材料和试剂

1. 96孔板： TPP®组织培养板96孔，平底（Merck，目录号： ^Z707902）

2. 实验琼脂板： PlusPlates（Singer Instruments，目录号：PLU-003）

3. 固定垫：RePads 96 长针（Singer Instruments，目录号：REP-001）

4. 14 mL Falcon ^®圆底管，带卡扣（VWR，目录号： 734-0985）

5. 酵母单倍体缺失突变体集合（BY4741（Mat a）transOMIC 技术，目录号：TKY3502）

6. 酵母纯合二倍体缺失突变体集合（BY4743，transOMIC 技术，目录号： TKY3500）

7. 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）

8. 蛋白胨（VWR，目录号：ICNA0210480805）

9. 酵母提取物（VWR，目录号：J850）

10. 不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱（ Formedium，目录号： CYN0510）

11. 琼脂（VWR，目录号：J637）

12. 硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A4418）

13. 含有所有氨基酸的完整补充剂混合物（ Formedium，目录号： DCS0019)

14. 琥珀酸（Sigma Aldrich，目录号：398055）

15. NaOH（Sigma Aldrich，目录号：S5881）

16. 40% (w/w) 葡萄糖（见食谱）

17. YPD 液体培养基（见配方）

18. 10 ×氨基酸混合物库存（见食谱）

19. 10 ×琥珀酸缓冲酵母氮基 (YNB) 库存（参见食谱）

20. 10 ×氨基酸混合物库存（见食谱）

21. 超纯 (Milli-Q) 水（参见食谱）

22. 琼脂混合物（见食谱）

设备

1. 用于摇板（Vibrax VXR basic，IKA，德国）

2. 钉扎机器人（RoToR HDA；Singer Instruments，英国）

3. × 58 W 灯管的开放式工业灯管接头（Mir，Elektroskandia，产品编号 E72 106 41）

4. 过滤紫外线辐射的荧光灯管 (Osram L 58 W/940)

5. 样品架：对于每个板，两个肋条将板固定在地面上，以允许空气流通和与灯的特定距离

6. 光谱仪（QE65000-FL，海洋光学）

7. 印版成像（数码相机 D5000 Nikon 和 Epson Perfection V700）

软件

1. MATLAB ^®（用于高通量和中等通量分析）

2. QuantityOne（Bio-Rad，用于连续稀释液滴测试）

程序

A. 细胞板制备

正确和一致地制作琼脂板很重要，以在机器人固定时实现标准化和均匀的细胞转移。浇铸琼脂板时，重要的是始终使用相同体积（精确为 50 mL/板）的混合良好的培养基每块板，并让板在完全水平的表面上凝固。如果凝固表面不水平，这将产生具有非水平琼脂表面的板，其中钉扎机器人在钉扎期间将细胞不均匀地施加在板上。如果板是用不同于 50 mL 的琼脂培养基制成的，则可能会由于板之间的琼脂表面形状和特性的改变而导致不均匀的水合和可变性。筛选前应检查所有琼脂平板，以确保平板质量和水合水平在一组平板之间保持一致。因为某些印版缺陷仅在固定阶段才能检测到，所以请确保铸造一些额外的印版，而不是严格需要的印版。可变性的一个相关来源是琼脂培养基的特定硬度，它会影响细胞的固定和转移。与 Rotor HDA 机器人一起使用的最佳钉扎压力将根据所使用的特定琼脂板的硬度而有所不同（通常与琼脂浓度有关）。

将细胞转移到琼脂板上的过程是评估酵母细胞在可见光下生长能力的关键步骤（Molin等人，2020 年）。如果太多细胞被转移到同一个位置，顶部的细胞会屏蔽并保护下面的细胞免受光照（这使它们生长），导致生长评分为耐光性，即，在较高的初始细胞密度所有细胞/突变体将出现耐光（图1A）。图 1B显示了用于设置筛选条件的野生型 (wt) 对照和阳性对照菌株 (缺乏抗氧化转录因子 Yap1，因此是光敏的) 如何对光照做出不同的反应，具体取决于细胞密度斑点。琼脂对琼脂的固定导致较大的细胞块转移到同一位置，导致所有细胞生长，包括阳性对照（Molin等人，2020）。因此，对于使用钉扎机的高通量和中等通量筛选，液体到琼脂转移应该是用于更好地控制实验板上的初始细胞密度的细胞转移模式。应注意确保每个菌株转移的细胞数量是偶数。

