材料和试剂

1. 50 mL离心管（Tarsons，目录号： 546021）

2. 15 mL离心管（Tarsons，目录号： 546041）

3. 35 毫米培养皿

4. 60 毫米培养皿

5. Falcon 5 mL 圆底 FACS 管（BD，Falcon，目录号： 352054）

6. Sphero ^TMRainbow 荧光颗粒（BD Biosciences，目录号： 556291）

7. BD FACS Accudrop 珠子（BD，目录号： 345249）

8. 0.45 μ m Millex-HV 注射器过滤器单元（Merck Millipore，目录号： SLHVR33RS）

9. 0.22μm Millex-GV注射器过滤器单元（Merck Millipore，目录号： SLGVR33RS ）

10. 40 µm 细胞过滤器（BD Falcon，目录号： 352340）

11. 23 号手术刀片（李斯特）

12. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号： A2153）

13. Hoechst 33342（Invitrogen，目录号： H3570）

14. MitoTracker Green FM（Invitrogen，目录号： M7514）

15. SiR-DNA（Cytoskeleton, Inc.目录号： CY-SC007）

16. DAPI（Sigma-Aldrich，目录号： D9542）

17. 碘化丙啶（Sigma-Aldrich，目录号： P4864 ）

18. MEM必需氨基酸溶液（50 × ）（ThermoFisher Scientific，Gibco ^TM，目录号： 11130051）

19. MEM非必需氨基酸溶液（100 × ）（ThermoFisher Scientific，Gibco ^TM，目录号： 11140050）

20. MEM维生素溶液（100 × ）（ThermoFisher Scientific，Gibco ^TM，目录号： 11120052）

21. 丙酮酸钠（100 × ）（ThermoFisher Scientific，Gibco ^TM，目录号： 11360070）

22. 100 ×青霉素链霉素（ThermoFisher Scientific，Gibco ^TM，目录号： 15070063）

23. L-谷氨酰胺（ThermoFisher Scientific，Gibco ^TM，目录号： 25030081）

24. 胎牛血清（Himedia，目录号： RM9955）

25. 氯化钠

26. CaC ₃

27. 硫酸镁₄

28. 氯化镁₂

29. 氯化钾

30. 碳酸氢钠₃

31. NaH ₂PO ₄

32. 氯化钾

33. 葡萄糖

34. HEPES（游离酸）

35. HEPES（钠盐）

36. 氯化锰₂

37. KH ₂PO ₄

38. D-生物素

39. D-葡萄糖

40. D-海藻糖

41. 曲辛

42. Montjuïc 盐（见食谱）

43. 含 BSA (CMFB) 的无钙、镁缓冲液（参见食谱）

44. IPM + 10% FBS（见食谱）

设备

1. 冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810R）

2. FACS 分拣机（BD ARIA III 或 BD ARIA Fusion）

软件

1. FlowJo

2. BD FACS DIVA

程序

A. 细胞悬液的制备

1. 将饥饿至少 7 天的所需数量的蠕虫分开，并用新鲜的 1 × Montjuïc 盐清洗。

注意：此协议针对涡虫物种 Schmidtea mediterranea 进行了优化，并且可以使用有性和无性生物型。 所需的蠕虫数量取决于下游应用所需的细胞数量。根据我们的经验，约 0.7 厘米大小的 35 条蠕虫将产生约 100,000 至 150,000 个 X1 细胞。

2. 将蠕虫转移到 60 毫米或 35 毫米培养皿的盖子上。完全去除 1 × Montjuïc 盐。

3. 立即将 ±100 μL的 CMFB 添加到涡虫中（图 1A）。

注意：CMFB 的体积是近似的，因为它应该足以覆盖所有涡虫。体积可以根据具体要求放大或缩小。

4. 使用手术刀, 将蠕虫切成尽可能小的碎片 (图 1B)。用纸巾间歇性地擦拭手术刀，以去除粘液。确保没有大碎片残留。

5. 将组织切成小块后，加入 1 mL 的 CMF B。

6. 使用无菌手术刀切割其末端，制作宽口径 1 mL 移液器尖端（图 1C）。使用这种大口径移液器，将组织碎片转移到新的 50 mL 离心管中。

注意：组织碎片可能会粘在表面上。如果是这样，用多余的 CMFB 冲洗组织并将其转移到离心管中。在我们的实验室中，我们将组织碎片放入约 5 mL 的 CMFB 中。

