材料和试剂

1. 硅橡胶涂层单丝（Doccol，目录号：602323PK10）

注意：应根据研究中使用的小鼠体重选择单丝尺寸。根据制造商，提供的特定目录号适用于体重在 30 ± 5 克范围内的动物。

2. 6-0线轴黑色编织丝线（HOSPEQ，目录号：sp114）

3. 6-0，P-10 编织聚酯可吸收缝线（Henry Schein，Polysorb，目录号：2946794）

4. 6-0，C-22黑色编织丝线（Henry Schein，目录号：101-2636）

5. Vet Bond Tissue Adhesive（Fisher Scientific，目录号：15672）

6. 手术胶带（3M，目录号：1527-0）

7. 棉尖涂抹器（McKesson，Q-Tip，目录号：785468）

8. 手术单（SAI Infusion Technologies，目录号：PSS-SD5）

为该协议获取图像之前，手术单被移除。

9. 异氟醚（Primal Health Care，目录号：NDC 66794-017-10）

10. 人工泪液软膏（Henry Schein，目录号：1338333）

11. 氯己定（Aspen，目录号：NDC 46066-141-01)

12. 0.9％氯化钠溶液（盐水）（Henry Shein，目录号：1047098）

13. 乙醇，200 证明（100%）（Decon Labs，目录号：2701）

14. 70 % 乙醇溶液（见配方）

设备

1. Dumont #4 镊子（Fine Science Tools，目录号：11294-00）

2. Dumont #5 镊子 45° Inox 尖端（Roboz，目录号：RS-5005）

3. 格雷夫弯曲和锯齿状镊子（ × 2）（Fine Science Tools，目录号： 11051-10）

4. Moria Iris 镊子（ × 2）（Fine Science Tools，目录号：11370-31）

5. 超细波恩（虹膜）剪刀（精细科学工具，目录号：14084-08）

6. 肌腱切开剪刀（Fine Science Tools，目录号：14066-11）

7. Vannas弹簧剪刀3mm切削刃（Fine Science Tools，目录号：15000-00）

8. AutoClip Applier（精细科学工具，目录号：12020-09）

9. AutoClips（精细科学工具，目录号：12022-09）

10. AutoClip Remover（精细科学工具，目录号：12023-00）

11. Castroviejo 针座锁定（Roboz，目录号：RS-6416）

12. 微型夹弯曲（Roboz，目录号：RS-5433）

13. 微夹直（Roboz，目录号：RS-5424）

14. 应用镊子的微夹子（Roboz，目录号：RS-5410）

15. 双极凝固器系统（Accurate Surgical，Polarmate，目录号：AC1905）

16. 双极镊子（Accurate Surgical，Adson，目录号：ASSI.BPNS12723）

17. 激光多普勒系统（Moor Instruments，目录号： MOORVMS-LDF1-HP ）

18. 光纤（Moor Instruments，目录号： POF500)

