材料和试剂

1. PCR管（Denville Scientific，目录号：C18064）

2. 耐氯仿的15 mL离心管（Falcon，目录号：352196）

3. 低蛋白结合管（Thermo Fisher Scientific，目录号：90410）

4. 50 mL 试剂容器（Corning，目录号：4870）

5. 96孔U型底测定板（Falcon，目录号：353910）

6. C18 47 mm提取盘（ Empore，目录号：2215-C18）

7. Sep-Pak C18 50 mg 吸附剂小柱（Waters，目录号：WAT054960）

8. SOLA HRP 10 mg Sep-Pak 药筒（Thermo-Fisher，目录号：03-150-391）

9. 放射自显影胶片（Ece Scientific，目录号：E3018）

10. 用于制备 StageTip 的柱塞（Hamilton，目录号：1122-01）

11. mColorpHast pH（2.0-9.0）测试条（MilliporeSigma，目录号：109584）

12. Amersham Hybond 0.45 µm PVDF（GE，目录号：10600023）

13. 35 cm Sepax GP-C18 树脂（1.8 µm，150 A，Thermo Fisher Scientific）

14. MDA-MB-468 细胞（ATCC，目录号：HTB-132）

15. 液氮

16. 10 × Tris缓冲盐水（Boston BioProducts，目录号：BM-300）

17. EPPS（Sigma，目录号：E9502）

18. 十二烷基硫酸钠（Sigma，目录号：L3771）

19. NaCl（Fisher Chemical，目录号：S671）

20. 1 M Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5（ThermoFisher，目录号：15567027）

