材料和试剂

所有材料和试剂均保持在室温下。

1. 96 孔板，650 µL，透明聚苯乙烯，方形孔，平底（Whatman，目录号：7701-1651 ）

2. MicroAmp 光学胶膜（Applied Biosystems，目录号：4311971）

3. 12 通道移液器，可在 20 至 300 µL 范围内进行可变容量调节（任何供应商）

4. 50 mL试剂容器（ Genesee Scientific，目录号： 28-125BX）

5. 100 mm × 15 mm圆形培养皿（Biopioneer，目录号：GS82-1473-001）

6. 塑料移液管，7 mL ，无刻度（VWR，目录号：490016614）

7. PCR粘合剂密封涂药器（Thermo Fisher Scientific，目录号：AB1391）

8. TLAB 杂交菌株的斑马鱼幼虫 (4-dpf)

9. NaCl（任何供应商）

10. KCl（任何供应商）

11. CaCl ₂·2H ₂O（任何供应商）

12. MgCl ₂·7H ₂O（任何供应商）

13. 亚甲蓝水合物（Sigma，目录号：66720）

14. 斑马鱼胚胎的 E3 培养基（见食谱）

15. 亚甲蓝溶液（见配方）

16. 蓝色 E3 培养基溶液（见配方）

设备

1. ZebraBox 视频跟踪系统（Viewpoint Life Sciences, Inc.，型号：ZebraBox，第 4^代）（图 2）

2. 带明场照明的立体显微镜（任何供应商）

图 2. 用于监测斑马鱼幼虫行为的高通量视频跟踪系统。

软件

1. ZebraLab（观点生命科学公司）

2. MATLAB（Mathworks， https ://mathwork.com ）

3. 自定义 MATLAB 脚本（Prober Lab， https://github.com/proberlab/videotracker-scripts ）

4. Excel（微软， https://office.microsoft.com/excel/ ）

5. 棱镜（GraphPad 软件， https: //graphpad.com/ ）

程序

A. 溶液制备

提前准备 E3、亚甲蓝和蓝色 E3 溶液。本协议末尾提供了食谱。

B. 动物处理

根据当地机构动物护理和使用委员会的建议饲养动物。注意尽量减少压力以确保动物的健康并最大限度地提高行为实验的可重复性。

1. 在计划开始行为实验的前五天，在下午或晚上设置喂养良好的性成熟成年斑马鱼对的交配池，并用分隔线分隔雄性和雌性鱼。请参阅关于实验设计的注释 1、2 和 3 。

2. 第二天早上，取下隔板并倾斜水箱以鼓励斑马鱼交配。

3. 在蓝色 E3 胚胎培养基中收集斑马鱼胚胎，并用系统水冲洗干净以去除碎屑。

4. 斑马鱼胚胎放入 100 mm × 15 mm 培养皿中，浸入蓝色 E3 中，每个培养皿不超过 50 个胚胎，在 14 小时光照下培养：在 28.5°C 的黑暗条件下培养 10 小时。使用来自超过 100 个胚胎的大型健康离合器中的胚胎，以便可以在实验和对照兄弟姐妹之间进行比较。

5. 在受精后 24 小时 (hpf)，仔细检查所有培养皿并清除碎片和未受精的胚胎，因为这些会导致过度的压力并影响发育和行为。

6. 在 48 hpf 时，仔细检查所有培养皿并清除碎屑。

7. 在 72 hpf 时，仔细检查所有培养皿并从孵化的胚胎中取出绒毛膜碎片。将蓝色 E3 介质更改为标准 E3 介质。

8. 在 4 dpf (~100-110 hpf) 时，为视频跟踪实验设置动物和试剂。首先，在立体显微镜下检查斑马鱼的健康状况。斑马鱼应该用充气的鱼鳔直立游泳（图 3 和 4A）。不要使用鱼鳔未膨胀的幼虫或侧卧的幼虫。不应使用带有大量未膨胀鱼鳔的幼虫的离合器。