19. 带温度控制的载玻片加热器（4MD Medical，目录号：CASCXH-2001）

20. Somnosuite 低流量麻醉系统（Kent Scientific，目录号：n/a）

21. 感应室（Kent Scientific，目录号：Somno-0705）

22. 暖垫（Kent Scientific，目录号：RT-0501）

23. 带真空的电动剃须刀（Remmington，目录号：VPG-6530）

24. 带脚踏板的显微镜（Leica，目录号：Wild M691）

程序

A. 准备

1. 手术前对所有手术器械、手术托盘和材料进行消毒。

注意：在同一天的动物手术之间，将器械浸泡在 70% 乙醇溶液中，并在下一次手术前用无菌水冲洗。

2. 将手术台加热垫设置并保持在 37 °C 。

3. 将一个新的无菌笼放在设置为37 °C 的滑动加热器上。

注意：由于小鼠在 MCAO 后是单独饲养的，因此每只小鼠需要一个笼子。该笼子将在闭塞事件期间用作外壳，并在程序完成后再次用作外壳。

4. 在距涂层末端 6.5 毫米和 10 毫米的距离处测量和标记单丝。

注意：此步骤描述了硅橡胶涂层单丝的插入长度的可接受范围。为了可视化，我们建议使用金属 Sharpie 来标记单丝。在开始程序之前确认标记是干燥的。

5. 称重并记录鼠标的基线（即，前 MCAO）重量。

注意：可以比较基线和术后体重值以评估中风后体重减轻（例如，作为基线的百分比），作为小鼠恢复的指标。

B. 手术

1. 将鼠标放在感应室中。使用 Somnosuite 低流量麻醉系统，以约 500 mL/min 的速度将 4-5% 的异氟醚混合物在室内空气中输送到感应室，以麻醉小鼠。鼠标达到麻醉深度后，将鼠标移至鼻锥和暖垫。设置麻醉系统，在手术期间以约 250 mL/min 的速度将 1-2% 的异氟醚混合物在室内空气中输送到鼻锥。

注意：通过测试脚趾捏反射来确认鼠标的麻醉深度。

2. 在老鼠的眼睛上涂抹人工泪液软膏。

3. 将动物放在其左侧。

4. 通过用洗必泰清洁该区域并分开头发（图 1A），准备右眼和右耳之间的区域进行切口。

5. 做一个切口，以便将 LDF 光纤放置在头骨上（图 1B）。

注意：在这一步不要将 LDF 光纤放在头骨上。

图 1. 为 LDF 纤维做切口。

A. 准备右眼和右耳之间的区域进行切口。 B. 在准备好的区域做一个小切口。 LDF，激光多普勒流量计。

6. 将鼠标置于仰卧位，并用手术胶带将前腿固定在暖垫上。

7. 剃腹颈。用洗必泰和 70% 乙醇交替清洁该区域；重复清洁程序共 3 次。

8. 在准备好的腹颈区域做一个中线切口。钝性解剖到气管的左侧（即动物的右侧），横向移动下颌下腺。继续钝性解剖胸骨舌骨外侧和胸锁乳突上内侧，直到颈动脉鞘可见（血管将在稍后的步骤中清洁和暴露）。

9. 在中线切口的中心，将缝合线（带针的 6-0 黑色编织缝合线）穿过右侧舌骨下肌和覆盖气管的相邻皮肤。打两个双结。将缝合线的松散端拉紧并向右拉，以增加手术视野。用手术胶带将缝合线固定在加热垫上。对腹侧颈部切口左侧的皮肤和底层组织重复此过程（图 2）。

10. B5中制作的横向切口将 LDF 光纤平放在头骨上（图 2A-2B）。校准 LDF 系统并注意鼠标皮质血流的基线值。

图 2. 做腹颈切口并将 LDF 纤维放在头骨上。

A. 横向和 B. 颈部切口的腹面视图用编织缝线拉开，LDF 纤维紧贴颅骨。 C。拉开腹侧颈部切口的放大视图。 LDF，激光多普勒流量计。

11. 找到含有 CCA 和迷走神经的颈动脉鞘（图 3A）。使用钝性解剖，从护套内暴露 CCA。从暴露的 CCA 的最近端开始，钝器解剖血管，向远端移动，同时从其壁上清洁结构。注意不要损伤迷走神经。