7. 通过轻轻吹打多次，使用 1 mL 移液器机械分离细胞。移液约 20-30 次后，让离心管静置约 2-3 分钟。未解离的组织碎片会沉淀下来。将含有细胞的上清液转移到新的 50 mL 管中，而不会干扰沉淀的组织碎片。留下一些上清液，这样未解离的片段就不会与上清液一起出现（图 1D）。

8. 将另外 3-4 mL 的 CMFB 溶液添加到未分离的碎片中，并通过轻轻移液再次分离。

9. 重复步骤A7和A8 ，直到所有组织碎片完全解离。

注意：步骤A 7 和A 8 是为了尽可能减少细胞死亡，因为已经解离的细胞的移液是不必要的，并且可能会导致细胞死亡。

10. 收集所有细胞悬浮液并通过 40 μm过滤器将其过滤到新鲜的 50 mL 离心管中。

11. × g在 4 °C 下将应变细胞悬浮液离心10 分钟。在此阶段观察到暗细胞颗粒（图 1E）。

12. 丢弃上清液并将细胞颗粒重新悬浮在 IPM + 10% FBS 培养基中。媒体的体积取决于使用的蠕虫的数量和大小。对于约 0.7 厘米的约 40 条蠕虫，可以使用 10 mL 的介质。

图 1.细胞悬液的制备。

A. 将涡虫放入 35 mm 培养皿的盖子中，并添加约 100 μL CMFB 。 B. 切割涡虫碎片的代表性图像。 C. 与普通移液器（左）相比，带有切割尖端的 1 mL 移液器的代表性图像（右）。 D. 通过移取细胞悬浮液约 20-30 次进行机械破碎后，让溶液沉淀下来（左离心管），将上清液转移到新的离心管（右）中，将新鲜的 CMFB 添加到未解离的片段中.有关详细信息，请参阅步骤 A7-A9 。 E. 细胞过滤和离心后的细胞沉淀。

B. 细胞悬液染色

1. 加入 40 μ g/mL Hoechst 33342，室温避光孵育 40 分钟。以约 10 分钟的间隔间歇地混合溶液。

2. 40 分钟后，将 100 nM MTG 添加到相同的细胞悬液中，并在室温下在黑暗中再孵育 20 分钟。

3. 与 MTG 孵育后，将细胞悬液在 4 °C 下在摆动桶转子中以 290 × g离心10 分钟。丢弃上清液并将细胞颗粒重新悬浮在 IPM + 10% FBS 培养基中。

最终体积可以根据分拣机的效率进行调整。在我们的实验室中，对于约 0.7 厘米的约 40 条蠕虫，我们使用 3 mL 的 IPM + 10% FBS 介质。

4. 最后，在细胞悬浮液中加入 1 μg/mL 碘化丙啶，以区分活/死细胞。

5. 对于用于移植或体外培养实验的细胞的 FACS 分选，在步骤 B1 应使用SiR-DNA (1 μ M) 代替 Hoechst 33342。在步骤 B4，对于活/死细胞的区分，使用 10 μ g/mL 的 DAPI 代替碘化丙啶。染色协议的其余部分保持不变。

C. X1 和 X2 MTG 群体的 FACS 门控

1. 对于排序，在 20 psi 护套压力下使用 100 μ m 尖端。使用专有的 BD 鞘液。

注意：在每次分选之前，我们都会通过使用 Sphero ^TMRainbow 荧光颗粒设置适当的激光延迟和使用 BD FACS Accudrop 珠子设置适当的激光延迟来定期校准仪器。此步骤应根据所使用的仪器来完成，并且信息通常随仪器手册提供。