图 1.由于对初始细胞密度的强烈依赖，以及光照对温度的影响，酵母突变文库的高通量筛选光敏性需要一些特殊的适应。

一个。与对照菌株相比，光敏突变体生长的示意图，考虑到初始细胞密度。由于可以对光敏度进行评分的分析窗口相当窄，因此屏幕操作起来很精致。 B. 光强度和初始细胞密度都会影响酵母菌株的光敏感性，正如在野生型和yap1Δ突变菌株上观察到的那样。 C. 图像显示野生型和阳性对照yap1Δ 之间的生长对比，使用与全基因组筛选实验相同的实验程序和格式（384 个菌落/板）。 D. 紫外线过滤荧光灯 (Osram L 940) 的光谱与实验室中普通荧光灯 (Philips Master 830) 的光谱对比。插图显示了 350-450 nm 范围的扩大。请注意，对于经过紫外线过滤的 Osram L 940，普通灯中约 360 nm 处的紫外线范围内的峰值不存在。EF。所用实验装置的概述 (E) 和图片 (F)。

使用这样的设置，可以产生适合高通量筛选的生长条件，在此期间，阳性对照菌株yap1 Δ在光照下不会生长，而对照菌株生长良好（图 1C）。由于难以在高通量筛选中为所有菌株实现最佳细胞密度，建议将每个菌株连续固定到多个位置，从而获得一定范围的细胞密度。在我们的研究中，串行固定是在我们的第一个验证测试中完成的（Molin等人，2020）。然而，这个程序也可以应用于主要的全基因组筛选，但代价是处理更多数量的板来代表整个酵母突变体集合。对于选定数量的突变体的验证研究，应使用连续跌落测试来更好地控制曝光期间可比较的初始细胞密度。

1. 筛选收集准备步骤 1 -突变收集的液体到琼脂固定

a. °C 下长期储存，96 孔板需要在室温 (RT) 下解冻，然后再固定。

b. 使用 96 格式的长针垫将解冻的库存源板固定到固体 YPD 琼脂实验板上，使用固定机器人以 384 阵列格式固定。此步骤中的 YPD 培养基可确保冷冻细胞的良好存活和恢复。

c. 对于源板，在距井底 0.1 mm 的距离处应用 2D 目标混合 10 次，混合速度为 25 mm/s，混合直径为 1 mm。对于固定在琼脂上，固定压力为 7%，琼脂过冲量为 2 mm，固定速度为 19 mm/s。

注意： 删除集合包含多个突变体，这些突变体对直接被拾取到液体介质上很敏感。因此，强烈建议首先将收集到固体 YPD 琼脂上。这也允许将集合浓缩到 384 阵列格式，这将使用 ¼ 板。此外，任何丢失的菌落通常可以在后期手动拾取和接种。

2. 筛选收集准备步骤 2 -突变收集的琼脂到液体固定

a. 使用钉扎机器人从 384 阵列格式集合 YPD 琼脂库存板中钉入平底 96 孔板（每孔手动预加载 300 µl YPD）。

笔记：

i. 为了有效搅拌，不应使用圆形底板，因为无论搅拌如何，细胞都会聚集在孔的底部中心。

ii. 虽然这里没有测试，但应该指出的是，可以使用液体处理机器人将液体突变培养物转移到固定板。作为对合适的液体培养量的粗略估计，我们测量了 Singer RePad 上每个针脚转移的液体量，以涉及亚微升范围内的体积（~0.1微升）。

b. 对于从琼脂源板固定，固定压力为 7%，琼脂过冲为 2 mm，固定速度为 19 mm/s，并使用默认值在源板上混合。对于目标液-介质板，在距孔底 0.1 mm 处重复 10 次 2D 源混合，混合速度为 25 mm/s，混合直径为 1 mm。

