材料和试剂

A. 核酸提取

1. 斑马鱼胚胎

2. 圆底测定块（Axygen，目录号： P-DW-20-CS)

3. 粘合板密封件（Thermo Fisher Scientific，目录号： AB0558)

4. 5 mm不锈钢珠（Qiagen，目录号： 69989）

5. 可选：TissueLyser 单珠分配器，5 mm（Qiagen，目录号：69965）

6. 板密封辊（Bio-Rad Laboratories，目录号： MSR0001）

7. 粘性 PCR 板箔（Thermo Fisher Scientific，目录号： AB0626）或PlateLoc 热封（Agilent，目录号： 2 4210-001），如果使用热封机

8. 96孔V底0.3 mL板（Thermo Fisher Scientific，目录号： AB1400L）

9. 96孔超板（Thermo Fisher Scientific，目录号： AB-2800）

10. RnaseZap Rnase 去污溶液/湿巾（Thermo Fisher Scientific，目录号： AM9782/AM9786)

11. Agencourt RNAClean XP 珠子（Beckmann Coulter，目录号： A63987)

12. 可选： AMPure XP Beads（Beckman Coulter，目录号： A63881）是 RNA clean XP 珠子的更便宜的替代品，并且在我们手中同样有效。但是，它们不能保证不含 Rnase。

13. 鸡蛋水（韦斯特菲尔德，2007）

14. RLT 缓冲液（Qiagen，目录号： 79216）

15. 可选：RLT Plus 缓冲液（Qiagen，目录号： 1053393）。这可以用来代替 RLT 缓冲区。但是，它需要添加 Reagent Dx（如下）

16. 可选：试剂 Dx（Qiagen，目录号： 19088）。以 0.5% v/v 添加到 RLT Plus 缓冲液中。

17. β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号： M3148-100ML）

18. 乙醇（≥99.8% Sigma-Aldrich ，目录号： 51976-500ML-F）

19. 不含 RNA 酶的水（DEPC-Treatated Water；Invitrogen，目录号： AM9916）

B. 基因分型

1. 96孔KASP板（Thermo Scientific，目录号： AB-0800/K）

2. KASP-TF V4.0 2 ×主混音 (KBS-1050-102)

3. KASP 反应预混液（见配方）

C. DNase I 治疗

1. DNase I（New England Biolabs，目录号： M0303L）

2. 10 × DNase I缓冲液（Thermo Scientific，目录号： AM8170G）

3. 0.5 M EDTA（Sigma ，目录号： E7889）

D. RNA定量

1. Quant-iT ^TMRNA 检测试剂盒（Invitrogen，目录号： Q33140）

2. Bioanalyzer RNA 6000 Pico 试剂盒（Agilent，目录号： 5067-1513）

设备

A. 核酸提取

1. 多道移液器（例如，Rainin、Pipet-Lite XLS、L200）

2. 如果使用热封，封板机（Agilent Technologies，PlateLoc）

3. TissueLyser II（Qiagen，品牌，目录号： 85300）

4. TissueLyser 板适配器套件（Qiagen，目录号： 11990）

5. 磁铁（DynaMag ^TM-96 Side Skirted Magnet； Thermo Fisher Scientific ，目录号： 12027）

B. 基因分型

1. 荧光读板机

注意：对于基因分型，我们使用 BMG LABTECH PHERAstar，但任何支持 FRET 的读板器都可以使用。也可以使用 qPCR 机器。请参阅https://www.biosearchtech.com/support/education/kasp-genotyping-reagents/running-kasp-genotyping-reactions 。

