材料和试剂

1. 22 × 22 mm（7/8 × 7/8"）微型盖板玻璃，方形，No.1（VWR，目录号：48366-067）

2. Superfrost 显微镜载玻片，25 × 75 × 1（费舍尔，目录号：12-550-143）

3. ProLong Gold Antifade 试剂（Fisher，目录号： P10144）

注意：对于以下所有试剂，请参阅配方以了解适当的稀释/混合以创建工作溶液。

4. 三卡因甲磺酸盐（MS-222 有时称为 MESAB、三卡因-S、Syndel）

5. TCA（三氯乙酸，Sigma，目录号： T6399-500G）

6. Triton X-100（VWR，目录号： 0694-1L）

7. Western Block（Sigma，目录号： 11921673001）

8. 甘油（VWR，目录号：AAAA16205-0F）

9. 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)

设备_

1. Dumont 医用镊子，5 型，高精度，0.01 mm × 0.05 mm（EMS，目录号：72877-D）

2. 台式管式摇杆

程序

A. 第一天 - 修复和阻止

注意：注明的日期是针对标准程序的。步长可以修改（见下文），并将改变执行特定步骤的天数。

1. 麻醉您的鱼（使用三卡因甲磺酸盐，鱼将在不到一分钟的时间内被麻醉），然后分选到 1.5 mL 微量离心管中（每管少于 100 条鱼）。

2. 从冷冻等分试样中制作新鲜的 2% TCA 溶液。

3. 使用巴斯德吸管，从微量离心管中除去任何多余的鱼水。

4. 将 1 mL 的 2% TCA 添加到您的幼虫中，并在室温 (RT) 下摇动 3-4 小时。确保液体和鱼在微量离心管内移动。

5. 在 1 mL 的 PBS 中清洗 5 × 5 分钟。

6. °C的台式管摇杆上使用 1 mL 的西部块过夜。

B. 第二天——一抗染色

1. （选项 A）- 解剖，然后染色

注意：另一种解剖方法在协议的末尾，请参阅 F.

a. 将胚胎放入带有 1 × PBS 的 Sylgard 板中。

b. 用 Western Block 准备新的微量离心管。解剖的幼虫将被放入这些管中。

c. 在解剖过程中使用别针固定幼虫。

d. 用钨丝和镊子去除眼睛和皮肤。

e. 用电线切断小脑、视顶盖和端脑。这在安装时将大脑的厚度减少了大约一半。

f. 将解剖的大脑放入带有 Western Block 的微量离心机中。

g. 在 RT 处阻塞 3 小时。

h. 删除西部街区。

i. 超声和涡旋一抗（至少两次）。

j. 添加一抗混合物（Western Block 中的一抗）。在 4 °C 下摇晃过夜。确保液体和鱼在微量离心管内移动。

2. （选项 B）- 整个幼虫染色

a. 删除西部街区。

b. 超声/混合一抗（至少两次）。

c. 加入一抗混合物（ 500 μL 至Western Block 中的1 mL一抗）。在 4 °C 下摇晃过夜。确保液体和鱼在微量离心管内移动（或者，您可以在室温下摇晃过夜）。

注意：上述协议给出了最好的结果。或者，可以截断步骤。与其封闭过夜，不如加入封闭剂一小时，然后将鱼转移到一抗上过夜。无需在 4 °C 下与一抗孵育过夜，这可以在 RT 下进行 5 小时至过夜。

C. 第三天——清洗并加入荧光二抗

1. 去除一抗。 [保存抗体，因为它们可以重复使用多次。多次使用（三到五次）染色会变得更好，因为抗体是预先吸收的。在多次使用中，染色会退化（十倍）。储存在 4 °C 。我们建议添加叠氮化钠，因为它是长期保存抗体的关键。 ]

2. 用 PBSTx 清洗至少 5 × 15 分钟，但最好是整个下午，用 1 mL 的 PBSTx 进行五次更换。

3. 删除 PBSTx。（或者，您可以在 RT 处阻挡/摇滚 1 小时，然后继续。）

4. 超声/混合二抗（至少两次）。

5. 添加二级抗体混合物（500 μL至 1 mL 的 Western Block 中的二级抗体）。

6. 在黑暗中在 4 °C 下摇晃过夜。确保液体和鱼在微量离心管内移动。

注意：二级抗体可添加 3 小时至过夜。请注意，所有缩短抗体孵育时间的步骤都会降低图像质量，而增加长度或温度的步骤往往会缩短抗体的寿命。

D. 第四天——洗

1. 去除二抗。 [除上述一抗外。]