注意： 在琼脂源板上应用混合可以更一致地固定小菌落，因为固定垫的针脚有效地覆盖了更大的区域。

3. 初级全基因组筛选——液体到琼脂固定在平板上

a. 在 30°C 的 300 μL 液体 YPD 培养基中，将细胞在 96 孔微量滴定板中预培养 48 小时，无需搅拌。

注意：尽管我们在丰富的未定义 YPD 培养基中培养液体预培养物（Molin 等人，2020） ，但我们认为没有理由不能在合成的完全液体培养基中预培养细胞（类似于我们在实验板但缺少琼脂）。与此相关，我们认为 YPD 培养基不适合实验板，因为它们的颜色会影响对光的曝光（尤其是穿过琼脂的反射光）。

b. 固定前，以 500 rpm（使用 Vibrax VXR 基本摇床）摇动板 10 分钟，以确保正确混合和优化/一致的细胞转移。酵母细胞致密，静置时间过长容易沉淀，这就是为什么我们在固定前分批摇动 4-5 个板（每个板固定大约需要 3-5 分钟，包括手动安装板和重新填充）固定垫）。整个突变体集合在 96 孔格式的 61 个平板上（包括已收集生长缓慢的突变体的 5 个平板）或 384 格式的 16 个平板（包括两个具有缓慢生长的平板）。因此，对于整个突变体集合，固定过程将需要几个小时。

c. 使用固定机器人和 1:4 阵列，使用 96 格式长针垫将液体预培养源板（每个琼脂实验板四个不同的 96 孔板）固定到 384 阵列中的固体琼脂实验板上（图 2）设置（参见SINGER INSTRUMENTS ROTOR HDA 用户手册 Pdf 下载 | ManualsLib中的 SINGER INSTRUMENTS ROTOR HDA 用户手册，v1.2，第 24 页）。用于在光照期间评估细胞生长的琼脂靶板含有含 2% 琼脂的合成完全培养基。

d. 我们使用了默认版本的 pinning 程序。为了从液体培养源板中很好地提取细胞，最好在距离孔底 0.1 mm 处使用 2D 源混合 10 次重复，混合速度为 25 mm/s，并且混合直径为 1 mm。对于固定在琼脂靶板上，固定压力为 7%，琼脂过冲量为 2 mm，固定速度为 19 mm/s。每个菌落固定一次，因为重复固定在同一位置会导致接种的细胞数量增加，这可能不利于评估光敏性。

图 2.在不同曝光时间点成像的酵母光敏度主屏幕示例板以及相应的暗控制。

为了识别光敏突变体，使用自动图像分析算法分析在第 0 天和第 6 天拍摄的平板照片，以及在第 0 天和第 1 天在黑暗中孵育的对照平板。绿色和橙色环表示突变菌落评分为对光敏感，分别具有高度和中等置信度。红色环表示一个突变菌落既不在黑暗或光照培养的平板上生长，说明在对光敏感度评分时需要考虑两种条件下的生长。板边缘的白色矩形包围了野生型对照。图 S1-S4中提供了可用于测试评分算法的板的高分辨率图像 HYPERLINK "https://os.bio-protocol.org/attached/file/20220111/Supplementary%20Figures%20S1%20S4.docx" 。

注意：我们仅将应变固定在实验板上的一个位置，以尽量减少在曝光设置中要处理的板数量。然而，为了在测量中获得更好的精度，也可以选择在每块板上进行一些技术复制，但代价是必须设置更广泛的曝光台。我们的策略是改为在初始屏幕中对阳性命中应用两层后续验证（Molin 等人，2020）。

e. 重要的是在所使用的突变集合中加入大量野生型或类似野生型的对照，这些对照稍后将用作设置评分阈值的对照，并通过实验估计假阳性的数量，如解释的那样在本协议的数据分析部分。这在材料和试剂中列出的删除集合中没有提供。我们在每个板上使用了 76 个（在我们的例子中是 his3∆突变株）对照，正如在 Boone 实验室设置的单倍体 Mat 缺失集合中所实现的那样（Tong等人，2001），整个实验总共增加了 1,064 个对照.