21. Tris碱（Fisher Chemical，目录号：BP152-500）

22. 甘氨酸（Millipore-Sigma，目录号：56-40-6）

23. MOPS（Sigma，目录号：M5162）

24. 氢氧化钠（VWR，目录号：BDH7225）

25. 磷酸氢二钠（Sigma，目录号：S9763

26. Ni-NTA磁性琼脂糖珠（Qiagen，目录号：36113）

27. Leibovitz 的 L-15 培养基（Gibco，目录号：11415064）

28. TC 处理的 150 mm 培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：168381）

29. 1 × HBSS（Gibco，目录号：14025092）

30. 1 × PBS（康宁，目录号：21-031-CV）

31. 1 ×胰蛋白酶-EDTA，0.25％酚红（Corning，目录号：25-050-Cl）

32. 胎牛血清（GeminiBio，目录号：100-106）

33. 青霉素-链霉素100 ×溶液（Gibco，目录号：15140-122）

34. Gibco 台盼蓝溶液，0.4%（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）

35. SHP099（DC化学品，目录号：DC9737）

36. DMSO（康宁，目录号：25-950-CQC）

37. EGF（Gibco，目录号：PHG0311）

38. Phospho-Tyr-1000 抗体（Cell Signaling Technology，目录号：8954）

39. 蛋白酶抑制剂混合物（Roche，目录号：04693159001）

40. PhosSTOP（Roche，目录号：04906837001）

41. 原钒酸钠（NEB，目录号：P0758L）

42. 二硫苏糖醇（DTT）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0861）

43. 碘乙酰胺（IAA）（Thermo Fisher Scientific，目录号：A39271）

44. 二辛可宁酸测定试剂盒（Pierce，目录号：23225）

45. 水，HPLC级（MilliporeSigma，目录号：270733）

46. 甲醇，HPLC级（MilliporeSigma，目录号：34860）

47. 氯仿，HPLC级（MilliporeSigma，目录号：528730）

48. 尿素（MilliporeSigma，目录号：U4883）

49. HEPES（MilliporeSigma，目录号：H3375）

50. 赖氨酰内肽酶，质谱级（ FUJIFILM Wako，目录号：125-05061）

51. 胰蛋白酶，测序级（Promega，目录号：V511C）

52. 乙腈， LiChrosolv® （MilliporeSigma，目录号： ¹⁰³⁷²⁵）

53. 甲酸，LiChroPur ^TM（MilliporeSigma，目录号：543804）

54. 三氟乙酸（TFA），HPLC级（MilliporeSigma，目录号：302031）

55. 定量比色肽测定（Pierce，目录号：23275）

56. 氢氧化铵，LiChroPur ^TM（MilliporeSigma，目录号：543830）

57. EDTA，LiChroPur ^TM（MilliporeSigma，目录号：79884）

58. FeCl ₃（MilliporeSigma，目录号：451649）

59. 乙醇，HPLC级（MilliporeSigma，目录号：09-0851）

60. TMT11plex 等压标记试剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：A37725）

61. 50％羟胺（MilliporeSigma，目录号：159417）

62. 蛋白 A 琼脂糖（MilliporeSigma，Roche，目录号：11134515001）

63. Phospho-Thr202/Tyr204-Erk1/2 抗体（Cell Signaling Technology，目录号：9101）

64. Erk1/2 抗体（Cell Signaling Technology，目录号：9102）

65. β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A1978）

66. 兔 IgG，HRP 连接的全抗体（来自驴）（GE Healthcare，目录号：NA934V）

67. 小鼠 IgG，HRP 连接的全抗体（来自绵羊）（GE Healthcare，目录号：NXA931V）

68. Novex WedgeWell 12％Tris甘氨酸凝胶（Thermo Fisher Scientific，目录号：XP00122BOX）

69. 6 × Laemmli 样品缓冲液（Boston BioProducts，目录号：BP-111R）

70. Precision Plus 蛋白质双色标准品（Bio-Rad，目录号：1610374）

71. 牛血清白蛋白组分V（MilliporeSigma，Roche，目录号：10735094001）

72. SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，目录号：34580）

73. PTMScan IAP 缓冲液 10 × （ Cell Signaling Technology，目录号：9993）

74. 完整的 L-15 培养基（见配方）

75. 无血清 L-15 培养基（见配方）

76. 裂解缓冲液（见配方）

77. 1 × SDS-PAGE 运行缓冲液（参见配方）

78. 1 ×传输缓冲器（见配方）

79. 阻塞缓冲液（见配方）

80. IAP 缓冲区（参见配方）

81. 溶剂 A（见配方）

82. 溶剂 B（见配方）

83. 溶剂 C（见配方）

84. 溶剂 D（见配方）

85. 溶剂 E（见配方）

86. 溶剂 F（见配方）

87. 溶剂 G（见配方）

88. 溶剂 H（见配方）

89. 溶剂 I（见配方）

90. 溶剂 J（见配方）

91. 溶剂 K（见配方）

92. 溶剂 L（见配方）

93. 溶剂 M（见配方）

94. 溶剂 N（见配方）

95. 溶剂 O（见配方）

96. 1 × TBST（见配方）

97. 消化缓冲液（见配方）

设备

1. -80°C 冰箱

2. 端到端管旋转器/振动器（Fisher Scientific，目录号：13-687-12Q）

3. 细胞刮刀（VWR，目录号：734-2602）

4. 生物安全柜

5. 尼康 Eclipse TS100 显微镜

6. 37°C水浴

7. 37°C, 0% CO ₂组织培养箱

8. 25°C 和 37°C 摇床

9. 1490 Reichert Bright-Line 血细胞计数器（Hausser Scientific）

10. 冷藏和室温微量离心机

11. XCell SureLock 微型细胞电泳系统（Invitrogen）

12. XCell II ^TM印迹模块（Invitrogen）

13. PowerPac 电源 (Bio-Rad)

14. X 光胶片暗盒

15. X射线胶片处理器

16. SpectraMax M5 读板器（Molecular Devices）

17. 必能信 Digital Sonifier 250 带锥形钛微尖端

18. 真空浓缩离心机（Thermo Fisher）

19. 20 位提取歧管（沃特世）

20. 质谱仪（Thermo Fisher）

软件

1. SoftMax Pro（分子器件）

2. 微软Excel

程序

A. MDA-MB-468细胞的配体刺激

SHP2 在诱导 EGFR 或其他受体酪氨酸激酶后促进 RAS/MAPK 信号的完全激活。它通过与酪氨酸磷酸化蛋白相互作用以及通过对整个 RTK 信号网络中的各种底物去磷酸化而发挥作用。为了捕获由 SHP2 调节的全系统磷酸化事件，我们在血清饥饿的乳腺癌细胞系中变构抑制 SHP2，该细胞系具有 EGFR 扩增并用 EGF 配体刺激不同时间段。

1. 在预热的完整 L-15 培养基中将 MDA-MB-468 细胞播种在 11 个 150 mm 培养皿中（每道培养皿 20 mL 培养基中有 1000 万个细胞）。