2. 热循环仪

3. 中继移液器（例如., multipetteM4; Eppendorf，目录号： 4982000012）

4. 中继移液器吸头（例如，0.2 mL Combitips；Eppendorf，目录号：0030089413）

C. DNase I 治疗

1. 热循环仪

D. RNA定量

1. 荧光酶标仪

2. 生物分析仪（安捷伦）

软件

1. KlusterCaller（LGC， https: //www.biosearchtech.com/support/tools/genotyping-software/klustercaller ）

程序

A. 核酸提取

将单个胚胎收集到 96 孔块中。胚胎被裂解，总核酸与顺磁珠 (SPRI) 结合。洗涤后，使用水从珠子上洗脱核酸（图 1）。

图 1. 提取工作流程示意图。

提取过程不同部分的概述。每个部分的步骤显示在彩色箭头内。

注意：清洁的工作环境是必不可少的。使用干净的手套并用 RnaseZap 喷洒工作台、设备和手套，以避免 Rnase 污染。

1. 在 2 mL 圆底检测块的每个井中收集单个胚胎。使用截断的移液器吸头在 9 μL 的蛋水中收集胚胎。在干冰上预冷盘子，然后将移液器尖端降低到每个孔的底部，以立即冷冻胚胎。用包含收集的胚胎和实验名称的井号在正面和侧面标记板。使用粘合板密封件密封板。拉动侧面的密封件并固定板。请勿将它们拉过贴有标签的一面，因为撕下封条时墨水可能会脱落。立即放在干冰上约 5 分钟。从这一步开始，您可以立即进行提取，也可以将板储存在 -80°C 直至需要。

在提取当天

2. 取出 Agencourt RNAClean XP/ AMPure XP微珠，在 30 分钟内恢复至室温。摇匀以重悬珠子。

3. 准备 70% 乙醇新鲜。每孔需要约 700 μL。

在通风柜下

4. 准备裂解缓冲液如下：

每 1 mL RLT 缓冲液（根据需要，储存在 RT）+ 10 μL 14.3 M β-巯基乙醇。对于单胚胎提取，110 μL RLT 缓冲液/孔足以充分裂解组织。在 5 mL 管中进行预混，最多可容纳 24 个样品，或多通道分配盘。根据机构指南处理含有 β-巯基乙醇的固体和液体废物。

如果您使用 RLT plus 缓冲液，请添加 0.5% v/v 的试剂 Dx。 Buffer RLT plus 含有洗涤剂，搅拌时会起泡。 Reagent Dx 是一种消泡剂，可防止材料以泡沫形式流失。

5. 将胚胎板从 -80°C 中取出并放在干冰上。仍在干冰上时，使用多通道移液器将 110 μL 含有 β-巯基乙醇的 RLT 缓冲液添加到井中。

6. 用干净的手套手在含有胚胎的板的每个孔中添加一个 5 mm 不锈钢珠。

注意：用 RNaseZap 清洁手套，以避免 RNase 污染。使用TissueLyser 单珠分配器（参见材料和试剂）是一种替代方法。

7. 从干冰中取出盘子，等待解冻时间。用干净的纸巾擦干板的顶部，并使用粘性箔板密封件进行密封。不要将密封推入孔内，因为这会使珠子更有可能刺穿 TissueLyser 中的密封。

或者，如果使用热封机，则在 170°C 下使用热封将板密封 6 次，持续 3 秒。在密封之间等待几秒钟，并使用板密封辊固定两侧。额外的密封层确保在搅拌过程中珠子不会刺穿密封。

备注：

a. 在使用 TissueLyser 之前正确密封板是必要的，以避免钢珠刺穿密封并导致样品损失和交叉污染。如果使用热封机，我们使用 6 层密封。

b. 如果使用粘性箔密封，在密封前添加 RLT 缓冲液后，在室温下等待一段时间，让板有时间解冻。盘子的顶部应该用纸巾擦干，这样密封件就会粘在盘子上而不会脱落。不要将薄膜压入孔中。这将使珠子更有可能刺穿密封。 TissueLyser 适配器的一侧是完全平坦的，而另一侧则不是。确保适配器的平面位于板的顶部并且适配器紧固。我们建议在处理实际样品之前，在含水的板上测试板密封的完整性。

8. 根据制造商的说明将板适配器套件安装到 TissueLyser II 上。在适配器上安排 2 mL 检测块。确保适配器平衡，板在适配器之间正确对齐，并且适配器没有倾斜。在室温下以 12 Hz 频率运行协议 5 分钟。

9. 当 Tissue Lyser 程序结束时，短暂旋转样品板以在板底部收集裂解物。如果裂解物看起来不均匀，以 12 Hz 的频率以 2 分钟的增量重新运行程序，直到裂解物看起来均匀。

