材料和试剂

1. 1.5 mL微管（ Axygen ，目录号：MCT150LC）

2. 500mL e rlenmeyer烧瓶（ Shuniu ，目录号：GG17）

3. 0.45 μm灭菌过滤器（Millipore，目录号：SLHV033）

4. 透析袋（ Solarbio ，8000-14000，目录号：YA1072）

5. Caulerpa lentillifera ( Nha 董里,越南, Vmax )

6. 大肠杆菌BL21(DE3) 细胞（巴生，目录号：KL9050510）

7. 质粒：pET-22 b ( + ) ，抗苄基，苏州金维智生物科技公司提供，本实验室保藏。

8. 酵母提取物（ Oxoid ，目录号：LP0021）

9. 胰蛋白胨（ Oxoid ，目录号：LP0042）

10. 氨苄青霉素（ Amresco ，目录号：LP0339）

11. 异丙基-β- D-硫代半乳糖苷：IPTG （ Solarbio ，目录号：I8070）

12. NaCl（西龙科学，目录号：7647145）

13. 页面标尺预染蛋白梯（ Therom ，目录号：142546）

14. 四甲氧基硅烷：TMOS （Macklin，目录号：T819504）

15. SiO ₂标准溶液（Macklin，目录号：I821744）

16. NaOH （ Xilong Scientific，目录号：100154）

17. 硫酸溶液（ Xilong Scientific，目录号：7664939 ）

18. 氯化钠₄ （西龙科学，目录号：7791073）

19. 无水乙醇（ Xilong Scientific，目录号：64175 ）

20. A乙酸（ Xilong Scientific，目录号：64197）

21. 二氯乙醇（默克，目录号：107073）

22. BCA蛋白检测试剂盒（延禧，目录号： PDBCA500)

23. SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（ Beyotime，目录号： P0012A)

24. 镍亲和柱（Smart-Lifesciences，目录号： SA003025)

25. 弹性蛋白样多肽（ELPs， K5V4F是指K: V:F =5:4:1的比例）

26. 磷酸盐缓冲溶液（PBS，100 mmol/L，pH 7.0）（见食谱）

27. 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液（CPB，20 mmol/L，pH 6.6）（见食谱）

28. 结核培养基（见食谱）

设备

1. Eppendorf 混合器（Eppendorf，目录号：5382000074）

2. -80°C冰箱（ Therom ，目录号：905）

3. 烧杯（蜀牛，目录号：056245 ）

4. 凝胶成像分析系统（ Tanon ，目录号：地理信息系统-2008)

5. 超声波细胞破碎系统（ Scientz ，目录号： TY92-II)

6. 温控紫外分光光度计（ Analyticjena ，目录号： SPECORD40)

7. 高速冷冻离心机（Eppendorf，目录号： 5418RL)

8. 恒温摇床（ HerryTech ，目录号：GG-100C）

9. 体重秤（Sartorius，目录号：BSA2202S）

10. 移液器（Eppendorf Research plus）

11. 扫描电子显微镜（Hitachi，目录号：S-4800）

12. 透射电子显微镜（日立，目录号： H7650 )

13. 磨床（雷麦，目录号：FS-100 ）

14. 网片（舒印，目录号：JD -12）

15. 干燥机（ Jinchen ，目录号：JC-9023AE）

16. 烧瓶（ Shuniu ，目录号：GG-17）

17. 分光光度计（ Mapada ，目录号：GDJ355）

软件

1. NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov )

2. ImageJ （美国国立卫生研究院； https: //imagej.nih.gov/ij/download.html ）

3. ProtParam ( http://web.expasy.org/protparam/ )

程序

A. 从Caulerpa lentillifera中提取 β-1,3-Xylan

1. 将新鲜的黄花菜洗3遍，将干净的花菜花在烘干机中烘干 24 小时。然后，通过 200 目筛子将Caulerpa lentillifera研磨成粉末。

2. 将 20 g Caulerpa lentillifera粉末加入 1 L NaOH 溶液( 300 mmol/L ) , 将混合物加热至 100 °C 30 分钟，然后将混合物在室温下以 5,500 × g离心 20 分钟。最后弃上清，室温下用 1 L ddH ₂O洗涤沉淀两次（ Iriki 等。 , 1960)。

3. 将沉淀物移至装有硫酸溶液 (250 mmol/L, 1 L) 的烧杯中，然后重复上一步。

4. 将沉淀重悬于 2 L NaClO ₄溶液（1%）中，在 25°C 下以 150 rpm 的速度搅拌混合物 2 小时，然后用 ddH ₂O 洗涤沉淀两次。

5. 在 800 m L NaOH 溶液 (2.5 mol/L) 中制备沉淀，在冰浴中以 100 rpm 的速度搅拌 2 h，弃去沉淀，在上清液中加入 3.2 L 无水乙醇，在 4°C 下放置 12 h .