2. 在 FACS 机器中运行 Hoechst 33342 和 MTG 染色细胞。调整前向散射 (FSC) 和侧向散射 (SSC) 电压并制作门 (P1) 以排除碎片和死细胞。

3. 接下来，使用 FSC A（面积）与 FSC W（宽度）点图 (P2) 对单峰进行门控。

4. 在此单线态种群中，选择指示为碘化丙啶阴性事件 (P3) 的活细胞。

5. (Mohamed Haroon et al. , 2021)所示，设置 X1、X2 和 Xins 种群的大门ADDIN CSL_CITATION {"citationItems":[{"id":"ITEM-1","itemData":{"DOI":"10.1016/j.stemcr.2021.03.022","ISSN":"22136711","PMID":"33861990","abstract":"Mitochondrial state changes were shown to be critical for stem cell function. However, variation in the mitochondrial content in stem cells and the implication, if any, on differentiation is poorly understood. Here, using cellular and molecular studies, we show that the planarian pluripotent stem cells (PSCs) have low mitochondrial mass compared with their progenitors. Transplantation experiments provided functional validation that neoblasts with low mitochondrial mass are the true PSCs. Further, the mitochondrial mass correlated with OxPhos and inhibiting the transition to OxPhos dependent metabolism in cultured cells resulted in higher PSCs. In summary, we show that low mitochondrial mass is a hallmark of PSCs in planaria and provide a mechanism to isolate live, functionally active, PSCs from different cell cycle stages (G0/G1 and S, G2/M). Our study demonstrates that the change in mitochondrial metabolism, a feature of PSCs is conserved in planaria and highlights its role in organismal regeneration.","author":[{"dropping-particle":"","family":"Mohamed Haroon","given":"Mohamed","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Lakshmanan","given":"Vairavan","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Sarkar","given":"Souradeep R.","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Lei","given":"Kai","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Vemula","given":"Praveen Kumar","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""},{"dropping-particle":"","family":"Palakodeti","given":"Dasaradhi","non-dropping-particle":"","parse-names":false,"suffix":""}],"container-title":"Stem Cell Reports","id":"ITEM-1","issue":"5","issued":{"date-parts":[["2021","5","11"]]},"page":"1302-1316","publisher":"Elsevier","title":"Mitochondrial state determines functionally divergent stem cell population in planaria","type":"article-journal","volume":"16"},"uris":["http://www.mendeley.com/documents/?uuid=4996400a-7268-3b19-8b46-9fec9e2a3ab9"]}],"mendeley":{"formattedCitation":"(Mohamed Haroon et al., 2021)","plainTextFormattedCitation":"(Mohamed Haroon et al., 2021)"},"properties":{"noteIndex":0},"schema":"https://github.com/citation-style-language/schema/raw/master/csl-citation.json"}。

图 2 。 X1、X2 和 Xins 种群的代表性 FACS 门控。

有关详细信息，请参阅步骤 C2-C5。 FSC-前向散射，SSC-侧向散射，FSC-W宽度，FSC-A面积。 Hoechst 33342 的蓝色（Hoechst Blue）发射可以使用 450/20 带通滤光片收集，红色发射（Hoechst 红）使用 630/40 带通滤光片。

6. 要获得具有富集多能细胞的群体，请在 X1 内门控 MTG Low 细胞。类似地，丰富 X1 细胞内与 MTG 高对应的谱系启动人口门（图 3A）。

7. X2 门也可以分为 MTG Low 和 MTG High 单元。为了丰富 X2 中的 2N 干细胞，根据 MTG 和 FSC 参数制作四个门（图 3B）。

注意：C6-C7：根据目前的理解，在排除 X1 和 X2 群体中的分化后代时，不可能标记准确代表干细胞的 MTG Low 细胞的确切荧光强度或百分比。因此，为了保持一致性，可以将总体分为等百分比的 MTG Low 和 MTG High。