2. ₂的加湿组织培养箱中培养细胞，直到它们达到 80% 汇合（约 48 小时）。

注意：MDA-MB-468 细胞的基础培养基是 ATCC 配制的 Leibovitz's L-15 培养基，辅以 10% 胎牛血清。 L - 15 培养基配制用于无二氧化碳 (CO ₂)系统，因此这些细胞在 0% CO _2中培养。

3. 用 15 mL 的预热 1 × HBSS 缓冲液吸出介质并清洗细胞两次。吸出 HBSS 缓冲液，加入预热的无血清 L-15 培养基（每盘 20 mL），并在 37°C 下孵育细胞 24 小时。

4. 第二天，用 DMSO 载体或 10 µ M SHP099 处理细胞，并在37°C 下孵育 2 小时。

5. 用 10 nM EGF 刺激细胞 5、10 或 30 分钟（如图 1B，Vemulapalli等人，2021 年所示）。

6. 要终止配体刺激，请用 15 mL 的冰冷 PBS 轻轻清洗细胞。吸出 PBS。

7. 使用细胞刮刀，在 1 mL 的冰冷 PBS 中将细胞从盘中刮下，然后将它们转移到 1.5 mL 微量离心管中。

8. 4°C 下以 1,000 × g离心细胞5 分钟并吸出上清液。将管子放入液氮浴中 10 秒，快速冷冻细胞颗粒。将试管储存在 -80°C 直至进一步使用。

B. 细胞裂解物的制备

由 EGF 刺激的细胞制备的全细胞提取物用作用于质谱分析中富集酪氨酸磷酸化肽的起始材料。

1. 在冰上解冻细胞颗粒并将它们重新悬浮在 1 mL 的裂解缓冲液中。

2. 在冰上以 30% 的振幅对细胞裂解物进行声波处理，总共 30 秒（三个 10 秒脉冲），以剪切 DNA 并降低样品粘度。

3. 将细胞提取物在4°C 下以 24,000 × g离心20 分钟。将上清液转移到新的 1.5 mL 管中并丢弃颗粒（不溶性细胞碎片）。

4. 根据制造商的说明进行二辛可宁酸 (BCA) 蛋白测定。使用 SoftMax Pro 软件在 SpectraMax 酶标仪中测量裂解物和 BSA 标准品的吸光度。使用 Microsoft Excel 创建 BSA 标准曲线，用于将裂解物标准化至 1 mg/mL 的浓度。

5. 从标准化样品中分取 50 µL ，在 95°C 的1 × Laemmli 样品缓冲液中煮沸 5 分钟，然后将它们储存在 -80°C 直至进一步使用。

注意： _

a. 这些样品将用于通过蛋白质印迹测试 MDA-MB-468 细胞对 SHP099 和 EGF 处理的 ERK 磷酸化反应。

b. ERK 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其 T202/Y204 的双重磷酸化用作 RTK 激活的读数。

6. 添加二硫苏糖醇 (DTT)加入 950 μL的标准化细胞裂解液，最终浓度为 5 mM。在 55 ° C 下孵育 30 分钟以减少二硫键。让样品冷却至室温。

7. 在所有样品中添加碘乙酰胺，最终浓度为 14 mM。在黑暗中在室温下孵育 45 分钟以烷基化还原的半胱氨酸。

8. 将 DTT 添加到 10 mM 的最终浓度。在室温下在黑暗中孵育 15 分钟以淬灭过量的碘乙酰胺。

9. 冷冻样品直至进一步使用。

C. 蛋白质印迹

为了确认对药物/配体处理的细胞反应，进行了蛋白质印迹。正如预期的那样，EGF 刺激在 MDA-MB-468 细胞中诱导了 ERK1/2 磷酸化反应，而 SHP099 处理抑制了这种反应（图 1A，Vemulapalli等人，2021）。

1. 将样品 (20-30 µg /车道) 加载到 12% tris 甘氨酸凝胶中, 以及 5 µL的蛋白质阶梯。

2. 的 1 × Tris-Glycine SDS 缓冲液中运行凝胶。当染料前沿到达凝胶底部时停止电泳。

3. 制造商的说明，使用 XCell II Blot 模块 HYPERLINK "https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fblotmod_pro.pdf" 将蛋白质转移到0.45 µm PVDF 膜上。