图 3. 带有充气鱼鳔的 5 dpf 斑马鱼幼虫示例。

图 4. 动物处理的工作流程总结。

A. 第 8 步：确保斑马鱼幼虫健康。 B. 第 11 步：将动物轻轻转移到 96 孔板中。 C. 第 12 步：在将 96 孔板放入视频跟踪装置之前，在立体显微镜下检查所有动物是否健康。 D. 第 14 步：密封 96 孔板以防止蒸发。每口井中应有一条斑马鱼幼虫。红色高亮表示视频跟踪系统检测到运动活动的动物。有气泡或不止一种动物的井被排除在分析之外。图 4 是使用 BioRender.com 创建的。白色比例尺（内孔） ≈ 8.5 mm。

9. 用加热到 28.5°C 的 E3 介质填充 50 mL 试剂容器。

10. 使用 12 通道移液器轻轻填充平底方孔 96 孔板（每孔体积为 650 μL），每孔使用 600 μL 的 E3 培养基。小心不要将气泡引入孔中，因为它们会产生视频跟踪伪影。见注 4 在实验设计中使用药物。

11. 使用一次性移液管（图 4B）将单个健康幼虫轻轻放入 96 孔板的每个方形孔中。

12. 使用立体显微镜检查每口井，以确保所有动物看起来健康、直立且鱼鳔膨胀（图 4C）。

13. 将 E3 培养基添加到每口井中，使其在每口井的顶部凸出，但不要过多以致表面张力破裂并与相邻井汇合。

14. 使用密封涂抹器用光学胶膜密封 96 孔板。用于密封板的薄膜类型非常重要，因为一些密封件会阻止 O ₂渗透或以其他方式有毒。 E3 培养基会溢出 96 孔板的侧面，但如果小心操作，大多数孔中应该没有气泡。密封良好的板的图像如下所示（图 5）。请参阅关于在实验设计中使用密封件的注释 5。

替代步骤：步骤 13 和 14 可以省略，在这种情况下，应将 E3 培养基添加到每个孔的顶部，而不会产生凸起。这对于视频跟踪器很重要，可以准确跟踪动物的运动。由于蒸发，每天应向每口井添加新鲜的 E3 培养基。我们通常在早上开灯后不久执行此操作。当需要在实验期间接触鱼时（例如，在实验期间向孔中添加药物），使用开放式板（视频 1）很有用。

视频 1. 使用具有以下参数的量化模式监测的未密封 96 孔板示例：检测灵敏度，25；爆发（大动作的阈值），900；冻结（没有运动的阈值），10；积分周期（bin 大小），60 秒。

双击播放视频。红色高亮表示视频跟踪系统检测到运动活动的动物。

C. 视频跟踪实验

我们使用来自 Viewpoint Life Sciences, Inc. 的商业视频跟踪系统 ZebraBox 来监测 4-8 dpf 的斑马鱼行为。自参考文章发表（Lee等人，2017 年）以来，已经开发了较新版本的 ZebraBox ，我们在此提供使用第四代 Zebrabox 的指南（截至本文撰写时 2021 年春季的最新版本）。与以前的版本一样，第四代 Zebrabox 包含一个封闭系统，配备固定角度镜头的高分辨率相机和透射红外光的滤光片。标准行为实验的白光照明水平在白天设置为约 1,200 勒克斯。我们使用定制的腔室，允许 96 孔板浸入 28.5°C 的循环水中，以保持恒定和最佳温度，这对于稳定的睡眠/唤醒周期至关重要（见注 6）。 ZebraBoxes 应放置在安静且气候可控的房间内，以确保行为实验的可重复性。来自两个 Zebrabox 的视频跟踪数据可以由一台计算机记录，从而允许同时并行使用两个 96 孔板。

1. 在将 96 孔板放入 ZebraBox 之前，确保腔室内的蒸馏水清洁并在 28.5°C 下连续循环。这很重要，因为水中的漂浮碎片可能会在视频跟踪数据中产生运动伪影。