4. 第一次验证测试，中等通量测定——使用可变细胞密度的重复固定将液体到琼脂固定在板上。

为了提高最终评分的精度，从主屏幕中选择的光敏菌株可以连续固定到多个板位置，以获得细胞密度的浓度梯度（图 3A-3B）。使用与主屏幕所述相同的固定程序，但仅使用一个 96 孔板接种一个 384 格式，导致板上每个菌株的四个菌落。然而，通过在四个钉扎中的每一个之间引入时间延迟（在这种情况下，中间的板不晃动），细胞沉降将导致每个钉扎轮转移的细胞数量减少。默认程序选项应用于液体到琼脂的转移，这意味着没有 2D 源混合。在图 3C 中可以看到以这种方式执行的中等通量后续屏幕的板示例图像。

注意：在验证测试期间使用来自与初级筛选不同的集合的缺失突变体（例如，纯合二倍体缺失突变体集合）可降低交叉污染影响最终评分的风险。此外，预计纯合二倍体缺失突变体集合将缓冲可能已经积累的隐性抑制突变，因为任何此类突变很可能是杂合的。

5. 第二次验证测试，低通量测定 - 连续稀释下降测试，以更精确地控制较少数量的光敏菌株

可以执行基于定量连续稀释的第二次确认测试（图 3D-3E）。这种方法可以定量测量光敏感度，对光照期间突变体的生长速率进行排名（光照期间的生长相对于它们在黑暗控制中的生长）。我们建议准备五个十倍系列稀释液，起始稀释度为 OD ₆₁₀~1（在液体培养基中生长 24 小时导致 OD ~4），然后将每种稀释液的 7 μL 点样到如上制备的 SC 琼脂板上，然后要么受到光照，要么在黑暗中孵化。

图 3。 适用于对酵母光敏感性进行评分的中等通量和低通量验证分析。

一个。在中等通量测定中，每个菌株被固定在板上的四个不同位置（如象限）。左上角的其中一种菌株的固定顺序显示。在四个钉扎之间施加了轻微的延迟，导致细胞梯度像稀释系列一样被转移。 B.对所有测试的 96 个菌株中重复钉扎所施加的平均稀释度进行量化。方框中的线表示中位数和方框边界，分别是第 25 和第 75 个百分位数。 C.在不同时间点对 96 株菌株进行中等通量验证测定的平板示例图像。 D.定量系列稀释液滴测试验证分析。菌株首先被稀释到相同的细胞密度 (OD ₆₁₀~1)，在五个连续的 10 倍稀释液中进一步稀释，然后点样到琼脂板上。板要么暴露在光线下，要么保持在黑暗中并每天成像。野生型的图像， yap1Δ和nsr1Δ菌株在黑暗控制和光照平板上生长 2 天后。 E. D 中所示菌株的生长曲线，其中细胞斑点强度已针对 6 天以上拍摄的图像进行了估计。

B. 曝光实验装置

1. 为了最大限度地减少细胞中紫外光引起的 DNA 损伤，即确保仅测量由可见光 (400-700 nm) 引起的生长缺陷，请使用由紫外辐射过滤荧光灯组成的光源，例如。 , Osram L 940。我们使用了三个平行的灯管，每个 58 W，安装在一个开放式标准灯管配件中，配备反射器，但没有偏转网格。图 1D 显示了该灯与常用的非紫外线过滤荧光灯 (Philips Master 830) 相比的光谱。可以使用光纤耦合光谱仪（例如，QE65000-FL，Oceans Optics）直接测量来自灯的光谱。确保通过琼脂板的盖子测量光谱，因为在实验过程中，板将被盖子覆盖，以尽量减少蒸发。为了防止琼脂脱水，盖子和底座之间的板边缘应该用封口膜封闭。为了增加光强度，并使光照射在板上的均匀分布，应在每个板的外侧底部贴一张白纸。

2. 将板放在光源下方，顶部（盖侧）向上（图 1E-1F）。确保测量距反射器边缘不同距离的光强度。在我们的例子中，光强度向边缘下降，因此，我们确保不要将任何实验板放置在距离灯边缘大约 30 厘米的地方（图 1F）。灯和板之间的距离应该以这样一种方式进行优化，即在野生型和阳性对照yap1Δ之间获得显着的生长对比。现场强度应为 ~35 W/m ²（在我们使用三个 58W 灯的情况下，使用的距离为 20 cm）。由于板中的温度取决于与光源的距离和实验室中的温度，因此必须控制板周围的环境以达到板中所需的温度。在我们的例子中，将盘子放在薄肋上（图 1E-1F），允许良好的通风，在温度约为 21°C 的房间中，盘子中的温度约为 30°C（请注意，温度已经板内测量），而如果将板直接放在工作台上，则约为 34°C。