4. 在室温下将膜在 10 mL 的阻塞缓冲液中孵育 1 小时，并轻轻搅拌。

5. 倒出封闭缓冲液并在 5-10 mL 的一抗 [Phospho-Thr202/Tyr204-Erk1/2（1:2000 稀释）、Erk1/2（1:4000 稀释）和β-肌动蛋白（1: 10,000 稀释度）] 在封闭缓冲液中稀释，并在 4°C 下轻轻搅拌过夜。

6. × TBST清洗膜 3 次，每次 10 分钟。

7. 在 10 mL 兔 IgG 二抗中孵育 Phospho-Thr202/Tyr204-Erk1/2 和 Erk1/2 膜，在10 mL 小鼠 IgG 二抗中孵育β-肌动蛋白膜，均在封闭缓冲液中以 1:5,000 稀释在室温下轻轻搅拌 1 小时。

8. × TBST洗涤膜10 分钟 3 次。

9. 将膜在 3 mL 的溶液中孵育，该溶液含有 SuperSignal West Pico PLUS Luminol/Enhancer 和 SuperSignal West Pico PLUS 过氧化物（1:1 稀释），在室温下轻轻搅拌 5 分钟。将膜放在胶片盒中的塑料片保护器中，并将其暴露于 X 射线胶片（每种一抗的最佳曝光时间各不相同）和使用 X 射线胶片处理器成像（图 1A，Vemulapalli等人，2021） .

10. 在确认对药物和/或配体治疗有适当的细胞反应后，继续进行质谱样品制备。

D. 蛋白质沉淀和消化

细胞裂解后，通过甲醇-氯仿法沉淀蛋白质，以去除裂解缓冲液中存在的脂类、基因组 DNA 和去污剂等不需要的细胞物质，这些物质会干扰下游步骤，包括酶消化。使用蛋白酶（例如胰蛋白酶和/或 LysC）对蛋白质提取物进行酶消化，以产生适合通过自下而上蛋白质组学和质谱分析的肽。

1. 将 950 μL的细胞裂解物解冻并转移到耐氯仿的 15 mL Falcon 管中（参见材料和试剂）。

2. 加入 4 体积(3.80 mL) 甲醇，涡旋 5 秒，然后以 2,000 ×离心 g在室温下保持 30 秒。保留颗粒并去除上清液。

3. 加入 1 体积 (950 µL ) 的氯仿，涡旋 5 秒，然后以 2,000 ×离心 g在室温下保持 30 秒。保留颗粒并去除上清液。

4. 添加 3 卷 (2.85 mL) 的水并涡旋 5 秒。

注意：溶液会呈乳白色；这表明蛋白质沉淀。

5. 在室温下以 4,000 × g离心管20 分钟。

注意：蛋白质沉淀会出现在底部氯仿层和顶部水层之间的界面处。

6. 用 1 mL 微量移液器小心地将顶部水层吸出，然后加入 4 体积的冰冷甲醇清洗蛋白质颗粒。

7. 在室温下以 4,000 × g离心 20 分钟。

注意：颗粒沉降到试管底部。使用微量吸管吸出上清液以浪费。

8. 加入 4 倍体积的冰冷甲醇，涡旋 10 秒，在室温下以 4,000 × g离心 20 分钟。重复总共三个甲醇洗涤。

9. 在最后的甲醇洗涤中，用 1 mL 微移液器吸出上清液以浪费。

注意：除去大部分甲醇，不要接触颗粒并使其完全干燥。

10. 添加 1 mL 的消化缓冲液：8 M 尿素在 25 mM HEPES、pH 8.5 中稀释到颗粒中。

注意：始终准备新鲜的尿素溶液。

11. 用物理破坏重新溶解颗粒，例如超声处理（40% 振幅，5 s 脉冲，3 次）。

12. 将裂解物稀释至最终 4 M 的尿素浓度，加入 1 mL 的 25 mM HEPES pH 8.5。

13. 在 Lysyl 内肽酶 (Lys-C) 中消化蛋白质样品，酶与蛋白质的比例为 1:100，在 37°C 下振荡 2 小时。

14. 通过添加 2 mL 的 25 mM HEPES pH 8.5 将 4 M 尿素稀释至最终浓度为 2 M 尿素。

15. 以 1:50 的酶与底物比添加 Lys-C，并在室温下振荡消化过夜，以确保 100% 的蛋白质被 Lys-C 切割。

16. 第二天，通过添加 4 mL 的 25 mM HEPES pH 8.5 将样品稀释至 1 M 尿素。

17. 继续以 1:100 的酶与底物比例添加胰蛋白酶消化蛋白质，并在 37°C 下振荡孵育 6-8 小时。

E. 评估遗漏的乳沟

验证蛋白质消化的完整性，以确保大多数已识别的肽段适用于质谱分析和肽段测序。

1. 为了评估遗漏裂解的百分比，按照 Rappsilber等人的方法，使用 C ₁₈STAGE Tips从几个代表性样品中去除一小部分（~2-3 µg ）肽。（2003 年）。