6. 在 4°C 下以13,500 × g离心 20 分钟以收集沉淀物。用洗涤沉淀物分别加入 100 mL 无水乙酸 (5.7 mol/L) 和 200 mL ddH 2 _O，然后将沉淀物在 4°C 下冷冻干燥 36 h。

B. 乙二醇β-1,3-木聚糖的制备

1. 混合β-1,3木聚糖（3 g ）、NaOH 溶液（14%，150 mL）和 18 mL二氯乙醇，在冰浴中以 100 rpm 的速度搅拌 1 小时。然后，将混合物在室温下保持 24 小时。

2. 24 h后，用乙酸用pH试纸将混合物中和至pH7，然后放入透析袋中，通过ddH ₂O透析除去杂质。

3. 透析后，将糖溶液在 80°C 加热浓缩至 10 mL，然后将糖溶液在 4°C 冷冻干燥 72 h (Cai et al ., 2020)。

C. 蛋白质表达和纯化

1. 大肠杆菌BL21(DE3) 细胞中表达 Xyl3088（GenBank 登录号 MK253053）、K5-C（编号 MN136291）和 Xyl3088-Tag（XT，编号 MN136290）。

2. 2 mL Xyl3088 （或K5- C或 XT ）和0.2 mL氨苄青霉素（100 mg/ mL ）接种到 500 mL锥形瓶中的200 mL TB 培养基中，并在 37°C 下孵育 4 h 以 200 rpm 的速度搅拌。

3. 加入 1 mL异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG，0.5 mmol /L ），在 25°C 下以 180 rpm 孵育 16 小时。

4. 以 5,500 × g收集细胞20 分钟，并在冰上通过超声（功率：300 W；超声波循环：150 次；脉冲：4 秒；停止：2 秒）破坏细胞。

5. 以 13,500 × g离心20 分钟，以去除不溶性细胞碎片；上清液（细胞质部分）是粗酶提取物。

6. 蛋白质纯化

a. 用镍亲和柱纯化 Xyl3088 和 XT 的重组蛋白。

i. 通过 0.45 μm灭菌过滤器过滤 Xyl3088 和 XT 的细胞裂解物。

ii. 用 15 mL 的平衡溶液（50 mmol/L Tris-Cl、500 mmol/L NaCl、pH 7.4）平衡镍亲和柱。

iii. 将洗涤缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl、40 mmol/L 咪唑、500 mmol/L NaCl、pH 7.4）加入柱中以洗涤粗蛋白。

iv. 的 Xyl3088 和 XT蛋白。

v. 用 50 mmol/L Tris-Cl 广泛透析纯化的 Xyl3088 和 XT 蛋白，然后在 4°C 下储存。

b. 通过逆转换循环 (ITC) 的方法纯化含有可溶性粗蛋白 (K5-C) 的上清液。

i. mL的 K5-C 溶液中制备 29.25 g NaCl，并在 37°C 下孵育混合物 15 分钟。

ii. 在 37°C 下以13,500 × g离心 20 分钟以收集聚集的 K5-C。

iii. 将 10 m L的冰冷磷酸盐缓冲溶液 (7.0) 添加到管中，以重新溶解聚集的 K5-C。

iv. 在 4°C 下以13,500 × g离心 20 分钟以收集上清液。

v. 重复 ITC 过程两次，以实现融合 K5-C 蛋白的高纯度（Lim等人， 2007 ）。

c. 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，12%）分析重组蛋白的纯度。

d. 通过 ImageJ 计算 Xyl3088、XT 和 K5-C 的纯度。

e. 对于 Xyl3088 的纯度，SDS-PAGE 得到一个清晰的 49 kDa粗条带（图 2），这与ProtParam计算的 48853 Da 的理论分子量值一致（ http://web.expasy.org/protparam/ ）。

