材料和试剂

A. 酵母菌株

该程序成功使用的野生型菌株包括 BY4741（EUROSCARF； MAT a his3D1 leu2D0 met15D0 ura3D0 ），尽管任何S. cerevisiae实验室菌株都应该足够，只要它在HIS3和URA3基因中发生突变。酵母可以在 4 °C的盘子上储存长达 2 周，或在 -80 °C冷冻时无限期储存。

B. 试剂和一次性用品

1. 17 号针或 23 号针（任何供应商）

2. 1.7 mL 塑料管（高压灭菌）（任何供应商）

3. 无菌 15-mL 聚丙烯离心管（任何供应商）

4. 无菌无核酸酶屏障吸头（10 µL、200 µL、1,000 µL）（任何供应商）

5. 无菌 50 mL 聚丙烯离心管（Greiner，目录号：227270）

6. 玻璃珠，直径 0.5 mm（Biospec 产品，目录号：11079-105）

7. 超纯水（Biological Industries，目录号：01-866-1B）

8. 无菌双蒸水 (DDW)

9. 乙酸锂二水合物（LiOAc）（Sigma，目录号：L6883）

10. 鲑鱼精子DNA（ssDNA）（Sigma，目录号：D1626）

11. 超纯水（分子生物学级水，无核酸酶）（Sigma，目录号： W4502）

12. 无水乙醇（Bio Lab，目录号：05250521）

13. 甲醛37％（Sigma，目录号：F8775-25ML）

14. 甘氨酸游离碱（Sigma，目录号：G7126）

15. 液氮

16. 重组Rnasin核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号：20006332）

17. cOmplete ^TM，Mini，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物× 25（Roche，目录号：11836170001）

18. BCA 蛋白质测定试剂盒（Pierce，目录号：23225）

19. 链霉亲和素缀合的 Sepharose ^TM珠（GE Healthcare，目录号：17-5113-01）

20. 酵母tRNA（Sigma，目录号：R8508）

21. 抗生物素蛋白溶液（Sigma，目录号：A9275）

22. 牛血清白蛋白（BSA），冻干粉， ≥96 ％（Sigma，目录号：A7906）

23. 生物素（Sigma，目录号：B4501）

24. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：D8418）

25. MPC 蛋白沉淀试剂（MasterPure ^TMYeast RNA 纯化试剂盒的一个组成部分；Epicenter Biotechnologies，目录号：MPY03100）

26. 糖原20 mg / mL溶液（Fermentas，目录号：R0561）

27. 3 M乙酸钠（NaOAc）溶液，pH 5.2（Fermentas，目录号：R1181）

28. qScript Flex cDNA 试剂盒（Quantabio，目录号：95049-100-2）

29. DNaseI（Quantabio，目录号：95150-100）

30. N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TE MED）（Sigma，目录号：T9281-25ML）

31. 30％丙烯酰胺/ Bis 29：1（Bio-Rad，目录号：161-0156）

32. Silver Stain Kit（Pierce，目录号：24612）

33. TE 缓冲液（见配方）

34. 1 M LiOAc（见配方）

35. 0.1 M LiOAc（见配方）

36. PEG溶液（见配方）

37. ssDNA（见食谱）

38. 选择性培养基（见配方）

39. 甘氨酸溶液（见配方）

40. 酵母裂解缓冲液（见配方）

41. 完整的酵母裂解缓冲液（参见食谱）

42. 酵母 tRNA（见食谱）

43. 抗生物素蛋白溶液（见配方）

44. 酵母 tRNA（见食谱）

45. BSA 溶液（见配方）

46. 洗涤缓冲液（见配方）

47. 生物素溶液（见食谱）

48. 2×交联反向缓冲液（见配方）

49. 5×蛋白质样品缓冲液（见配方）

C. 质粒

1. pUG34-MS2-CP-GFP-SBP（又名 pMCP-GFP-SBP）（ Slobodin和 Gerst，2010）

2. pMS2-SL 质粒（Haim-Vilmovsky 和 Gerst，2009）

设备

1. 1升烧瓶

2. 3升锥形瓶

3. -80°C 冰箱

4. 用于从凝胶中切除蛋白质条带的无菌手术刀片（Jai Surgical Blades，目录号：400-11）

5. 轨道摇床培养箱 (MRC, TOU-120)