2. 将 96 孔板放置在 ZebraBox 室内，并确保板牢固且不浮动。

3. 在 ZebraBox 随附的计算机上打开视频跟踪软件 (ZebraLab; Viewpoint Life Sciences)。

4. 对于大多数实验，我们使用具有以下参数的量化模式：检测灵敏度：25；爆发（大动作的阈值）：900；冻结（不移动的阈值）：10；积分周期（bin 大小）：60 秒（视频 1）。但是，这些值仅作为指导，必须针对每个 ZebraBox 凭经验确定。

确定这些参数的值涉及信噪比的校准，重点是减少假阳性信号。为此，可以增加检测灵敏度值（即，该像素注册为已更改其值所需的像素强度变化）或增加冻结阈值（即，每个位置的像素数需要从一帧更改为下一帧，以便将该位置视为记录运动）。必须针对每个 ZebraBox 凭经验校准检测灵敏度和冻结阈值。为了确定这些值，我们使用一个 96 孔板，其中包含自由游泳的幼虫和使用 0.016% w/v 三卡因麻醉的幼虫，并在每个检测灵敏度和冷冻阈值下记录 1-3 小时（鱼因此麻醉将持续长达 8 小时而不分解）。然后，我们分析数据以确定麻醉鱼使用这些参数中的每一个产生的假阳性信号的水平。在我们手中，麻醉鱼的“运动”（60 秒箱）偶尔值低于 0.5 秒是可接受的假阳性信号。如果观察到更高的水平，增加灵敏度值或冻结阈值可以降低噪声；然而，这也会降低检测非麻醉鱼真实运动的能力。如果视频跟踪器需要比此处提到的更高的检测灵敏度/冻结值以确保低噪音，我们建议维修机器。

5. 打开网格界面，该界面用绿色框覆盖每个井。将网格接口与 96 孔板的方形孔对齐（图 5）。

图 5.网格界面示例（绿色），覆盖将监控行为的单独区域（主图）。

PCR粘合剂密封从左到右施加在板的顶部。大多数气泡出现在最初应用密封的一侧。由于分别存在气泡或多个动物，标有星号的井将被排除在分析之外。此类孔的示例被放大并显示在左侧。红色高亮表示视频跟踪系统检测到运动活动的动物。白色比例尺（内孔） ≈ 8.5 mm。

6. 将白灯编程为在所需时间打开和关闭。我们通常将它们设置为在上午 9 点打开并在晚上 11 点关闭，因为这些是饲养动物的照明条件。无论白灯是打开还是关闭，该腔室都被红外光持续照亮，以便进行视频跟踪。

7. 在 ZebraLab 软件界面上对实验的长度进行编程。行为实验通常从 4 dpf 开始，到 7 dpf 结束。

8. 将每个实验的 ZebraLab 软件协议保存在计算机上的文件夹中。命名并保存将生成的原始数据文件。

9. 使用 ZebraLab 软件用户界面开始行为实验。

10. 允许行为实验运行其计划的时间课程（例如，48-72 小时）。

11. 结束 ZebraLab 上的行为实验并允许编译数据。生成包含运动活动和不活动原始数据的大型 .CSV 或 .XLS 文件。将 96 孔板上的绿色网格叠加屏幕截图作为质量控制步骤，以确保为每个孔收集的数据被限制在其指定的孔中，并且没有转移到与相邻孔重叠的位置。

12. 从 ZebraBox 中取出 96 孔板并使用立体显微镜对其进行检查。注意含有气泡或看起来不健康的动物（例如，未充气的鱼鳔）的井，并将这些井排除在分析之外。