2. 在脱盐步骤之后，通过真空离心干燥肽。

3. 溶剂 A 的 ± 6 μL中重组干燥的肽，以通过 LC-MS/MS 进行分析。

注意：低于 10% 的缺失切割率是可以接受的。如果错过的切割率 > 10%，请在 1 M 尿素下重复胰蛋白酶消化。

4. 在确保切割率 > 90% 后，根据制造商的说明，使用 Pierce 定量比色肽测定法从 11 个样品中的每一个中分取 5 μL以测量其相应的肽浓度。

5. 将肽样品储存在 -80°C 直至进一步使用，或直接进行下一步。

F. 肽样品的脱盐和净化

通过 C18 固相萃取 (SPE) 进行脱盐将从肽混合物中去除 DNA、RNA、代谢物和未消化的蛋白质。

1. 将样品解冻和酸化至最终浓度为 1% TFA（v/v；pH ~2），并在冰上孵育 15 分钟。

注意：酸化将改善肽与 SPE 小柱固定相的相互作用。

2. 将样品在室温下以 1、780 × g 离心 15 分钟，然后将上清液转移到新的 15 mL管中。

3. 标记 50 mg C ₁₈Sep-Pak 墨盒并将其安装到连接到废物收集容器的真空歧管上。打开真空。

注意：每个样品每 1 mg 蛋白质使用 50 mg 吸附剂。

4. 用 1 mL 溶剂 B激活 C _{18 Sep-Pak。}

5. 用 1 mL 的溶剂 C 平衡 Sep-Pak。

6. 用 1 mL 溶剂 D 清洗 Sep-Pak 三次。

7. 加载到墨盒上。从最低设置开始应用真空并逐渐增加，以允许样品的逐滴流速。

注意：较慢的流速允许样品和吸附剂之间充分的相互作用。

8. 使用 1 mL 溶剂 D 执行四次 1 mL 洗涤。

9. 关闭真空，丢弃废液，插入标有清洁标签的 2 mL 收集管，然后更换歧管盖。

10. μL的溶剂 E洗脱肽。

11. 使用300 µL溶剂 F在同一收集管中执行第二次洗脱。

12. 通过真空离心过夜干燥脱盐肽。将肽保存在 -80°C 直至进一步使用，或直接进行下一步。

G. 固定化金属亲和色谱 (IMAC)

IMAC 是最常用的磷酸肽富集方法。它的工作原理是肽上带负电荷的磷酸基团对带正电荷的金属离子具有亲和力。在这里，我们使用具有强金属螯合次氮基三乙酸 (NTA) 基团的琼脂糖珠与 Fe ³⁺离子螯合，并从肽混合物中富集磷酸化肽。

1. 用溶剂 H 填充 2 mL 管，以减少肽与表面的结合，并将管放在一边，直到洗脱步骤。

2. 准备 Ni-NTA 磁性琼脂糖珠 (Qiagen)：

a. 将 500 μL（500 μL/mg 蛋白质）的珠浆转移到 1.5 mL 管中。

b. 用 1 mL 水清洗珠子，短暂离心，然后将上清液吸到废物中。用 1 mL 水再清洗珠子两次，以去除所有乙醇痕迹。

c. 将 1 mL 的 40 mM EDTA 添加到珠子中，并在室温下摇动孵育 30 分钟。

d. 用 1 mL 水三次洗涤珠子，并将上清液吸入废物中。

e. 用 1 mL 的100 mM FeCl _{3螯合珠子，}并在室温下摇动孵育 30 分钟。

f. 用 1 mL 的溶剂 G 清洗珠子，并将上清液吸到废物中。重复此步骤共进行四次洗涤。

3. 在溶剂 G 中重构肽以达到 1 mg/mL 的最终浓度。根据先前比色肽测定确定的浓度调整溶剂 G体积。将肽转移到含有珠子的管子中。在室温下通过端到端旋转孵育肽珠混合物 3 0 分钟。