3. 对照板（无照明）应保持在与在光照下（30°C）孵育的板相同的温度下的黑暗中。

4. 定期对板进行成像或扫描。对于高通量和中通量屏幕，我们使用 12.3 兆像素数码相机（D5000，尼康，日本）在 0、1、2 和 6 天后对印版进行成像。图 2 显示了在全基因组筛选过程中不同时间点拍摄的示例图像。对于低通量验证连续跌落测试，我们在 1、2、3、5 和 6 天后使用照片扫描仪扫描了平板（ Epson Perfection V700）设置为传输模式（图 3D-3E）。

注意：为了获得更高的细胞数估计精度，可以在透射模式下扫描高通量和中等通量筛选中使用的板并量化细胞数，就像在基于板的 Scan-o-matic 高通量表型中执行的一样方法（Zackrisson 等人，2016 年） 。

数据分析

1. 初级全基因组筛选

由于每个菌株难以转移相同数量的细胞，并且由于生长对细胞密度的依赖性，因此应谨慎评估全基因组筛选中突变体的光敏性。为了客观地评估光敏生长，应使用自动图像分析工具。在我们的研究中，我们使用了一套内部开发并在^MATLAB®中实现的图像分析算法（图 4）。我们的图像分析方法的整体设计是基于计算细胞密度估计，而不仅仅是测量菌落面积，以获得最佳的定量精度（Zackrisson et al. , 2016）。造成这种情况的主要原因有两个：1) 对第 0 天的细胞密度进行良好估计，其中钉扎后的所有细胞斑块大小大致相同，但可能包含不同数量的细胞，以及 2) 规避在边缘菌落覆盖更大区域的平板上酵母生长过程中遇到的剧烈空间效应（Baryshnikova等人，2010 年）。我们的图像分析算法是按照以下方式制定的，可以在适当缩放像素大小和强度值后采用。根据每个板的照片（反射图像）中的像素值计算每个板 384 个菌落的细胞密度估计值 (CDE)（图 4）。 CDE 近似对应于减去局部背景后菌落中像素强度的总和。 MATLAB ^®代码的设计使得每行 24 个菌落（在我们的例子中，每行高 30 像素，宽 1440 像素）最初是单独分析的。每行的强度分布是通过对每列的前 25 个像素值求和来计算的（30 像素高的列，图 4A-4C）。提取每列总和的基本原理是增强微弱菌落的信号与背景关系（参见例如图 4A-4B 中最左侧的菌落）。接下来，通过跨过轮廓（图 4B）提取每个菌落的强度轮廓，步长为 60 像素（对应于菌落之间的中心到中心距离），菌落像素值集中在每个步骤。对于每个菌落轮廓，然后通过取中心 20 个像素值的前 10 个像素值的中值来计算菌落强度（图 4B 中的绿线）。背景强度（图 4B 中的蓝线）是通过取轮廓中菌落左侧和右侧（对应于像素 5-20 和像素 40-55）的最小总像素值的平均值来计算的。然后使用图 4D 中概述的 MATLAB 代码，通过从菌落强度（图 4B 中的绿线）中减去背景强度（图 4B 中的蓝线）来计算 CDE。

由于第 0 天的细胞浓度会影响光照期间细胞的生长反应，并且由于第 0 天的细胞浓度在固定菌落之间有所不同，因此第 0 天和第 6天的 CDE都用于光敏感性评分。识别光敏突变体的阈值设置基于野生型对照的实验分布（在我们的例子中为 1066 his3Δ ；视为野生型对照）。如图 5A 所示，与初始细胞密度相关的控件的光依赖性增长以二进制方式分布。

图 4。 用于估计酵母在光照下生长的图像分析算法。

A. 每个板块分为 16 行，每行 30 像素高。屋宇署。通过对每列中的 25 个最高像素求和，生成该行中 24 个菌落的二维强度分布。每个菌落的前 10 个像素的中值用作菌落强度（绿线）。在每一侧计算每个菌落的背景值，这些值应取平均值（蓝线）。通过从菌落强度中减去背景来计算用于评分生长的 CDE。光盘。用于图像分析的中央MATLAB®^代码。