12. 到达颈动脉分叉处后，继续钝性解剖 ECA。

a. 从 ECA 横向分支的是枕动脉；让这艘船完好无损。

b. 钝性解剖舌骨外侧边缘的结缔组织，以更好地暴露 ECA。

c. 从 ECA 向内侧分支的是甲状腺上动脉 (STA)；烧灼此容器（图 3B-3C）。

注意：这可以防止 STA 在将单丝从 ECA 操纵到 ICA 时破裂。

13. 钝器从 CCA 分叉处解剖颈上神经节，以充分暴露 ICA 的起源（图 3D-3E）。

注意：这是一个可选步骤，可以帮助进行可视化，并且可以更轻松地操作从 ECA 到 ICA 的单丝。

图 3. 公开 CCA、ECA 和 ICA。

A. 钝性解剖前和 B. 后的腹颈切口视图。 C. 用双极钳烧灼 STA。 D. 分离从颈动脉到颈动脉体的颈上神经节。 E. 解剖后暴露的 CCA、ECA 和 ICA 的视图。所有图像都是从头端到尾端的腹侧视图，如面板B所示。 CCA，颈总动脉； ECA，颈外动脉； ICA，颈内动脉； STA，甲状腺上动脉； SCM，胸锁乳突肌； SH，胸骨舌骨肌； CN X，迷走神经。

14. 在 ECA 下方滑动两条 6-0 黑色编织丝缝合线，使缝合线垂直于容器并相互平行。抓住两条缝线的远端，在 ECA 周围打一个松散的结，然后轻轻地将其向上滑到血管上，尽可能远。拧紧缝合结以永久结扎 ECA。将此缝合线的末端粘贴到鼻锥上，轻轻拉紧 ECA（图 4A-4C）。

15. 使用其他 6-0 黑色编织丝线缝合线，在 ECA 周围打一个松结。将缝合结沿 ECA 向远端滑向步骤B14中制作的永久结扎线，但不要拉紧；该缝合线将在步骤B17中进一步操作。

16. 在 CCA 和 ICA 上放置一个弯曲的微夹，以阻止 CCA 血流到达分叉处并防止从 ICA 回流（图 4D）。

注意：为确保正确咬合，请确认微夹中的唯一结构是 CCA 和 ICA；根据需要调整/更换微夹。

17. 将松散的缝合结（在步骤B15中制作）向 ECA 的起点移动；不要拧紧（图 4E）。

图 4. 准备插入单丝的颈动脉。

A. 在 ECA 下放置两条黑色编织丝线。 B. 用一根缝线永久结扎暴露的 ECA 的最远端。 C. 将缝合线的末端粘在鼻锥上，拉紧 ECA。 D. 在 CCA 和 ICA 上放置一个微型夹，以阻止颈动脉分叉处的血流。 E. 使用剩余的缝合线，在 ECA 的近端附近打一个松结。所有图像都是从头端到尾端的腹侧视图，如图 B 所示。 ECA，颈外动脉； CCA，颈总动脉； ICA，颈内动脉。

18. 在两个缝合结之间的 ECA 中做一个切口，距离永久结扎（远端缝合结）约 2 毫米（图 5A）。将单丝的硅橡胶涂层尖端插入 ECA，指向颈动脉分叉（图 5B）。将松散的缝合结放置在包含涂层尖端的 ECA 部分周围；拧紧结（图 5C）。

注意：缝合结需要足够紧，以便在血管再灌注时单丝不会被推出 ECA，但也要足够松，以便单丝可以在后续步骤中通过缝合结。

19. 取下微夹。在不切割单丝的情况下，在两个缝合结之间的切口部位横切 ECA，创建一个包含单丝涂层尖端的近端 ECA 残端（图 5D-5E）。

20. 通过 CCA 分叉将单丝从 ECA 推进到 ICA。一旦单丝的涂层尖端穿过缝合结，收紧结以防止失血。继续将单丝推进 ICA，直到 LDF 显示皮质血流量从基线减少 40-70%，表明 MCA 闭塞。一旦确认 MCA 闭塞，通过进一步收紧 ECA 树桩周围的缝合结将单丝固定到位（图 5F-5H）。