注意：在样品吸附之前，确保肽样品的 pH 值是酸性的。

4. 30 分钟后，将肽珠浆短暂离心，将含有非磷酸化肽的上清液收集到新的 2 mL 管中。不要干扰或触摸磁性结合的磷酸肽。通过真空离心干燥非磷酸化肽，并在-80°C 下储存，直到需要进行蛋白质组学分析。

5. 洗涤磷酸肽结合珠浆 3 次，然后将上清液吸出。

6. 将溶剂 H从上一步 1 中的 2 mL 洗脱管中去除到废物中。在这些相同的洗脱管中，将 36 µL 溶剂 I 添加到最终浓度为总洗脱体积 2% 的甲酸中（步骤如下）。

7. 将 300 μL 的溶剂 J 添加到磷酸肽结合珠浆中，并在室温下摇动 3 分钟。短暂离心并将磷酸肽洗脱液（上清液）转移到步骤 6 中酸化的 2 mL 洗脱管中。

8. 重复上述洗脱步骤两次，以确保所有磷酸肽均已从 IMAC 珠子上洗脱。所有三种洗脱液 (900 µL) 应收集在一个 2% 甲酸酸化的 2 mL 管中。

注意：磷酸肽产量可能会有所不同，平均约为初始蛋白质输入浓度的 2-4%。例如，使用这些协议，1 mg 消化的肽可以产生约 20 μg 的富集磷酸肽。

9. 通过真空离心干燥磷酸肽，并将磷酸肽溶解在 500 μL的溶剂 D 中。

10. 使用SOLA HRP 10 mg 墨盒 (Thermo Fisher) 对磷酸肽进行脱盐：

a. 用 500 µL 溶剂 H 激活。

b. 用 500 μL 的溶剂 K 平衡。

c. 用 500 μL 的溶剂 D 洗涤3 次。

d. 加载 500 μL 的酸化磷酸肽（确保 pH <4）。

e. 用 500 μL 的溶剂 D 洗涤3 次。

f. 洗脱磷酸肽两次，将洗脱液收集在单个 2 mL 管中，并使用真空离心干燥。

g. 将脱盐的磷酸肽储存在 -80°C 直至进一步使用，或直接进行 TMT 标记。

H. 串联质量标签 (TMT) 标签

为了同时对来自 11 种 EGF/SHP099 处理的磷酸肽进行相对定量，用 11 种 TMT 试剂标记样品，以允许通过质谱法进行多重定量测量。

1. 室温下在 200 mM EPPS pH 8.5 中复溶脱盐磷酸肽。

2. μL溶剂 H 中的TMT 试剂（0.8 毫克）对富集磷酸肽进行等压标记，最终浓度为 20 μg / μL 。用一种 TMT 试剂以质量比为 4:1（TMT：磷酸肽）标记每个磷酸肽样品，以确保有效标记所有磷酸肽（有关标记效率标准，请参见下文）。例如，30 µg磷酸肽将使用 6 µL TMT 试剂。

3. 在进行质量控制检查（通常称为 TMT 标记“比率检查”）之前，让 TMT 反应在室温下进行约 1.5 小时，以评估标记效率和磷酸肽富集效率。使用 C18 StageTip 将每个磷酸肽-TMT 反应的大约 2 μL等分到混合混合物中并脱盐，如前文所述，用于消化和遗漏的切割检查（E 节）。在 -80°C 下冷冻储备的磷酸肽标记反应，直到获得并分析比率检查。

4. 如果标记效率 > 98%，标记反应可以单独用溶剂 L 淬灭至终浓度为 0.5% 羟胺 15 分钟，酸化，然后将所有 TMT 标记的肽组合成 TMT 标记的磷酸肽的单一混合物进行干燥通过真空离心。

5. 使用先前讨论的未富集肽的方法（F 节），用 50 mg Sep-Pak 对组合的 TMT 标记的磷酸肽混合物进行脱盐。

6. 将最终脱盐 TMT 标记的磷酸肽混合物冻干长达 ± 48 小时，以确保已从磷酸肽中去除所有痕量的三氟乙酸。将磷酸肽储存在-80°C，直到进一步使用，或直接进行下一步。