13. 使用 PCR 对动物进行基因分型，或者，如果适用，使用荧光立体显微镜基于荧光标记的存在或不存在。有关实验设计的相关评论，请参见注释 7 和 8。

数据分析

为了分析每只动物的睡眠和唤醒行为，我们使用基于先前版本的自定义 MATLAB 脚本（Prober等人，2006；Lee等人，2017、2020；Oikonomou等人，2019）。 VTs_to_DATA_middur.m 脚本从 Viewpoint 软件生成的 .CVS/.XLS 文件中提取 middur 值，并将其组织在一个矩阵中，其中每列是一条鱼，每一行是一个时间箱。矩阵的最后一列是 Zeitgeber 时间 (ZT)。 VT_analysis.m 脚本提取每条鱼每天和晚上的活动、清醒活动、睡眠和睡眠结构（睡眠次数、睡眠时间和睡眠潜伏期）数据，绘制每种基因型的结果（有或没有SEM 着色），并将结果保存在 .mat 文件中。

自定义分析脚本安装

1. https://github.com/proberlab/videotracker-scripts )下载自定义分析脚本。 HYPERLINK "https://github.com/proberlab/videotracker-scripts"

2. 为您希望分析的每个实验创建一个文件夹（例如，“/mutantX_20210821”，用于 2021 年 8 月 21 日用突变体 X 鱼进行的实验）。在该文件夹中设置以下文件夹结构（您可以编辑脚本以根据需要更改文件夹方案）：

/分析_输出

/data_original

/matalab_code

/matlab_data_processed

3. 将“VT_analysis.m”和“VTs_to_DATA_middur.m”脚本放在“/matalab_code”文件夹中。其他脚本是由两个主要脚本调用的函数，应放在您的 MATLAB 函数文件夹中。

自定义分析脚本格式化原始数据

来自两个 Zebrabox 的数据通常记录在一台计算机上，允许同时收集来自两个 96 孔板或多达 192 只动物的数据。因此，输出数据以 1-192 孔格式呈现。

1. 在 TextEdit 或类似的文本编辑器中打开原始 .CSV 或 .XLS 数据文件。复制文件并保存为 UTF-8.TXT 文件。我们通常在文件名后面加上后缀“_UTF8”。我们常用的格式是年-月-日，例如., YY YYMMDD_VT_experiment-name_UTF8.txt，其中 VT 指的是视频跟踪器的编号。此步骤是必要的，因为 MATLAB 无法识别以 UTF-16 格式保存的原始 .CSV 数据文件。将此文件放在 /matlab_data_processed 文件夹中。

在 Matlab 中打开“VTs_to_DATA_middur.m”脚本并更改文件名（“input_file”变量）以匹配您的情况（图 6）：

图 6. Matlab 中“VTs_to_DATA_middur.m”脚本的屏幕截图。

第 7 行中带有紫色标签的文件名表示要更新的输入文件变量。

该脚本提取每条鱼的主要变量（“middur”，每箱移动的秒数）。然后将数据组织在一个矩阵中，每一列代表一条鱼，每一行代表一个时间点。前两列给出了每个 bin 的开始和结束时间（以秒为单位）。最后一列给出了 Zeitgeber 时间 (ZT)，在上午 9 点 (ZT 0) 开灯，在晚上 11 点关灯 (ZT 14)。该脚本将生成一个与输入文件同名且后缀为“_DATA_middur.txt”的 .TXT 文件。这在以下步骤中被称为“数据文件”。

2. [可选]在 Excel 中打开数据文件。此时，您可以手动修剪数据以删除部分天数。例如，如果鱼在 4 dpf 晚上装载，而实验在 7 dpf 早上停止，则可以删除 5 dpf 上午 9 点之前的数据和 7 dpf 上午 9 点之后收集的数据并将文件保存为“ YY YYMMDD_VT_experiment-name_UTF8_TRIMMED.txt”。这个新文件将仅包含开发的第 5 天和第 6 天的完整数据。这使得下游分析和绘图更加简化。

3. 在 Excel 中创建一个文本 (.txt) 文件，指示 96 孔板的每个孔的基因型、处理或条件。例如，如果您的实验包含从杂合突变鱼的杂交中获得的突变幼虫，您的基因分型列表可能如下所示（图 7）：