这种二元分布用于识别我们所说的“自信集”，用于识别光敏突变体。在我们的案例中，初始 CDE _day0≥ 121 CDE 的对照菌落在光照下表现出良好的生长（耐光），而 CDE _{day0 < 121 的菌落表现出不同的分数，而 CDE day0 ≤ 60}的对照菌落都是光照-敏感（图5A）。因此，根据对照细胞的反应谱，使用两种不同的标准来选择光敏突变株：（i）高置信度集：CDE _day0≥ 121，和 CDE _day6< 900（图 5A-5B，浅灰色框），以及 (ii) 中等置信度集：61 ≤ CDE _day0≤ 120，并且 CDE _day6< 400（图 5A-5B，深灰色框）。估计率根据我们测定中使用的 1066 个对照的分布，假阳性分别为 0.1% 和大约 5% 的高置信度和中等置信度组（Molin等人，2020 年）。

为了避免错误地将生长缓慢的缺失菌株错误地评分为光敏感，需要将每个突变体在光照下的生长与其在黑暗中的相应生长进行比较（图 2，图 5C）。因为在光照下生长要慢得多，所以建议将光照期间直到第 6 天的生长与直到第 1 天没有光照的生长进行比较。最后，每个缺失菌株的光敏度应归一化为同一板上存在的内部对照 ( his3Δ ) 中位数的光敏度，以估计双归一化光生长（归一化为暗生长和对照应变光/暗生长）。因此，每个缺失菌株j的LGnorm _j为：

LGnorm _j= (LG _j/DG _j)/(LG _ctr/DG _ctr)

其中 LG _j和 LG _ctr分别是缺失菌株 j 的 CDE 和对照的 CDE（在我们的例子中 n = 384），在光照生长 6 天后，DG _j和 DG _ctr是缺失菌株 j 的 CDE 和在黑暗生长 1 天后，分别用于对照的 CDE。使用每个板上对照的光/暗生长的中值，这对于初始细胞密度的高置信度范围和中等置信度范围是独立完成的（由于两个范围的中值略有不同；如果任何范围的值缺失，则可以使用相邻板块的中值）。初级全基因组筛选和确认试验中的光敏缺失菌株称为 LGnorm _j< 0.75 的菌株。建议将在黑暗生长的第一天菌落大小增加不到 1.5 倍的非常缓慢生长的缺失菌株排除在分析之外，因为在整个测量期间整体生长不良的数据不安全，与光照无关.

为了检测在光照期间比对照生长更好的抗性突变体，CDE _day6> 1642 的突变体可能被认为是抗性的 [我们筛选中的 52 个突变体(Molin等人，2020) ]，使用相同的固定后细胞密度阈值标准， 61 ≤ CDE _day0，对于光敏突变体。但是，对于耐光性，分析窗口要紧得多，并且根据对照的增长，在这种情况下估计的误报率为 20%。

笔记：

a. 不同的全基因组酵母突变体集合在盘子上具有特定的空间设计。我们在我们的光敏性屏幕中使用了一种设计（Molin 等人，2020） ，将对照菌株分布到平板的外部区域，作为平板上突变体的“屏障”，防止额外营养物质对板的外侧（Tong 和 Boone，2006 年；Tong 等人，2004 年） 。然而，同样可以，甚至可能更优选地使用控制应变均匀分布在板的整个表面上的设计（ Zackrisson et al., 2016)以获得控件的空间分布响应。

b. 因为所获得的阈值 CDE 的确切值会随着所使用的设置而变化，所以下面我们将简要介绍如何设置评分标准的基本原理。

首先，通过将它们在第 6 天的值与第 0 天的值作图来评估板上野生型对照的细胞密度估计值。这背后的逻辑是，实验开始时的细胞密度将强烈影响观察到光敏性。因此，必须在应用的评分方案中补偿接种的细胞密度。

其次，根据曝光后野生型CDEs的分布情况确定光敏度的评分阈值。例如，可以通过以下方式分配高置信度评分阈值：两个 CDE 值阈值都变得足够低，以至于只有 0.1% 的野生型接种物生长 [图 5A 中的浅灰色框（Molin 等人，2020） ]。

第三，由于野生型对照中第 0 天和第 6 天的 CDE 值分布，这种高置信度集将不可避免地导致相对较高数量的假阴性，即遗漏光敏突变体。因此，建议设计第二组稍微宽松的评分标准，其中 CDE 第 6 天的值确实非常低，但第 0 天的值也很低，总共允许约 5% 的野生型菌落生长 [深灰色图 5A 中的框（Molin 等人，2020 年） ]。

