeiro, RCR (2022)。从多能干细胞产生人类肌原祖细胞，用于体内再生。细胞。摩尔。生命科学。 79（8）：406。https ://doi.org/10.1007/s00018-022-04434-8
Chien, P.、Xi, H. 和 Pyle, AD (2022)。使用人类多能干细胞在体外重现人类肌生成。过期。细胞。资源。 411（2）：112990。https ://doi.org/10.1016/j.yexcr.2021.112990
Yan, L.、Rodriguez-delaRosa, A. 和 Pourquié, O. (2021)。多能干细胞体外生产人类肌肉：基础和临床应用。塞明。细胞开发。生物。 119：39-48。https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2021.04.017
Cuny, GD, Yu, PB, Laha, JK, Xing, X., Liu, JF, Lai, CS, Deng, DY, Sachidanandan, C., Bloch, KD, Peterson, RT 等。（2008）。骨形态发生蛋白（BMP）信号抑制剂的构效关系研究。生物组织。医学。化学。莱特。 18（15）：4388-4392。https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2008.06.052
Gouti, M.、Tsakiridis, A.、Wymeersch, FJ、Huang, Y.、Kleinjung, J.、Wilson, V. 和 Briscoe, J. (2014)。神经中胚层祖细胞的体外生成揭示了 Wnt 信号传导在脊髓和近轴中胚层身份规范中的独特作用。公共科学图书馆生物学。 12(8)：e1001937。https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1001937
Mashinchian, O.、Pisconti, A.、Le Moal, E. 和 Bentzinger, CF (2018)。肌肉干细胞在健康和疾病中的地位。电流。顶部。开发。生物。 126：23-65。https://doi.org/10.1016/bs.ctdb.2017.08.003
Relaix, F.、Bencze, M.、Borok, MJ、Der Vartanian, A.、Gattazzo, F.、Mademtzoglou, D.、Perez-Diaz, S.、Prola, A.、Reyes-Fernandez, PC、Rotini, A.和塔列蒂。（2021）。骨骼肌干细胞的观点。纳特。交流。 12（1）：1-11。https://doi.org/10.1038/s41467-020-20760-6
Fatehullah, A.、Tan, SH 和 Barker, N. (2016)。类器官作为人类发育和疾病的体外模型。纳特。细胞生物学。 18（3）：246-254。https://doi.org/10.1038/ncb3312
马萨诸塞州兰开斯特和日本诺布里奇 (2014)。培养皿中的器官发生：使用类器官技术模拟发育和疾病。科学345(6194)：e1247125。https://doi.org/10.1126/science.1247125
Mavrommatis, L.、Jeong, HW、Kindler, U.、Gomez-Giro, G.、Kienitz, MC、Stehling, M.、Psathaki, OE、Zeuschner, D.、Gabriele Bixel, M.、Han, D.,等人。（2020）。人类骨骼肌类器官模拟胎儿肌发生并维持未承诺的 PAX7 肌源祖细胞。bioRxiv： 295832。https ://doi.org/10.1101/2020.09.14.295832
Mavrommatis, L.、Jeong, HW、Kindler, U.、Gomez-Giro, G.、Kienitz, MC、Stehling, M.、Psathaki, OE、Zeuschner, D.、Bixel, MG、Han, D. 等。（2023）。人类骨骼肌类器官模拟胎儿肌发生并维持未承诺的 PAX7 肌源祖细胞。eLife 12：RP87081。https://doi.org/10.7554/eLife.87081.3
Faustino Martins, JM、Fischer, C.、Urzi, A.、Vidal, R.、Kunz, S.、Ruffault, PL、Kabuss, L.、Hube, I.、Gazzerro, E.、Birchmeier, C. 等等人。（2020）。自组织 3D 人体躯干神经肌肉类器官。细胞干细胞26(2)：172–186.e6。https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.12.007
Shahriyari, M.、Islam, MR、Sakib, SM、Rinn, M.、Rika, A.、Krüger, D.、Kaurani, L.、Gisa, V.、Winterhoff, M.、Anandakumar, H. 等。（2022）。工程骨骼肌再现了人类肌肉的发育、再生和营养不良。J. 恶病质肌肉减少症13(6): 3106–3121。https://doi.org/10.1002/jcsm.13094
Shin, MK、Bang, JS、Lee, JE、Tran, HD、Park, G.、Lee, DR 和 Jo, J. (2022)。从人类多能干细胞生成骨骼肌类器官以模拟肌生成和肌肉再生。国际。 J.莫尔。科学。 23（9）：5108。https://doi.org/10.3390/ijms23095108
Dorn, I.、Klich, K.、Arauzo-Bravo, MJ、Radstaak, M.、Santourlidis, S.、Ghanjati, F.、Radke, TF、Psathaki, OE、Hargus, G.、Kramer, J. 等等人。（2014）。人诱导多能干细胞的红系分化与来源的供体细胞类型无关。血液学100(1)：32-41。https://doi.org/10.3324/haematol.2014.108068
Mavrommatis, L.、Zaben, A.、Kindler, U.、Kienitz, MC、Dietz, J.、Jeong, HW、Böhme, P.、Brand-Saberi, B.、Vorgerd, M.、Zaehres, H.,等人。（2023）。 LGMD2A/R1 患者来源的诱导多能干细胞和骨骼肌祖细胞中的 CRISPR/Cas9 基因组编辑。干细胞国际。 2023 年：1-17。https://doi.org/10.1155/2023/9246825
Park, IH、Arora, N.、Huo, H.、Maherali, N.、Ahfeldt, T.、Shimamura, A.、Lensch, MW、Cowan, C.、Hochedlinger, K. 和 Daley, GQ (2008)。疾病特异性诱导多能干细胞。细胞。134（5）：877-886。https://doi.org/10.1016/j.cell.2008.07.041
Panopoulos, AD、D'Antonio, M.、Benaglio, P.、Williams, R.、Hashem, SI、Schuldt, BM、DeBoever, C.、Arias, AD、Garcia, M.、Nelson, BC 等。（2017）。 iPSCORE：222 个 iPSC 细胞系的资源，可对多种细胞类型的遗传变异进行功能表征。干细胞报告8(4)：1086–1100。https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2017.03.012
Burridge, PW、Thompson, S.、Millrod, MA、Weinberg, S.、Yuan, X.、Peters, A.、Mahairaki, V.、Koliatsos, VE、Tung, L.、Zambidis, ET 等。（2011）。用于人类诱导多能干细胞高效心脏分化的通用系统，可消除行间变异。《公共科学图书馆一号》 6(4)：e18293。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018293
Feige, P. 和 Rudnicki, MA (2020)。分离卫星细胞并移植到小鼠中以进行肌肉谱系追踪。纳特。协议。 15（3）：1082-1097。https://doi.org/10.1038/s41596-019-0278-8