6. 移液器辅助装置（推荐：S1 移液器填充器，Thermo Fisher Scientific，目录号：9501）

7. （可选）真空阱

8. 化学（通风）罩

9. Ultrospec 10 细胞密度计（Biochrom，目录号： 634-0882）

10. 旋转器/混合器 Intelli-Mixer（Thomas Scientific，目录号：RM-2M）

11. 台式冷冻离心机（Eppendorf，目录号：5810 R）

12. 台式冷冻微量离心机（Eppendorf，目录号：5417 R）

13. 适用于大容量的离心机（冷藏）（Sorvall、RC5C plus 带 SLA3000 转子）或同等离心机

14. 用于 Sorvall 离心机的瓶子，500 mL（例如，Thermo，Nalgene，目录号 10430613）

15. Digital Disruptor Genie（Scientific Industries，目录号：SI-DD38 120V）。这应该在实验前在冷室中进行预冷。

16. 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 实验的标准设备

17. 可容纳丙烯酰胺凝胶的无菌盒

软件

1. 蛋白质组发现者（1.4 版）

程序

A. MS2 标记和培养酵母细胞培养物

MS2 适体是源自 MS2 噬菌体的短 RNA 茎环 (SL) 结构。 MS2 标记，即. ，插入 12-24 个重复的 MS2-SL，允许使用与荧光蛋白（如 GFP）融合的 MCP 对内源性标记的 mRNA 进行可视化和下拉（图 2）。 SBP 部分的添加允许使用固定的链霉亲和素下拉 MCP-GFP。然而，为了在下拉实验中识别非特异性信号，需要几个对照，例如未标记的细胞和用对照 mRNA 标记的细胞。

1. 使用基于 PCR 的基因组标记策略和如前所述的同源重组（Haim等人，2007 年；Haim-Vilmovsky和格斯特，2009）。另见注 1。

2. 使用标准酵母 LiOAc 转化(Gietz和Schiestl, 2007) 将带有 MS2 适体标记的基因的菌株转化为表达 MCP-GFP-SBP 的质粒，并在 SC-His 合成培养基琼脂糖板上进行平板。

3. HIS3选择标记的 MS2-CP-GFP-SBP 转化的单个菌落，将其接种到具有 7-8 mL 选择性培养基 (SC-His) 的 50 mL 试管中，并在摇动中生长30°C 培养箱 6-10 小时。

4. 稀释至 500 mL培养过夜培养。对于处于对数中期的细胞，第二天早上最终的 OD ₆₀₀应该在 0.4-0.8 之间。如果需要其他细胞状态，则可以使用不同 OD _{600值的培养物，但可能需要根据获得的细胞数量来修改进一步的步骤。}要计算要采取的起始培养体积，请按照下列步骤操作：

a. 测量培养物的细胞数或 OD ₆₀₀并使用以下公式确定倍增时间。对于本实验中使用的野生型菌株（BY4741），倍增时间为2小时。

[log ₁₀(N _t/N ₀)]/log ₁₀(2) = g

g - 代数

N _{0 –}开始时的细胞数或 OD ₆₀₀

N _{t –}最后的细胞数或 OD ₆₀₀

t = 培养时间

d——倍增时间（d=t/g）

b. 使用以下公式确定添加到更大的过夜培养物中的起始培养物的量：

N ₀– OD ₆₀₀开始

N _t– OD ₆₀₀最后你想要的

g – 文化在收获前将经历的世代数

N ₀= N_吨/2^克

g = 吨/天

5. 过夜生长后，测量培养物的吸光度，如果需要，继续培养培养物，至少达到 OD ₆₀₀= 0.4。 1,100 ×离心收集细胞 g在 4 °C 下5 分钟，在 Sorvall 离心机中使用 SLA3000 型转子，弃去生长培养基。

6. 在 200 mL 不含蛋氨酸的新鲜生长培养基中轻轻吹打（不要涡旋）重悬细胞 pell et，转移到 1 L 烧瓶中，并在 30°C 下摇动孵育 45 分钟以诱导 MS2-CP- 的表达GFP-收缩压。另见注 2。