笔记：

一个。确认单丝在 ICA 中正确推进并且没有进入翼腭动脉 (PPA; ICA 的分支) (图 5G)。

湾。当 LDF 表明皮质血流从基线减少 40-70%，通常与 6.5-10 毫米的插入长度相关时，实现 MCA 的闭塞（图 5H-5I）。

图 5. 将单丝插入ICA。

A.在 ECA 中做一个小切口， B.插入单丝的涂层尖端。 C.收紧包含涂层尖端的 ECA 周围的缝合结。 D.取下微夹，恢复 CCA 和 ICA 的血流，以及E. 在单丝入口处横切 ECA。 FG。通过 CCA 分叉将单丝推进到 ICA，小心避开 PPA，直到监测到的皮质血流减少 40-70% 的基线， HI。通常与 6.5-10 毫米的插入长度相关（图中用金色标记描绘的距离）。所有图像都是从头端到尾端的腹侧视图，如图 C 所示。 ECA，颈外动脉； CCA，颈总动脉； ICA，颈内动脉； PPA，翼腭动脉； CN XII，舌下神经。

21. 当腹颈切口闭合时，修剪单丝的末端，使其刚好适合皮肤下方。

注意：一旦腹颈切口闭合，单丝将受到缝合结（在步骤 B20 中制作）和皮肤的物理约束。如果缝合结在闭塞期间松动，皮肤的额外物理约束可以帮助防止单丝移出 ICA/ECA。

22. 用 AutoClips 闭合颈部；用组织粘合剂关闭头皮切口（图 6 ）。

图 6. 关闭颈部和头皮切口。

AB。使用 AutoClips（腹侧视图）暂时关闭腹侧颈部切口。光盘。用组织粘合剂关闭头皮切口（侧视图）。

23. 在缺血事件（闭塞时间为 30、45、60 或 90 分钟）期间，将鼠标从鼻锥中取出并放入新的无菌笼中。

24. 闭塞期完成后，重新麻醉鼠标并将其置于鼻锥处的仰卧位。

25. 从颈部切口中取出 AutoClips。

26. 为了允许 MCA 区域的再灌注，首先抓住近端 ECA 结的一侧（在步骤B20中收紧），另一方面，使用另一对钳子抓住单丝。将单丝从 ECA 残端缓慢缩回，并快速收紧 ECA 残端周围的缝合结，以防止失血（图 7）。修剪多余的缝线长度，在结的两侧留下几毫米。

笔记：

a. 去除单丝后预计会有少量失血。

b.当单丝被移除时，硅橡胶涂层将保留在近端 ICA。

图 7. 移除单丝以允许再灌注 MCA 提供的组织。

从 ECA 中取出单丝，并在 ECA 树桩周围收紧近端 ECA 缝合结。单丝尖端的硅橡胶涂层将保留在 ICA 中。图像是从头端到尾端的腹面视图，如图所示。 MCA，大脑中动脉； ECA，颈外动脉； SRC，硅橡胶涂层。

27. 用 6-0 编织可吸收缝合线以单间断缝合模式关闭腹颈切口。

28. 将 0.5-1.0 mL 的温盐水皮下注射到小鼠中，以促进恢复并解决手术期间的任何失血。

29. 从鼻锥中取出鼠标并将其放回无菌笼中。让鼠标恢复。进行视觉神经学评估。

注意：典型的神经功能障碍包括偏瘫、虚弱和嗜睡。

C. 术后支持护理

1. 手术后前 4 小时密切监视鼠标。

2. 在整个研究期间保持小鼠补充热量（例如，使用带有温度控制的滑动加热器）。

注意：在 MCAO 之后，啮齿动物无法进行体温调节（Barber et al., 2004）。补充热量可提高生存能力。

3. 在笼子地板上的培养皿中为小鼠提供饲料（即湿润的食物）和水凝胶，以鼓励喂食/液体摄入。

注意：在手术后至少 7-14 天提供饲料和水凝胶，或直到小鼠能够从标准笼式喂食器中充分进食。这有助于解决多种考虑，包括失血、术后体重减轻和 ECA 结扎的后果。每天更换醪液和水凝胶。如果鼠标继续难以正常饲养/进食，请在整个研究期间提供捣碎。