图 2. 纯化重组 Xyl3088的SDS-PAGE。

D. 二氧化硅纳米粒子的制备

1. 在 7 m L H Cl (1 mmol/L)中制备 1.522 g原硅酸四甲酯 (TMOS)，将体积设置为 10 m L，并将新鲜的 TMOS 在室温下保持 10 分钟 (Cai et al. , 2021) 。

2. 将新鲜 TMOS 与 K5-C (300 μmol /L) 以 1:9 ( v:v ) 的比例混合，并保持反应温度为 4°C 10 分钟。

3. 在 4°C 下以5,500 × g离心 3 分钟以收集二氧化硅沉淀。

4. 1.5 mL 的预冷 PBS 缓冲液清洗二氧化硅沉淀 3 次，以收集新形成的含有 K5-C 蛋白（K5-C@silica）的二氧化硅纳米粒子（NP）。

E. K5-C泄漏测试

1. 在 3 mL 的 CPB 缓冲液（20 mmol/L，pH 6.6）中重新悬浮二氧化硅 NP。存储 4℃悬浮。

2. 在 4°C 下以13,500 × g离心 5 分钟以收集二氧化硅 NPs 和 上清液，请尊重。

3. 测量用分光光度计在 280 nm 处分析K5-C 蛋白。

4. 将上清液添加回试管中重悬 K5-C@silica 进行进一步测试。

F. K5-C@silica 的表征

分散合成的K5-C@silica 在1 mL的 ddH ₂O 中并风干过夜。使用扫描电子显微镜分析 K5-C@silica 的二氧化硅形态和尺寸 (SEM) 和透射电子显微镜 (TEM)。用能量色散法计算K5-C@silica的元素组成 X 射线光谱仪 (EDS)。 K5-C形成的白色沉淀的SEM照片显示它们是球形的，粗糙的，它们的直径范围为200到600 nm（图ure 3 ）。

图 3. K5-C@silica 的 SEM 显微照片。比例尺为 1 μm 。

G. 酶自固定

1. 由于SpyCatcher和SpyTag可以在体外自发形成异肽键，我们将 XT 粗酶 (300 m L ) 与 K5-C@silica (60 mg) 混合，然后在 30°C 下孵育管 1 h 以配制XTC-K5 固定化酶（固定化Xyl3088 ）。

2. 5,500 × g离心3 分钟以收集固定的 Xyl3088。

3. 1.5 mL CPB 缓冲液（20 mmol/L，pH 6.6）洗涤固定化 Xyl3088 3 次，并将固定化酶保持在 4°C 以备后用。

H. 酶活性测定

1. 测定酶的活性游离和固定的 Xyl3088，使用β-1,3-xylan作为基质。

2. 通过使用改良的 3,5-二硝基水杨酸 (DNS) 测定法估计游离和固定化 Xyl3088 的酶活性。

3. 将 50 μL稀释酶和 350 μL β-1,3-xylan (1%) 一起制备，并在 45° C ( pH6.6 ) 下孵育混合物10 分钟。

4. 10 min 后，加入 400 μL DNS 试剂终止反应，迅速将管子转移至 100°C 浴 5 min 。

5. μmol还原糖的酶量。

6. 评估最佳温度和pH值。

a. 对游离和固定化 Xyl3088的 β-1,3-木聚糖水解活性的影响酶活性在 25-75°C 的温度范围内。将最高活动定义为 100%，并将其他人计算为相对百分比。