7. 直接加入 270 μL 甲醛至终浓度为 0.05%，用甲醛固定细胞，并在室温 (RT) 下缓慢摇动孵育 10 分钟。

8. 溶液添加到最终浓度为 0.125 M 并再孵育 2 分钟来终止交联反应。

9. 离心细胞，根据您研究所的化学废物程序丢弃上清液，然后使用移液器（不要涡旋）在 50 mL 管中的 10 mL PBS 中重悬细胞。

10. ×离心细胞 g在 4°C 下 5 分钟。

11. 完全丢弃 PBS，并在纸巾上将管倒置 1-2 分钟，以去除残留的 PBS。

12. 使用液氮快速冷冻细胞沉淀。储存时，将细胞转移到 -80°C 冰箱中。在这些条件下，细胞可以长期储存。

B. 酵母细胞裂解

：下面提到的所有步骤都应在冰上进行。

1. 将冷冻细胞颗粒置于冰上，加入 4 mL 的完全酵母裂解缓冲液解冻。

2. 细胞解冻后，将 0.7 mL 转移到 1.5 mL 微量离心管中，其中预填充 0.5 mL 的酸预洗和烤箱烘烤的玻璃珠。

3. 使用破坏器在 4°C 下以最大速度涡旋细胞 20 分钟。关闭摇床，静置 5 分钟以防止过热，然后再打开 20 分钟。

4. ×预冷至 4°C 的台式离心机中离心微量离心管 g 2 分钟。将上清液转移到新鲜的微量离心管中，再次以 15,000 ×离心 g 10 分钟。

5. 即每个单独的培养物）的上清液收集到一次性 15 mL 试管中。离心后获得约 4 mL 的上清液。根据制造商的说明，用检测试剂盒中的 BCA 蛋白测量蛋白质浓度。

6. 转移 RaPID-seq/MS 所需的蛋白质提取物总量（通常每次下拉 80-100 mg 用于 RaPID-seq 或 RaPID-MS 实验，而 5-10 mg 用于 qRT-PCR 或Western 分析）到新的 15 mL 管中，加入抗生物素蛋白溶液（每 1 mg 蛋白质提取物加入 10 μg 抗生物素蛋白），并在 4°C 下孵育 1 小时，同时不断旋转/摇动。完成此步骤是为了阻止任何生物素化蛋白质与链霉亲和素珠结合。关于蛋白质测量和每种实验所需的量，请参见注释 3 和4 。

7. 将分离 RNA 和蛋白质所需的量分离到不同的管中。此外，将两个试管放在一边，每个试管都含有初始总提取量的 1%。一根管子用于“输入 RNA”（进行第 14 步进行 RNA 分离），并且可用于在进行 qRT-PCR 或 Nanostring 实验时对基因表达进行标准化（见注 5）。另一个试管将用于“输入蛋白”（进行第 15 步）。这些样品保存在冰上并与洗脱液平行处理，或者可以在 -80°C 下冷冻直至使用。

8. 同时，等分 30 μL 的链霉亲和素结合珠。通过加入 1 mL 的冰冷 PBS 清洗珠子两次；加入裂解缓冲液一次，涡旋（不要涡旋）2-3 次，然后以 1,000 ×离心 克。用裂解缓冲液中制备的 2% BSA 和 tRNA（每 100 μL 珠子 0.1 mg）在 4°C 下封闭珠子 1 小时。 1 小时后，离心并用裂解缓冲液洗涤一次。

9. 丢弃洗涤过的珠子中的缓冲液，将亲和素封闭的总细胞提取物与 0.1 mg 酵母 tRNA 一起添加到珠子中，并在 4°C 下孵育 2 小时至过夜，并持续旋转。

10. ×离心管 g持续2 分钟并去除上清液。将珠子转移到 1.7 mL 管中，用裂解缓冲液洗涤 3 次，用洗涤缓冲液洗涤两次，洗涤之间进行离心（如上）。

11. 在冰冷的 PBS 中进行最后一次洗涤并去除多余的缓冲液。

12. 向磁珠中加入 150 μL 生物素洗脱溶液，并在 4°C 下旋转孵育 1 小时，以从磁珠中洗脱 mRNA-蛋白质/RNA 复合物。

13. 1,000 ×离心机 g 2 min，将洗脱液转移到新的微量离心管中，再次离心，将洗脱液转移到新管中以确保没有珠子带入。

14. 要反向交联用于 RNA 分离的部分，向洗脱液中加入等体积的交联反向缓冲液，并在 70°C 下孵育 45 分钟。

15. 为了使用于蛋白质分离的级分反向交联，加入适当体积的 5× 蛋白质样品缓冲液以达到 1× 浓度，并在 70°C 下孵育 45 分钟。

16. 去交联的 RNA 和蛋白质样品可以保存在 -20°C。

数据分析

A. 沉淀 RNA 分析

1. 反向交联后，每 300 μl 洗脱液中加入 175 μL MPC 蛋白沉淀试剂，剧烈涡旋 10 s。

2. × 4°C 离心 10 分钟克。

3. 小心地将上清液转移到新的离心管中。添加糖原（80 μg/mL 最终浓度）和 NaOAc（0.3 M 最终浓度），并彻底涡旋 20 秒。加入等体积的异丙醇，颠倒离心管 20 次混匀， -20 °C 孵育过夜。