注意：以下步骤需要在通风柜下进行。

10. 在样品裂解时，将 1.8 ×体积 (180 μL) AgenCourt RNAClean XP 微珠添加到干净的 V 底 0.3 mL 板的相应孔中。 180 µL 的体积是基于下一步使用 100 µL 的裂解液。

注意：如果使用AMPure XP微珠，则 1.8 ×的比例相同。

11. 将 100 μL 裂解液添加到步骤 10 中准备的板中。在多通道移液器上将体积设置为 150 μL；上下吸管以彻底混合裂解物和珠子。避免引入气泡。

12. 在室温下在通风橱中孵育 15 分钟。

13. 将装有样品的板放在板磁铁上，放置 10 分钟，或直到溶液变清。

14. 使用多通道移液器去除上清液（不干扰珠子）。

15. 仍在磁铁上时，加入 200 μL 的 70% 乙醇（由标准库存乙醇制成）以覆盖珠子而不会干扰并离开 30 秒。不要重悬珠子。

16. 小心地去除乙醇，不要将珠子干扰到乙醇废物中，并重复洗涤总共 3 次。

17. 在最后一次洗涤中，使用多通道移液器彻底去除任何残留的乙醇，而不会干扰珠子。

注意：您现在可以离开通风柜了。

18. 在室温下将样品风干 10-15 分钟，或直到没有剩余的液体痕迹并且珠子看起来干燥。不要过度干燥，否则重新悬浮珠子会变得困难。

19. 添加 58 μL 的无 RNase 水并使用移液器重新悬浮珠子。不要涡流。使用相同的尖端，通过将水移到珠子上轻轻地将珠子冲洗到试管中，直到所有珠子都处于悬浮状态。

注意：如果需要更浓缩的样品，可以使用更少量的水。使用至少 35 μL 的水以确保最佳回收率。

20. 在室温下在长凳上孵育 5 分钟。

21. 放在磁铁上，静置 5 分钟或直到溶液变清。

22. 小心地将上清液转移到新的清晰标记的 96 孔超板中，注意不要吸收任何珠子。上清液含有 RNA 和基因组 DNA。继续冰上。

注意：将提取物放在冰上，直到完成基因分型（如果在同一天完成），否则保持在-80°C 。反复冻融循环会导致样品降解。

B. 基因分型

使用来自上述步骤 22 的总核酸样品中存在的基因组 DNA，通过 KASP 基因分型对每个胚胎进行基因分型。有关 KASP 基因分型的更多信息，请参阅https://biosearch-cdn.azureedge.net/assetsv6/KASP-brochure.pdf 。

1. 在带有中继器移液器的 96 孔 KASP 板中，每孔添加 8 μL 的 KASP 反应主混合物。

2. 每口井加入 1 μL 提取样品作为模板。

3. 使用表 1 中的程序在热循环仪上运行。

4. 使用具有 FRET 功能的读板器或 qPCR 机器读取荧光。

注意：对于基因分型，我们使用 BMG LABTECH PHERAstar，但任何支持 FRET 的读板器都可以使用。也可以使用 qPCR 机器。见https://www.biosearchtech.com/support/education/kasp-genotyping-reagents/running-kasp-genotyping-reactions 。

表格1. KASP 反应循环参数。

C. DNase I 治疗

通过对总核酸样品减去用于基因分型的任何量的 DNase I 处理去除基因组 DNA。

注意：在此步骤之后，样本不能再用于基因分型。

1. 设置反应如下：

总核酸

DNase I 1 μL

10 × DNase I 缓冲液 10 μL

用无 RNase 水将总体积补至 100 μL。

2. 密封板并在 37 °C 下加热10 分钟。

3. 在每口井中加入 1 μL 的 0.5M EDTA。

注意：DNase I 在步骤 4 中通过在 75 ° C 下孵育而失活。但是，DNase I 缓冲液中含有 Mg ²⁺，在高温下会导致二价阳离子诱导的 RNA 断裂。因此，添加 EDTA 以螯合 Mg ²⁺并防止这种情况发生。

4. 密封板并在 75°C 下孵育 10 分钟以灭活 DNase I。

5. 将样品转移到 V 底 0.3 mL 板上。摇晃 RNAClean XP 瓶以重新悬浮任何可能沉淀的珠子。在每个孔中加入 200 μL 的 Agencourt RNA XP 珠子，并通过移液器充分混合。注意不要引入气泡。