2. 用 1 mL 的 PBSTx 清洗至少 4 × 15 分钟。

3. °C 下在黑暗中洗涤过夜。（或者，您可以跳过最后一次清洗并进入安装阶段。）

E. 第五天——成像支架

1. （选项 A）– 使用桥接安装

a. 取出 PBSTx 并替换为 1 mL 的新鲜 PBSTx。

b. 创建用于安装的“桥”幻灯片（图 1）。使用疯狂的胶水将一张盖玻片粘在幻灯片的两侧。这成为您的样品的桥梁，因此您不会压碎它。

图 1.将大脑安装在桥式滑梯上。

c. 将大脑移动到 Prolong Gold 防褪色中，并将大脑腹侧朝上。将盖玻片放在桥的顶部。确保有足够的 Prolong Gold 抗褪色剂覆盖样品并注意气泡。

d. 用指甲油密封边缘。

e. 图片。

2. （选项 B）——在盖玻片上使用真空油脂柱安装

a. 在 PBS 中通过 1 mL 的 25%、50% 和 75% 甘油脱水（不要使用 PBSTx，因为它会用甘油产生气泡）。（加入下一个更高浓度的甘油溶液后，等待胚胎“落”到试管底部，然后再进行下一个稀释。）

b. 如有必要，解剖动物。请参阅下面的替代解剖协议 (F)。

c. 安装大脑，使用最少量的真空油脂在盖玻片上形成柱子，使组织不变形（图 2）。

图 2.使用油脂柱安装大脑。

i. 将腹侧的大脑安装到盖玻片上。如果你小心的话，你可以安装多个大脑。

ii. 去除多余的甘油（如果存在）（使用 Kimwipe）。

iii. 使用真空油脂在盖玻片的每个角落制作柱子。

iv. 小心地将幻灯片放在准备好的盖玻片上。轻轻向下推载玻片，直到真空油脂压缩，大脑几乎不接触载玻片。大脑应该非常小心地夹在盖玻片和载玻片之间，只接触每一个。

v. 将载玻片/盖玻片翻过来。

vi. 将一小滴 Prolong Gold 抗褪色剂滴在盖玻片的边缘 - 它会“芯吸”到盖玻片中以包围大脑。涂抹前，轻轻挤压管子并检查以确保没有添加气泡。静置 3-4 小时或过夜。

d. 用指甲油密封边缘。

e. 图片。

F. TCA 固定和免疫染色后的额外斑马鱼脑/脊柱解剖方法

1. 将镊子插入脊索上方，靠近鱼侧躺的后端。分开的镊子，把鱼分成两半。

2. 使用这些分开的背侧和腹侧 (D/V) 幼虫两半，用镊子抓住每一半的末端，将鱼拉成两半——休息应该紧跟脊索的背侧。最好的成像发生在脊索与腹半部分一起时。

3. 轻轻拉动，但要坚持不懈——有时必须重新定位镊子。耳石通常对 D/V 分离具有挑战性——理想情况下，耳石将与腹侧分离。如果没有，请剖析它。理想情况下，大脑将在前面与眼睛分开。如果没有，请解剖它们。

4. 可以丢弃腹半部分（下巴、蛋黄等）。

5. 背半部包含大脑/脊柱，从腹侧可以清楚地看到大脑。安装此背半部分，其腹侧部分面向盖玻璃成像表面。

食谱

1. 三氯乙酸 (三氯乙酸)

制作 20% TCA 并冷冻成有用的等分试样以备将来使用。

对于 2% 的工作溶液，在 1 × PBS 中稀释 1:10。

2. 三卡因甲磺酸盐（MS-222 有时称为 MESAB）

4 g/L Tricaine-S 制成储备溶液，170 mg/L 制成工作溶液，~50 mg/L 用于镇静。

3. PBSTx

1 × PBS，0.5% Triton-X

4. 叠氮化钠西块

叠氮化钠可防止微生物生长。

将 1 mL的 20% 叠氮化钠添加到 100 mL的 Western Blocking Reagent 瓶中，用于 10 ×

在 -20 °C下冷冻成 1 mL等分试样。对于工作溶液，用 PBS-Tx补足 1 × 。

一抗和二抗在 Western Block 中稀释。

5. 甘油稀释

（25%、50% 和 75%）在 PBS 中

致谢

该协议用于配套论文 Lasseigne等人。 (2021)爱生活 （DOI：10.7554/eLife.66898）。

Eunice Kennedy Shriver 国家儿童健康与人类发展研究所 (F32HD102182) 致 E Anne Martin。

国家耳聋和其他交流障碍研究所 (R01DC011099) 给 Alberto Pereda。

国家神经疾病和中风研究所 (R21NS085772) 给 Alberto Pereda。

国家心理健康研究所 (RF1MH120016) 给 Alberto Pereda 和 Adam C Miller。

国家神经疾病和中风研究所 (R01NS105758) 给 Adam C Miller。

利益争夺

我们声明没有竞争利益。

伦理

使用该协议的研究严格按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的建议进行。所有动物均根据俄勒冈大学批准的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 协议 (#AUP-18-35) 进行处理。

参考

1. Lasseigne, AM, Echeverry, FA, Ijaz, S., Michel, JC, Martin, EA, Marsh, AJ, Trujillo, E., Marsden, KC, Pereda, AE 和 Miller, AC (2021)。电突触传递需要突触后支架蛋白。生命10 ： e66898 。