4. 前 7 天每天服用温盐水（皮下注射）。每天监测体重。如果液体摄入量不足，或怀疑脱水，应在最初 7 天后继续注射温盐水。

注意：注射前注意确保生理盐水是温热的，而不是热的或冷的。温盐水有助于减少不适、体温调节问题的因素、防止失血并防止脱水。脱水可以通过进行皮肤膨胀测试来评估。

5. 手术后每天继续密切监测小鼠是否存在手术并发症或疼痛或痛苦的迹象（例如，没有梳理、阴茎脱垂、阴茎塞），直到安乐死。

数据分析

脑磁共振成像 (MRI) 通常用于验证 MCA 区域中风和计算梗塞体积。在 T2 加权成像之后，进行数字平面测量以量化每个冠状切片上的梗塞面积。然后将梗塞面积相加，乘以切片厚度，并针对水肿进行校正，以确定梗塞体积，如前所述（Lemmerman等人，2021）。其他方法包括在收获时对大脑进行 2,3,5-氯化三苯基四唑 (TTC) 染色，或各种组织化学/组织学分析（例如，H&E、Nissl）。

当利用腔内 tMCAO 模型时，样本量是根据功率分析和我们之前在该模型中的工作估计的。在我们专门的小动物外科医生在一年内进行的 334 次 tMCAO 手术中，不到 5% 的动物在手术期间或由于手术并发症而死亡。然而，考虑到与该程序相关的排除标准和死亡率，我们建议研究人员将他们的样本量估计值增加 20%。

笔记

以下信息详细介绍了外科手术的其他建议。首先，我们建议使用圆形开口形状的麻醉鼻锥（我们在内部创建了这个鼻锥），而不是不对称的；这允许更好的麻醉流动，并让鼠标轻松地从侧位转移到仰卧位，而无需调整鼻锥的位置。为了将 LDF 光纤固定到位，我们建议将光纤穿过过滤的移液器尖端。在过滤器上打一个小孔，使光纤可以紧密贴合。将光纤穿过新孔，直到光纤末端伸出移液器吸头的窄端几毫米。现在包含光纤的移液管尖端可以被一个可调节的机械臂夹住，从而允许光纤固定在颅骨上的位置，并在整个手术过程中保持一致。为了确保在手术过程中血管破裂的情况下做好准备，我们建议准备一个直的微型夹子来快速夹住血管。如果容器破裂，请使用 Q 尖施加压力并使用直微型夹暂时夹住容器。清洁多余血液的区域并定位破裂部位。如果一个小分支是源，烧灼可能是有用的。但是，如果 CCA、PPA 或 ICA 是来源，则需要安乐死。值得注意的是，当组织干燥时，血管更容易破裂。因此，如果观察到暴露的组织变干，我们还建议准备好生理盐水来润湿暴露的组织。有关用品、试剂和手术设置的其他图像，请参阅补充材料。

为了估计手术持续时间和恢复期，我们建议预计从使用异氟醚初始诱导（程序步骤 B1）到完成程序（程序步骤 B29）需要 60-90 分钟。请注意，该估计不包括闭塞期的持续时间（程序步骤 B23）。一旦程序完成并且动物在笼子里进行术后恢复，动物应该在麻醉后 5-10 分钟内保持清醒和警觉，尽管活动量会很低。

梗死面积和死亡率等结果的变化可归因于 (a) 实验/程序设计，(b) 动物生理学，或 (c) 外科医生的表现。

(a) 实验设计因素，例如单丝尖端尺寸、闭塞持续时间、LDF 读数和鼠标特性会影响中风严重程度。必须仔细选择单丝尖端的尺寸；如果太大，它可能前进不够远，从而遮挡 ICA；如果太小，尖端可能会在没有 MCA 阻塞的情况下超过标记的插入长度，并且缺乏阻力可能会导致血管意外穿刺，导致出血和/或死亡。应根据当前的文献和研究意图仔细选择闭塞的持续时间，因为更长的闭塞会产生更大的梗塞。 LDF 用于确认流入 MCA 的血流量减少，并且必须仔细监测以确认血流量下降了 40-70%。需要注意的是，如果 LDF 系统工作不正常，这可能会影响单丝尖端的放置，从而改变梗塞体积。还应根据预期结果考虑小鼠特征，如年龄、性别和住房状况（单个与组）。我们小组最常对 10-12 周龄的小鼠执行此程序（ Lemmerman等人，2021 年）。最后，小鼠模型的选择必须考虑到已知的血管侧支、梗塞体积和中风变异性之间的差异（Fluri et al. , 2015）。