图 7. Excel 中示例基因分型列表文本文件的屏幕截图。

绿色突出显示的单元格表示应更新的视频跟踪器编号。

单元格 A1： VTBB 指示正在使用的视频跟踪器。例如，实验室中的 1 号视频跟踪器应更新为“VT01”。

第 2 行：这表示每只动物的基因型、治疗或状况，在本例中由纯合野生型、杂合突变体 (Het) 和纯合突变体 (Null) 组成。该文件最多可包含 8 种基因型、治疗或条件。

第 3-14 行：这表明每个孔中的基因型、处理或条件。每种基因型、治疗或状况至少需要三只动物。

我们通常使用格式 YY YYMMDD_VT_genotype_N.txt 命名此文件，其中 YYYYMMDD 指年、月和日期，VT 指视频跟踪器的编号，N 指基因型、治疗或条件的数量。对于上面的示例，适当的文件名是 20210821_10_genotype_3.txt。将此文件放在 /matalab_data_processed 文件夹中。

4. 打开 /matlab_code 文件夹中的“VT_analysis.m”脚本。找到以下部分并更新数据和基因型文件的文件名（图 8）：

图 8. Matlab中“VT_analysis.m”脚本的屏幕截图。

第 9 行和第 10 行中的紫色标记文件名表示需要更新的数据和基因型文件名。

5. 如 C 节第 4 节所述，视频跟踪器会出现一些误报运动信号（理想情况下，每 60 秒时间段不超过 0.5 秒）。尽管这对量化的运动活动量的影响可以忽略不计，但它会显着扭曲睡眠水平。为了纠正这一点，我们在将活动水平转换为睡眠时使用 0.5 到 1 的截止值（图 9）。例如，截止值为 1 意味着任何 60 秒的 bin 移动时间小于 1 秒都被视为睡眠。对于不同的硬件设置，该值可能不同，每个 ZebraBox 都需要针对 C 部分第 4 步中讨论的参数进行校准。

图 9. Matlab中“VT_analysis.m”脚本的屏幕截图。

第 12 行的输入表示需要为每个 ZebraBox 凭经验确定的截止值。

6. 单击“运行”以运行脚本。

7. 该脚本提取每条鱼和每个白天和黑夜时段的运动活动、清醒活动（清醒时的运动活动量）、睡眠和睡眠结构（睡眠周期数、睡眠周期持续时间和光转换后的睡眠潜伏期）数据。它绘制了每个基因型的结果（图 10 是一个示例），并以不同的图像文件格式保存图，并将结果保存在 .mat 文件中。这些文件保存在“/analysis_output”文件夹中。