I. 酪氨酸磷酸化肽的免疫亲和纯化 (IAP)

通过 IMAC 富集的磷酸肽混合物主要含有磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸肽以及极低水平的磷酸酪氨酸肽。由于 SHP2 是一种含有 SH2 结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶，可结合磷酸化酪氨酸 (pY) 残基并使其去磷酸化，因此我们通过使用磷酸化酪氨酸抗体对 IMAC 纯化的肽进行免疫沉淀来富集 pY 肽。

1. 使用预切的 1 mL 微移液器尖端将 60 μL的蛋白 A-琼脂糖珠浆（相当于 30 μL的包装珠）放入干净的 1.5 mL 管中。

注意：在移液珠之前将瓶子倒置。

2. 用 1 mL 的冰冷 1 × PBS 清洗珠子，短暂涡旋，以 2，000 × g离心30 秒，然后吸出上清液。重复洗涤总共三遍。

3. 偶联 30 µL磷酸酪氨酸兔抗体 (P-Tyr-1000) （相当于 100 µg抗体）与预洗的蛋白 A-琼脂糖珠和 1 × PBS 混合至最终体积为 1.5 mL。

注意：在磷酸酪氨酸肽富集前一天，将磷酸酪氨酸兔抗体（P-Tyr-1000；Cell Signaling Technology）与蛋白 A 琼脂糖珠结合。

4. 用封口膜密封试管，并在 4°C 下通过端对端旋转孵育过夜。

5. × g将抗体偶联珠子离心30 秒，吸出并丢弃上清液。

6. 用 1 mL 冰冷的 1 × PBS 清洗抗体结合珠三次，吸出并丢弃上清液。

7. μL的冰冷 1 × PBS中重悬抗体结合珠子并立即使用。

8. μL的 1 × IAP 缓冲液中重组冻干 TMT 标记的磷酸肽。

9. 确保样品具有中性 pH 值 (~7.4)。如果样品呈酸性（pH <6），则添加 5-10 µL的 1 M Tris 缓冲液 pH 8.0。

10. 在 4°C 下以 10,000 × g离心样品 5 分钟。

11. 将上清液（TMT 标记的磷酸肽）直接转移到抗体偶联珠上，以确保立即混合，同时避免引入气泡。

12. 用封口膜密封试管并在 4°C 下孵育 2 小时。

13. × g离心30 秒。将上清液转移到干净的试管中并储存在-80°C。

注意：上清液含有磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸肽，如果需要，可以通过质谱分析。

14. 将 1 mL 的 1 × IAP 缓冲液加入到抗体偶联珠中，轻轻颠倒离心管 5 次，在 4°C 下以 2,000 × g离心30 秒，弃上清。

15. 加入 400 µL冰冷的水，将内容物转移到 0.2 µ M 过滤旋转柱中，并在 4°C 下以 1,000 × g离心 30 秒。丢弃流通。使用 400 μL的冰冷水清洗，从初始管中收集任何残留的珠子，然后将它们与先前转移的抗体结合珠子一起转移到过滤器旋转柱中。在 4°C 下以 2,000 × g离心 30 秒并丢弃流出液。

16. 将离心柱放入新的 1.5 mL 收集管中，加入 75 µL 100 mM 甲酸以从抗体结合珠中洗脱 pY 肽，并在 25°C 下孵育 10 分钟。

注意：每 5 分钟轻轻敲击/轻弹试管进行混合。不要涡旋。以 1,000 × g 离心30 秒。

17. 同一收集管中进行第二次洗脱。向珠子中加入 75 μL的 100 mM 甲酸，每 5 分钟轻轻敲击试管孵育 10 分钟，并以 2，000 × g离心30 秒。

18. 如前所述，使用 C _{18 StageTip 将}含有磷酸酪氨酸肽的酸化洗脱液脱盐。用 25 μL的溶剂 M将 pY 肽洗脱，依次用 50 μL的溶剂 N 洗脱到适合 LC-MS/MS 的玻璃小瓶中，并通过真空离心干燥。在 4.5 μL的溶剂 O中重组磷酸酪氨酸肽，以通过液相色谱-质谱法进行分析。

食谱

1. 完整的 L-15 媒体

莱博维茨的 L-15 媒体

10% 胎牛血清

1 ×青霉素-链霉素

2. 无血清 L-15 培养基

莱博维茨的 L-15 媒体

1 ×青霉素-链霉素

3. 裂解缓冲液

2% SDS

150 毫米氯化钠

50 mM Tris (pH 8.5-8.8)