图 3。 (A) X1 和 (B) X2 细胞内的 MitoTracker Green (MTG) 种群的门控策略。

为保持一致性，应对等百分比的 MTG 低和高人群进行门控。 HFSC-高 FSC，LFSC-低 FSC。

D. 用于 SiR-DNA 2N 和 4N MTG 群体的 FACS 门控

1. 如上所述运行 SiR-DNA 染色细胞并设置门 P1 和 P2，以消除碎片和双峰。接下来，门 DAPI 负细胞 (P3) 以获得活细胞。

2. 在活细胞内，门 SiR-DNA 2N (P4) 和 4N (P5) 种群（图 4）。

注意：与 Hoechst 染色不同，SiR-DNA 染色在 FACS 图中不能很好地分离 2N 和 4N 细胞。因此，为确保准确的门控，请使用图 4 中的参考图和其他 Sir-DNA 图（Lei 等人，2019）。或者，可以使用 6000 拉德辐照动物（辐照动物后 2 天以上）作为没有增殖干细胞的对照（Wagner等人，2011）。

图 4 。 使用 SiR-DNA 核染料对 2N（P4 门）和 4N（P5 门）细胞进行代表性 FACS 门控。有关详细信息，请参阅步骤 D1-D2。

3. 要获得与 X1 等效的总体，首先通过在 FSC 与 SSC 图中反向门控 X1 细胞来确定 X1(fs) 门（图 5）（Wagner等人，2011）。在 X1(fs) 种群中，门控 SiR-DNA 4N 种群，如前面的步骤 D2 中确定的（图 5）。

4. 同样，通过在 FSC 与 SSC 图中反向门控 X2 细胞来确定 X2(fs) 门，并在 X2(fs) 门内对 SiR-DNA 2N 种群进行门控（图 5）。

5. 设置 MTG 低和高的门，以及 4N 和 2N 门内的 FSC 低和高，类似于步骤 C7-C8 中解释的赫斯特染色细胞。

图 5。 用于在 X2(fs) 和 X1(fs) 门内分类 2N 和 4N SiR-DNA 种群的代表性 FACS 图。

执行此门控是为了减少 X1 细胞和 X2 细胞的交叉污染，因为与 Hoechst 不同，SiR-DNA 染料不能很好地解决细胞周期阶段。

E. FACS 分拣

1. 对含有 2 mL IPM + 10% FBS 介质的 5 mL FACS 管中的细胞进行排序。使用适当的适配器将收集室保持在 4 °C 。

注意：我们通常使用 BD FACS Aria III 和 BD FACS Aria Fusion 分拣机中描述的“纯度”模式进行分拣。此类分选精度模式因仪器而异，用户应参考仪器手册进行相应设置。用户可以在 FACS 机器中运行分选的样品，以确保分选的纯度。此外，可以对新生细胞标记物（如 piwi-1）进行荧光原位杂交或免疫染色，以检查分选样品的纯度。

2. 使用摆动桶转子在 4 °C 下以 300 × g将分选的细胞离心10 分钟。丢弃上清液并根据下游应用将细胞重新悬浮在适当的体积中。

注意：分选约 100,000 至 150,000 个细胞后的细胞沉淀会非常小，可能不容易看到。

数据分析

使用 BD FACS DIVA 软件分析流式细胞术图。也可以使用 FlowJo 等替代软件。分离的细胞群通过至少三个独立重复的 PIWI-1 标记表达和移植实验来表征（Mohamed Haroon等人，2021）。使用未配对的双尾学生t检验进行统计分析。