6. 在室温下孵育 15 分钟。

7. 将装有样品的板放在板磁铁上，放置 10 分钟或直到溶液变清。

8. 使用多通道移液器去除上清液（不干扰珠子）。

9. 仍在磁铁上时，加入 200 μL 的 70% 乙醇以覆盖珠子，而不会干扰并离开 30 秒。不要重悬珠子。

10. 小心去除乙醇，不要干扰珠子，重复洗涤总共 3 次。

11. 在最后一次洗涤中，使用多通道移液器彻底去除任何残留的乙醇，而不会干扰珠子。

12. 在室温下将样品风干 10-15 分钟，或直到没有剩余的液体痕迹并且珠子看起来干燥。不要过度干燥，否则重新悬浮珠子会变得困难。

13. 添加 52 μL 的无 RNase 水并使用移液器重新悬浮珠子。不要涡流。使用相同的尖端，通过将水移到珠子上轻轻地将珠子冲洗到试管中，直到所有珠子都处于悬浮状态。

注意：此洗脱体积适用于 TruSeq Stranded Illumina 试剂盒。请调整洗脱体积以匹配您将使用的协议的第一步。

14. 在室温下在长凳上孵育 5 分钟。

15. 放在磁铁上，静置 5 分钟，或直到溶液变清。

16. 小心地将 50 μL 上清液转移到新的清晰标记的 96 孔超板中，注意不要吸收任何珠子。

D. RNA定量和QC

1. 根据制造商的说明，使用 Quant-iT ^{TM RNA 检测试剂盒测量 RNA 浓度。}

2. Bioanalyzer RNA 6000 Pico 或等效方法评估 RNA 的质量。大多数 RNA-seq 试剂盒建议的最小 RNA 完整性数 (RIN) 为 8 或更高。对于 qRT-PCR 分析，可以跳过此步骤。

3. 计算实验所需的 RNA 量。在单独的 96 孔板中，转移适当体积的 RNA。对所有样品使用相同的浓度。

4. 按照制造商的协议（例如 Illumina TruSeq Stranded mRNA）继续进行 RNA 测序文库制备。

5. 该协议产生的 RNA 也适用于 qRT-PCR。如需更多信息，请咨询 Bio-Rad 和 Applied Biosystems 等制造商。

数据分析

如需分析基因分型图，请参阅https://biosearch-cdn.azureedge.net/assetsv6/Analysis-of-KASP-genotyping-data-using-cluster-plots.pdf 。

食谱

1. KASP 反应预混液（足够 96 次反应）

KASP-TF V4.0 2 × Master Mix 400 μL

氯化镁₂6.4 μL

水 400 μL

化验混合物 11 μL

致谢

这项工作得到了 Wellcome [098051 和 206194] 为 Wellcome Sanger 研究所提供的核心资金的支持。该协议以前在White等人中使用过。（2017 年；Doi：10.7554/eLife.30860）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

1. de Jong, M.、Rauwerda, H.、Bruning, O.、Verkooijen, J.、Spainak, HP 和 Breit, TM (2010)。斑马鱼单胚胎转录组分析的 RNA 分离方法。 BMC 水库注释3：73。

2. Dooley，CM，Wali，N.，Sealy，IM，White，RJ，Stemple，DL，Collins，JE 和 Busch-Nentwich，EM（2019 年）。神经嵴诱导过程中遗传补偿的基因调控基础。公共科学图书馆基因15(6)：e1008213 。

3. Dupret, B.、Volkel, P.、Follet, P.、Le Bourhis, X. 和 Angrand, PO（2018 年）。结合对单突变斑马鱼幼虫的基因型和表型分析。 方法 X 5：244-256。

4. 韦斯特菲尔德，M. (2007)。斑马鱼书。斑马鱼（斑马鱼）实验室使用指南。第 5 版。俄勒冈大学出版社，尤金。

5. White，RJ，Collins，JE，Sealy，IM，Wali，N.，Dooley，CM，Digby，Z.，Stemple，DL，Murphy，DN，Billis，K.，Hourlier，T.，等。（2017）。斑马鱼胚胎发育的高分辨率 mRNA 表达时间过程。生命6： e30860 。