蛋白酶抑制剂混合物（每 20 毫升 1 片）

PhosSTOP（每 20 毫升 2 片）

2 mM 原钒酸钠

4. 1× SDS-PAGE 电泳缓冲液

25 mM Tris 碱基

192 毫米甘氨酸

0.1% SDS

5. 1× 传输缓冲器

25 mM Tris 碱基

192 毫米甘氨酸

20% 甲醇

6. 阻塞缓冲区

5% BSA

1 × TBST

7. IAP 缓冲区

50 mM MOPS/NaOH pH 7.2

10 毫米钠₂HPO ₄

50 毫米氯化钠

8. 溶剂 A

5% 乙腈

5% 甲酸

90% 水

9. 溶剂 B

100% 甲醇

10. 溶剂 C

50% 乙腈

0.1% 三氟乙酸

49.9% 水

11. 溶剂 D

0.1% 三氟乙酸

99.9% 水

12. 溶剂 E

40% 乙腈

0.1% 三氟乙酸

59.9% 水

13. 溶剂 F

70% 乙腈

0.1% 三氟乙酸

29.9% 水

14. 溶剂 G

80% 乙腈

0.15% 三氟乙酸

19.85% 水

15. 溶剂 H

100% 乙腈

16. 溶剂一

50% 甲酸

50% 水

17. 溶剂 J

50% 乙腈

0.7% 氢氧化铵

49.3% 水

18. 溶剂 K

70% 乙腈

29% 水

1% 三氟乙酸

19. 溶剂 L

50% 羟胺

50% 水

20. 溶剂 M

40% 乙腈

0.1% 甲酸

59.9% 水

21. 溶剂氮

70% 乙腈

0.1% 甲酸

29.9% 水

22. 溶剂 O

3% 乙腈

0.5% 甲酸

96.5% 水

23. 1×TBST

对于 1 L 的 1 × TBST，添加：

100 mL 10 × Tris 缓冲盐水

900 毫升水

1 毫升 100% 吐温 20

24. 消化缓冲液

8 M 尿素稀释于 25 mM HEPES pH 8.5

致谢

我们感谢 Jon Aster、Michael Acker、Jonathan LaRochelle 以及 Gygi 和 Blacklow 实验室的成员进行有益的讨论。我们感谢 Cell Signaling Technologies 为免疫亲和纯化实验提供 Phospho-Tyr-1000 抗体。该协议改编自 Vemulapalli等人。（2021 年； DOI：10.7554/eLife.64251 ）。

资金：这项工作得到了 NIH 赠款 R35 CA220340 (S CB)、Dana Farber-Novartis 转化药物开发计划 (SCB) 和 GM97645 (SPG) 的支持。

利益争夺

SCB 从诺华获得了该项目的研究资金，是 Erasca, Inc. SAB 的成员，是 MPM Capital 的顾问，并且是 IFM、Scorpion Therapeutics、Odyssey Therapeutics 和 Ayala Therapeutics 的不相关项目的顾问。

参考

1. 德尔罗萨里奥，上午和怀特，FM（2010 年）。通过系统生物学量化致癌磷酸酪氨酸信号网络。 Curr Opin Genet Dev 20（1）：23-30。

2. Du, Z. 和 Lovly, CM (2018)。癌症中受体酪氨酸激酶活化的机制。摩尔癌症17（1）：58。

3. Olsen, JV, Blagoev, B., Gnad, F., Macek, B., Kumar, C., Mortensen, P. 和 Mann, M. (2006)。信号网络中的全局、体内和位点特异性磷酸化动力学。单元格127（3）：635-648。

4. Rappsilber, J.、Ishihama, Y. 和 Mann, M. (2003)。用于蛋白质组学中基质辅助激光解吸/电离、纳米电喷雾和 LC/MS 样品预处理的即走即走提取技巧。 肛门化学75（3）：663-670。

5. Vemulapalli, V., Chylek, LA, Erickson, A., Pfeiffer, A., Gabriel, KH, LaRochelle, J., Subramanian, K., Cao, R., Stegmaier, K., Mohseni, M.等. （2021 年）。时间分辨磷酸蛋白质组学揭示了 SHP2 依赖性信号的支架和催化响应模式。生命 10：e64251 。