图 10. 在 24 小时实验期间比较突变型和野生型兄弟姐妹之间睡眠的示例睡眠图输出。

夜晚以灰色阴影表示。 n 表示每种基因型的动物数量。在此示例中，突变动物的睡眠时间少于其野生型同胞对照。

行为数据的统计分析

1. 要准备用于统计分析的行为数据，请打开。 MATLAB 中的 MAT 汇总数据文件。

2. 在 MATLAB 工作区中，将出现一个标有“genox”的图标。双击此图标（图 11）。

图 11. 屏幕截图。 Matlab 中的MAT汇总数据文件和“genox”图标。

3. 将出现以下信息（图 12）：

.MAT 摘要数据文件中的 Matlab 数据表的屏幕截图。

红色箭头表示接下来要打开的“summarytable”图标。

Matlab 数据为 .MAT 文件

数据集组织如下：

名称：每个 [cell] 包含基因型名称。数据集的保存顺序与基因型文件中列出的顺序相同。

数据：每个 [cell] 包含 anxm 数据集，其中 n 是每个时间点（行）的一分钟 middur 数据，m 是每个孔（列）。

fishID：每个 [cell] 包含一个数组，其中包含每个基因型的井号。

Zeitgeber：实验的时间数据，0 = 开灯，14 = 关灯。

Lightschedule：时间数据的地图，用 1 标记通宵时间点，用 0 标记全天时间点。

时间：从实验开始的分钟数。

Daynumber：时间数据的地图，标记每个时间点的实验的每一天（1、2、3等）。

Lightboundries ：用 1 标记夜晚：白天转换和白天：夜晚转换。所有其他数据点均为 0 秒。

Tenminute：与 Data 相同，除了 middur 数据在 10 分钟 bin 中求和。

Avewaking ：与数据相同，但所有 0 个 bin 都标记为 NaN。

Avewakechart1h ：与数据相同，但仅对每 1 小时测量的活动分钟数进行平均。

Avewakechart_10min ：与数据相同，但在每 10 分钟测量中仅平均活动分钟数。

睡眠：每个 [cell] 包含一个 n × m 数据集，其中 n 表示每个时间点（行）的一分钟唤醒或睡眠状态，m 是井（列）。醒着的每一分钟用 0 表示，睡眠的每一分钟用 1 表示。

Sleepchart1h ：与 Sleep 相同，只是数据在 1 h bin 中求和。

Sleepchart_10min ：与 Sleep 相同，只是数据在 10 分钟的 bin 中求和。

连续性：与睡眠相同，只是每次睡眠回合的长度会逐渐增加，并在鱼移动时重置为 0。例如，如果一条鱼处于活动状态，则睡眠连续性值为 0。回合的第一个睡眠分钟为 1，第 2^分钟为 2，第 3^分钟为 3，等等。

Sleepboutstart ：与 Sleep 相同，只是每个回合的第一个睡眠分钟标记为 1。所有其他点都是 0 秒。

睡眠潜伏期：在每一天：夜晚和夜晚：白天的过渡中，它会将所有活动分钟标记为 1，直到第一次睡眠回合。所有其他数据为 0。

摘要表：具有按基因型和/或条件分隔的几个部分，并重新捕获以上述表格格式找到的摘要信息，详细信息见下文。

4. 单击“summarytable”图标（图 12）。将出现以下信息（图 13）：

genox.summarytable中的 Matlab 数据表的屏幕截图。

这些表格提供了每个基因型和/或总睡眠状况、睡眠发作次数、平均睡眠发作长度、睡眠潜伏期、清醒活动和所测量的每个白天和夜间的总运动活动的综合总结。一些参数，例如“睡眠”，以每个白天或夜间时段的总量进行描述，或者在“hourly_sleep”表中以每小时平均睡眠分钟数进行描述。

5. 如果需要，将相关数据从 MATLAB 的“汇总表”复制并粘贴到 Excel 中，并根据需要进行组织。

6. 使用统计分析来确定数据是正态分布还是非正态分布，然后进行适当的统计检验和校正以进行多重比较。为此，我们通常使用统计软件包 Prism。参见实验设计注 9。

笔记

1. 注意点：对于使用突变动物的实验，对杂合突变鱼进行交叉，以比较纯合野生型、杂合突变和纯合突变同胞幼虫的行为，以尽量减少因遗传背景引起的变异。

2. 注意点：对于使用转基因动物的实验，应将杂合转基因动物与同一亲本菌株（通常是 TLAB）的非转基因动物进行异交，以比较转基因和非转基因同胞幼虫的行为。

3. 注意点：我们观察到不同的常用斑马鱼品系在睡眠行为方面表现出很大差异，因此在比较幼虫的实验组和对照组时应使用相同的背景品系。

4. 对于测试特定药物对睡眠影响的实验，可以在实验期间使用未密封的板将药物直接添加到孔中（Rihel等人，2010a）。或者，如果需要使用密封板，可以在实验开始时添加药物，尽管这需要包含分隔不同处理条件的空井行，因为药物可能会在密封过程中转移到相邻的孔中。我们观察到罕见的情况，其中药物对密封板中的睡眠的影响与开放板中的不同。大多数药物被制备成溶解在 DMSO 中的储备溶液，并在 E3 培养基中稀释至最终所需浓度。大多数药物的有效浓度在 100 nM 和 1 mM 之间。 DMSO 的最终浓度不应超过 0.1%，因为 DMSO 本身在以较高浓度使用时会影响行为。