2. 首次验证测试，中等通量测定

在选定的光敏突变体的后续中全研究中，菌株应按照初级筛选进行评分，使用对照菌株的实验分布来定义评分阈值（如上所述）。我们筛选的以下阈值可以作为指导线——单倍体集：高置信度 CDE _day0≥ 13 和 CDE _day6< 900（未定义中等集，因为所有对照菌株，即使在低初始细胞密度下，在光照期间生长良好） ;二倍体组：高置信度 CDE _day0≥ 105 和 CDE _day6< 900，中等置信度 45 ≤ CDE _day0≤ 104 和 CDE _day6< 500。用铝箔包裹并在黑暗中保存的对照板（无光照） 30°C 用于构建上述所有突变体的暗归一化光敏感度，使用与初级屏幕控制相关的相同 75% 阈值。在图 5D（二倍体集）中可以看到突变体光敏性的差异评分示例，具体取决于中通量确认测定中发现的细胞密度。

图 5。 酵母光敏性的强烈细胞密度依赖性和一些突变菌株的缓慢生长需要仔细设置评分标准。

A. 对照菌株在第 6 天与第 0 天提取的 CDE（总共 1,064 个菌落）。表示高置信度集（浅色框）和中等置信度集（深色阴影框）（参见正文以了解评分的解释-评分标准 I）。 B. 突变体的光敏分布。高置信度集（浅阴影框）和中等置信度集（深阴影框）。 C. 光敏和非光敏突变体的示意性生长曲线，根据使用的评分程序，考虑到光照和黑暗中的缓慢生长（评分标准 II）。 D. 从初始全基因组筛选中选择的 96 个突变体的光敏性也在培养基通量确认测定中得到确认，作为起始细胞密度的函数。仅显示基于标准 I 的命中。绿点表示光敏命中，黑点表示无光敏（无命中）。 x 轴显示第 0 天的各种初始细胞密度 (CDE)。突变体根据其光敏感性分类，其中在第 0 天具有高 CDE 值的敏感命中被认为比具有较低的 CDE 强度。

3. 第二次验证测试，低通量测定

从第 3 天开始，在光照下培养的板的板扫描适用于使用 QuantityOne（分析软件版本 4.6.8，图 3D-3E）进行定量。为了优化生长分辨率并获得最佳定量数据，将暗对照 (OD ₆₁₀~0.1) 的第二次稀释与光应激细胞的第一次稀释 (OD _{610 ~1) 进行比较，因为生长速率差异很大}在光照和黑暗条件下。与野生型相比，为了弥补缺失菌株在黑暗中较慢的生长，可以应用背景减法 (INT/mm ^{2 ) 后每面积单位的相对细胞斑点强度来计算菌株特异性光/暗比}。对于一些生长缓慢的菌株，可以在第 5 天提取光值（在相同的稀释度下），以获得更可靠的量化。

如上所述（程序，步骤 A3d），我们选择不在实验板上复制突变点，而是进行三层验证分析。关于测定重现性，可以提到的是，我们能够确认 22 个突变体中的 19 个（86%）在初级筛选中以高置信度被评分为光敏感，即，我们能够将它们评分为光-在中等通量验证测定中也很敏感（Molin等人，2020）。同时，52 人中有 36 人（69%）在初级屏幕中以中等置信度评分为光敏感，在中等通量验证测定中也显示出光敏感。还应该提到的是，在初筛的 16 个阴性检出中，不少于 6 个在中通量验证测定中重新评估时显示出光敏性，证明了高通量筛选测定中的大量假阴性使用的设置（Molin等人，2020）。因此，在未来的光敏性筛选中，建议增加得分的突变菌落复制的数量，并仔细设计评分标准以减少大量假阴性呼叫。

使用低通量验证测定（点测），我们重新评估了来自单倍体缺失集合的 34 个突变体的光敏感性，这些突变体在初级筛选中被评为敏感（Molin等人，2020）。在这里，假设方差相等（在我们的例子中 n = 2），通过双边学生t检验评估与对照相关的每个菌株的统计显着性。在来自单倍体缺失突变体集合的 34 个突变体中，在初级筛选中得分为阳性，当评估相应的纯合二倍体基因敲除的光敏感性时，24 个（71%）得分为阳性。如原始出版物中所述，在单倍体缺失突变体中进行的初步筛选与不同突变体集合（纯合二倍体）中的后续筛选之间的低重叠可能与基因-环境对单倍体与二倍体生长的影响差异有关。莫林等人，2020）。支持这一观点，当在纯合二倍体缺失集合中使用中等通量验证分析进行重新测试时，76 个突变体中只有 46 个（60%）在单倍体缺失突变体的初级筛选中得分为光敏感，相比之下，55 个突变体当对单倍体缺失突变体使用中等通量验证测定时，总共有 74 个（74%）。