食谱

1. 1 × Montjuïc 盐

氯化钠 1.6 毫米

CaC ₃1 毫米

硫酸镁₄1 毫米

氯化镁₂0.1 毫米

氯化钾 0.1 毫米

碳酸氢钠₃1.2 毫米

酸碱度 7.0

2. 含 BSA (CMFB) 的无钙、镁缓冲液（适用于 1,000 mL）

NaH ₂PO ₄ 400 毫克

氯化钠 800 毫克

氯化钾 1,200 毫克

碳酸氢钠₃ 800 毫克

注：上述盐的 10倍浓度可单独制备（过滤和高压灭菌）并作为储备储存。

葡萄糖 240 毫克

HEPES 15 毫米

酸碱度 7.3

牛血清白蛋白 1%

注意：应将 1% BSA 新鲜添加到缓冲液中。

3. IPM + 10 % FBS（对于 1 , 000 mL）

HEPES（游离酸） 7 , 208.8 毫克

HEPES（钠盐） 3，514.1毫克

氯化钠 985.4 毫克

碳酸氢钠₃ 800.1 毫克

氯化钾 26.4 毫克

氯化钙₂ 113.23 毫克

硫酸镁₄ 44.02 毫克

MnCl ₂ 0.19 毫克

KH ₂PO ₄ 68.5 毫克

D-生物素 0.3 毫克

D-葡萄糖 300 毫克

D-海藻糖 50 毫克

三辛 2.5 毫克

MEM 必需氨基酸 2 毫升

MEM 非必需氨基酸 5 mL

MEM 维生素溶液 3 毫升

丙酮酸钠 14 毫升

青霉素/链霉素 10 mL

L-谷氨酰胺 2 毫升

胎牛血清 100 毫升

酸碱度 7.3

致谢

该协议主要改编自我们实验室最近发表的工作（Mohamed Haroon等人，2021）。作者感谢中央成像和流式细胞仪设施 (CIFF-BLiSc 校园) 提供最先进的流式细胞仪设施。 MMH 感谢 DBT 通过 DBT-JRF 计划资助研究生学习。 DP 承认来自 DST 的 Swarnajayanti 奖学金 (DST/SJF/LSA-02/2015-2016)。 DP 和 PKV 感谢 inStem 生物技术部的核心资助。

利益争夺

作者声明没有竞争或经济利益。

参考

1. Lei, K., Mckinney, SA, Ross, EJ, Lee, HC 和 Alvarado, AS, (2019)。培养的多能涡虫干细胞保留效力并从外源引入的 mRNA 中表达蛋白质。 BioRxiv 573725 。

2. Hayashi, T.、Asami, M.、Higuchi, S.、Shibata, N. 和 Agata, K. (2006)。通过荧光激活细胞分选分离涡虫 X 射线敏感干细胞。开发增长差异48(6): 371-380。

3. Higuchi, S.、Hayashi, T.、Hori, I.、Shibata, N.、Sakamoto, H. 和 Agata, K. (2007)。通过超微结构分析对荧光激活细胞分选的涡虫干细胞进行表征和分类。开发增长差异49(7): 571-581。

4. Mohamed Haroon, M.、Lakshmanan, V.、Sarkar, SR、Lei, K.、Vemula, PK 和 Palakodeti, D. (2021)。线粒体状态决定了涡虫中功能不同的干细胞群。干细胞报告16(5): 1302-1316。

5. Niu, K., Xu, H., Xiong, YZ, Zhao, Y., Gao, C., Seidel, CW, Pan, X., Ying, Y. 和 Lei, K. (2021)。在涡虫 SirNeoblasts 中鉴定的典型和早期谱系特异性干细胞类型。细胞再生10（1）：15。

6. Wagner, DE, Wang, IE 和 Reddien, PW (2011)。克隆新生细胞是多能成体干细胞，是涡虫再生的基础。科学332（6031）：811-816。

7. Wang, IE, Wagner, DE 和 Reddien, PW (2018)。第 20 章：通过次全照射和单细胞移植对涡虫干细胞进行克隆分析。 方法 Mol Biol 1774：475-495。