5. 使用密封板有利有弊。使用密封板时，维护实验的工作量较少，因为每孔的培养基不会蒸发，因此不必每天向每孔添加 E3 培养基。因此，与未密封板相比，密封板中的药物和盐浓度在实验过程中保持更稳定。每天向未密封板添加培养基也会引起行为伪影，在使用密封板时可以避免这种现象。此外，睡眠/唤醒周期更加稳健，并且使用密封板可以保持更长的时间，这对于扩展到 7 或 8 dpf 的实验特别有用。然而，如上所述，密封板不能用于急性药物扰动，并且在极少数情况下，与未密封板相比，药物在密封板中引起不同的行为影响，这可能是由于药物与密封粘合剂的反应。密封板的其他缺点是鱼暴露在密封粘合剂中，在实验过程中 E3 介质中的氧气水平可能会降低，并且由于存在气泡，通常必须将某些井排除在分析之外。

6. 注意点：斑马鱼应在 28.5 °C下饲养和进行行为分析。高于或低于该温度2 °C的差异可能会对睡眠产生不利影响。建议使用在 ZebraBox 内的 96 孔板下方和周围循环 28.5 °C水的水浴，以保持恒定、均匀和最佳的温度。

7. 由于睡眠等行为的可变性，我们通常在每个实验中每个基因型或条件下至少需要 15 只动物，并且我们尽可能在相同长大的兄弟姐妹之间进行比较。当每种基因型或条件使用少于 15 只动物时，可能难以在组之间做出有意义的推论。

8. 警告点：为了尽量减少偏差，行为实验应在可能的情况下对基因型视而不见，在每次实验后使用 PCR 或荧光标记对动物进行基因分型。

9. 在得出任何结论之前，我们通常使用相同的处理条件进行至少三个独立的实验。

食谱

1. E3 培养基 60 ×原液（1 L）

17.29 克氯化钠

0.76 克氯化钾

2.9克CaCl ₂·2H ₂O

4.9g MgCl ₂·7H ₂O

准备一个 60 × 库存，将成分溶解在最终体积为 1 L 的纳米纯水中。用 NaOH 将 pH 值调节至 7.0。高压灭菌器。要制备 1 ×工作溶液，请使用纳米纯水将 333 mL 的 60 ×库存稀释至 20 L 的最终体积。让它在室温下过夜混合。第二天用碳酸氢钠或乙酸将 pH 值调节至 6.8-7.0 。

2. 亚甲蓝溶液（1 g/L 库存）

要制备亚甲蓝原液，请将 1 克水合亚甲蓝 (Sigma) 溶解在 1 L 水中。

3. 蓝色 E3 中液

在上述 20 L 的 1 × E3 培养基中，加入 20 mL 的 1% 亚甲蓝（作为抗真菌剂）并充分混合。

致谢

该协议基于 Jason Rihel、David Prober 和 Alexander Schier （Prober等人，2006；Rihel等人，2010b）开发的方法，随后根据实验和分析进展进行了更新（Lee等人，2017、2019和 2020 年；Oikonomou等人，2019 年）。这项工作得到了 NIH (DAL: K99NS097683, F32NS084769; GO: F32NS082010; DAP: R35NS122172, R01MH121601)、NARSAD 青年研究员补助金 (DAL: 25392) 和加州理工学院 BBE 博士后奖学金 (DAL) 的资助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

涉及斑马鱼的畜牧业和实验是根据加州理工学院机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 指南和加州理工学院实验动物资源办公室 (动物协议 1580) 进行的。

参考

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