笔记

有关实验设置的注释，包括警告点和改进建议，已添加到上述相关部分。

食谱

为了准备用于预培养的接种液体培养基 (YPD)，请使用无菌技术准备以下内容。

1. 40% (w/w) 葡萄糖

a. 在搅拌下将 20 克葡萄糖溶解在 30 克 Milli-Q 过滤水中。

b. 添加超纯水，总重量可达 50 克。

c. 高压灭菌葡萄糖混合物并在室温下储存。

2. YPD液体培养基

a. 在合适的烧瓶中加入 5 克酵母提取物和 10 克蛋白胨。

b. 在搅拌下用 Milli-Q 过滤水填充至 475 mL。

c. 高压灭菌 YP 液体并使其冷却。

d. 添加 25 mL 的无菌 40% (w/w) 葡萄糖溶液

3. 10 ×氨基酸混合物库存

a. 将 10 倍于建议量的含有所有氨基酸的完整补充剂混合物 (CSM) 混合到 0.1 L 的 Milli-Q 过滤水中。

b. 搅拌，让它完全溶解。这可能需要几个小时。

c. 将氨基酸混合物无菌过滤到无菌瓶中，以便在 RT 中储存。

对于铸造实验琼脂培养基板（20 个合成完整培养基板），使用无菌技术准备以下。

4. 10 ×琥珀酸缓冲酵母氮基 (YNB) 库存

a. 将 1.7 克不含氨基酸和硫酸铵的 YNB、5 克硫酸铵、10 克琥珀酸和 Milli-Q 过滤水混合成 95 mL 的总体积。

b. 让组分在搅拌下溶解。

c. 使用 NaOH 将 pH 值设置为 5.8。

d. 用 Milli-Q 过滤水填充至 0.1 L。

e. ×琥珀酸缓冲 YNB无菌过滤器放入无菌瓶中，在 RT 中储存。

5. 10 ×氨基酸混合物库存

a. 将 10 倍于建议量的含有所有氨基酸的完整补充剂混合物 (CSM) 混合到 0.1 L 的 Milli-Q 过滤水中。

b. 搅拌，让它完全溶解。这可能需要几个小时。

c. 将氨基酸混合物无菌过滤到无菌瓶中，以便在 RT 中储存。

6. 对超纯水进行消毒并储存在 RT 中。

7. 琼脂混合物（应在板浇铸前立即制备）

a. 将 0.75 L 的 Milli-Q 过滤水与 20 克琼脂混合。

b. 高压灭菌并立即进行第 8 步。

8. 将储备溶液添加到琼脂混合物中

a. 在温暖的新鲜高压灭菌琼脂混合物中，边搅拌边添加：100 mL 的 10 ×琥珀酸缓冲 YNB、100 mL 的 10 × CSM 混合物和 50 g 的 40% 葡萄糖。加入高达 1,000 mL 的无菌水，并让成分完全混合。

b. 使用每盘 50 mL 的体积倒入盘子。

在板浇注过程中形成的气泡可以使用红热铂接种环直接去除。

c. 确保将板留在完全水平的表面上固化。

为确保表面平整，请勿将盘子堆叠得高于四个堆叠。

由于 YPD 板不用于量化，因此只需在高压灭菌前向 YPD 培养基中添加 2%（重量/体积）琼脂即可制备它们。在高压灭菌并彻底混合后，应按照第 8(b) 和 9(c) 点所述的同样小心方式浇铸 YPD 板。

致谢

这项研究得到了瑞典研究委员会 (VR, #2011-5170; 2020-05422)、Cancerfonden (#2017-778)、Olle Engkvist byggmästare 基金会和 Carl Trygger 基金会对 MM 和瑞典研究委员会的资助(VR) 到 AB (#621-2007-5421)。该协议源自 Molin等人的原始研究文章。（2020）； doi: 10.1186/s12915-020-00867-4。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

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