(b) 由于动物固有的因素，存在一些变化。除了上述对小鼠品系的考虑之外，具有血管系统解剖变异（例如，异常动脉分支模式）、未知合并症（例如，癌症）或不可预见的麻醉不耐受的动物可能会经历更高的死亡率或中风严重程度和缺血性的变化领土。因此，必须在 MCAO 之前、手术期间和手术后整个研究期间详细记录观察结果。

(c) 外科医生的技能是手术和结果成功的主要因素。保持合适的麻醉平面，确保单丝的适当插入长度，将手术持续时间保持在适当的最低限度以保证动物的健康，以及准备好必要的解剖知识和精湛的技术技能是至关重要的。在我们的团队中，我们有一名专业的小动物外科医生，拥有八年的手术经验。我们的外科医生从常规观察手术开始大约一个月（如果无法观察，请参见视频 1 ），然后是三个多月的练习，在此期间每天大约进行两次手术，闭塞时间为 60 分钟。在此期间进行了术后护理。目标是让动物存活到 48 小时，并在安乐死后通过 TTC 染色确认成功的 MCA 区域中风。由于技能和技术能力可能因人而异，因此获得一致数据所需的小鼠数量也同样不同。

视频 1.通过腔内缝合 tMCAO 在小鼠模型中诱导缺血性中风的手术过程。

如果对神经发生、神经保护或神经炎症感兴趣，应仔细审查镇痛药的使用。研究表明，某些抗炎药可减少中风后的梗死体积，而使用更有效的止痛药会降低警觉性、活动性和进食/饮水行为（Jacobsen等人，2013；Pettit等人，2012）。最后，虽然动物可以在闭塞期间保持麻醉状态，但据报道异氟醚麻醉具有一定的神经保护作用（Bickler 和 Fahlman，2006）和血管扩张作用（Iida等人，1998）。因此，必须适当地解决在模拟人类中风的意识和脑血管状态的同时最小化动物压力的方法（Sicard等人，2003）。

此 MCAO 小鼠模型的适当控制包括天真的小鼠实验组（即健康无手术）和/或接受假 MCAO 程序的小鼠实验组（即，不放置硅橡胶涂层单丝）。要执行假 MCAO 程序，请完成通过步骤 B14 编写的所有协议步骤。接下来，使用其他 6-0 黑色编织丝线缝合，在 ECA 周围打一个松结。将松散的缝合结向近端移向 ECA 的原点并收紧。然后，在两个缝合结之间横切 ECA，并修剪多余的缝合长度。跳过，执行步骤 B27 并用组织粘合剂关闭头皮切口。最后，执行步骤 B28-C5。

食谱

1. 70% 乙醇溶液

将 7 mL的 100% 乙醇与 3 mL的无菌水混合，以创建 10 mL的 70% 乙醇溶液。

致谢

图形摘要是使用 BioRender.com 创建的。这项工作的部分资金由新创新奖 DP2EB028110 (NIBIB/NIH) 和 DP1DK126199 (NIDDK/NIH) 提供给 DGP。在以下研究中，该方案用于小鼠，或修改用于大鼠（Khanna等人，2017；Rink等人，2017；Sen等人，2017；Balch等人，2021；Lemmerman等人）等，2021 [DOI: 10.1126/sciadv.abd4735] ）。

利益争夺

作者没有报告潜在的竞争利益。

伦理

所有动物实验均按照俄亥俄州立大学实验动物护理和使用委员会批准的方案（IACUC # 2016A00000074-R1 和 IACUC # 2009A0006-R3）进行。

参考

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