b. 同时，确定 pH 值对 β-1,3-xylan 的影响通过在 4.0-9.0 的 pH 范围内评估酶活性，测定游离和固定化 Xyl3088 的水解活性。

7. 计算固定化酶的固定化效率、固定化产率和活性恢复如下（Sheldon , 2014; Boudrant 等人。 , 2019)。

最后，Xyl3088的固定化率高达96%。固定化 Xyl3088 的活性恢复率为 88.6%，固定化效率为 85.6%。

I. 酶热稳定性和可重复使用性

1. 酶的可重复使用性

a. 简而言之，将固定化Xyl3088的第一轮比活性定义为 100% （Schoene等人， 2014 ）。

b. 在 4°C 下以 13,500 × g离心 1 分钟，以收集二氧化硅纳米颗粒和上清液。

c. 测定上清液对乙二醇β-1,3-木聚糖水解能力的活性，并计算固定化 Xyl3088 在该循环中的可重用性。

d. 用 CPB 缓冲液 (20 mmol/L, pH 6.6) 清洗二氧化硅 NP, 以去除还原糖。

e. 将新的底物溶液加入到含有固定化 Xyl3088 的反应体系中，开始新的酶促反应循环。

2. 热稳定性

a. 在给定温度 (40°C, 45°C、50°C）。

b. 计算每个的剩余活动以 45°C 下的活动为温度 100%。

J. 动力学研究

1. 估计游离或固定化 Xyl3088 的动力学参数，β-1,3-xylan 浓度范围从 1 到 10 mg / ml 。

2. 用分光光度计监测 540 nm 处的还原糖浓度。

3. - Menten 模型计算自由或固定化 Xyl3088 的最大速率 (Vmax) 和 Michaelis 常数 (Km) 。

食谱

1. 磷酸盐缓冲溶液（PBS，100 mmol/L，pH 7.0）

A溶液：200 mmol/L Na ₂HPO ₄

B溶液：200 mmol/L NaH ₂PO ₄

溶液和 B溶液调节 pH 至 7.0 。

2. 柠檬酸盐磷酸盐缓冲液（CPB，20 mmol/L，pH 6.6）

A溶液：20 mmol/L Na ₂HPO ₄

B溶液：10 mmol/L 柠檬酸

溶液和 B溶液调节 pH 至 6.6 。

3. 结核培养基

酵母抽提物 4.8 克

胰蛋白胨 2.4 克

甘油 0.9 m L

ddH ₂O 180 m L

致谢

我们感谢李夏兰博士和陈明霞博士对手稿的实验支持和有益的评论。本议定书得到福建省中青年教师教育委员会基金会的支持 (JAT200496)和中国福建省自然科学基金( 2021J011110 )。

从细胞裂解物中直接固定靶酶的技术如Cai等人所述。（2021 年）。 “一种新颖的一体化策略，用于直接从细胞裂解物中纯化和固定化 β-1,3-木聚糖酶，作为活性和可回收的纳米生物催化剂” 。微生物细胞事实 20（1）：37。

利益争夺

不存在利益冲突或竞争利益。

参考

1. Boudrant ，J .，伍德利， J . M. ，费尔南德斯-拉富恩特， R . （2019）。定义固定化酶制剂所需的参数。 过程生物化学90：66-80。

2. 蔡L. X., Chu, YM, Liu, X., Qiu , Y., Zhang, GY (2021)。一种新颖的多合一策略，用于直接从细胞裂解物中纯化和固定化 β-1,3-木聚糖酶，作为活性和可回收的纳米生物催化剂。 微生物细胞事实20（1）：37。

3. 蔡， L. X。，刘， X。，邱, Y., 刘， M。问，张， G。 Y。（2020 年）。藻类 1,3-木聚糖的酶促降解：从裂解多糖单加氧酶与 β-1,3-木聚糖酶的协同作用到它们在仿生二氧化硅纳米粒子上的智能固定。应用微生物Biot 104(12)： 5347 -53 60。

4. 入木 Y., 铃木， T., 西泽, K., 三轮， T. （ 1960 年）。虹吸绿藻的木聚糖。自然187： 82 -8 3。

5. 林， D. W., 特拉比克-卡尔森， K., 麦凯， J。一个。，奇尔科蒂_ 一个。（2007 年）。改进通过阳离子弹性蛋白样多肽对重组蛋白进行非色谱纯化。生物大分子8： 1417 - 1424。

6. 林, Y. Q. , 邱，Y .，蔡，LX，张，和GY（2020）。使用酸性靶酶研究 ELP 介导的基于硅化的蛋白质自固定化。工业工程化学研究59（44）：19829-19837。

7. 舍恩， C。，更火热， J., 贝内特，数字信号处理器，豪沃斯， P。 M。（2014）。 SpyTag/SpyCatcher 环化赋予中温酶对沸腾的弹性。蛋白质工程53： 6215 - 6218。

8. 谢尔顿， R。一个。（2014 年）。从生物质中绿色和可持续地制造化学品：最先进的技术。 化学信息 2014, 45(19):950 - 963。