4. 离心管（12,000 × g在 4 °C 下10 分钟）。含有 RNA 的颗粒应该是可见的。小心丢弃上清液。

5. 用 70% 冰冷的乙醇清洗颗粒。 ≥10,000 × 4°C 离心 5 分钟克。小心丢弃上清液。

6. 将试管在 50°C 的干浴中加热 10 分钟，盖上盖子，以蒸发残留的乙醇。不要过度干燥，因为这会使颗粒难以溶解。

7. 将颗粒溶解在 30 μL 的超纯水中。在 50°C 加热 5-10 分钟以达到完全溶解。将溶解的 RNA 储存在 -20°C 或 -80°C 的冰箱中，以便长期储存。

8. 如前所述构建 RNA-seq 库 (Levin et al ., 2010)。 Oligo(dT) 选择是可选的，取决于是否需要单独的 polyA+ RNA。

9. 在 55°C 下用 SuperScript III (Invitrogen) 反转录 RNA，并在 5% DMSO 存在下用 Herculase (Stratagene) 扩增 cDNA 16 个循环，然后用 1.8倍体积的 AMPure 珠子 (Beckman-印第安纳州库尔特）。

10. 使用标准方法对文库进行测序，深度约为 10 ^{7 个读数（}例如，我们使用了 Illumina HiSeq2000 测序仪，具有配对末端 76 个碱基读数；Nair等人，2020）。

B. RaPID RNA seq的数据分析

1. 使用 Kallisto (Bray et al ., 2016) 并针对酿酒酵母( S. cerevisiae ) 参考转录组（源自酿酒酵母基因组数据库并利用酿酒酵母S288C 基因组版本 R64- ）从 RNA-Seq 数据中估计基因表达水平2-1)。图 3A 中提供了为不同 MS2 标记的 mRNA 获取的各种 RNA 的读取计数示例。

注意：将每个基因注释的 3'UTR 下游的 100 个碱基视为 mRNA 的一部分，以覆盖可能的未注释 3'UTR 区域。

2. 识别差异表达的基因。我们使用了 edgeR (Robinson et al ., 2009)，将色散参数手动设置为 0.1。那些报告为至少四倍差异表达（FDR < 0.001）的基因被保留为显着差异表达。在对数据 [log ₂(TPM +1)] 进行对数转换后，从实验样本中减去来自对照样本的基因表达值。通过使用集成到 Trinity 软件套件中的转录组分析模块，促进了表达定量、差异表达和热图的绘制（Haas等人，2013 年）。很难预先确定有多少 RNA 富含特定的 MS2 标记的诱饵 mRNA，因为它取决于 MS2 标记的 mRNA、使用的酵母菌株（例如， MATa或MATα ，或特定的缺失菌株），以及所采用的生长条件。根据我们的经验，我们发现了多达 10 个由 RaPID-seq 鉴定的相互作用的 RNA。通过其他方法验证这些结果很重要（例如，co-smFISH、RaPID pulldowns，然后是 qRT-PCR）。我们成功地鉴定并验证了各种 mRNA 的这种 RNA-RNA 相互作用（例如，编码交配因子、热休克蛋白、MAP 激酶等）。

图 3。 来自 RaPID-seq 的读取计数示例，带有各种 MS2 标记的 mRNA 和用于 RaPID-MS 的银染凝胶。

(A)显示的是来自 Nair等人的补充文件 1 的“Counts.matrix”excel 表的屏幕截图。（2021 年）。它显示了分配给每个基因的读取数（基因名称在 A 列中），用于各种 MS2 标记的目标 mRNA（列标题）。 Cntrl - 控制未标记的应变。过滤掉 rRNA、tRNA 和 snRNA。对于EXO70 mRNA（L 列），表（如图所示）从大到小排序。蓝色标记的细胞显示在EXO70 、 SRO7和OM45的 RaPID-seq pulldowns 中富集的交配相关基因。请注意，MS2 标记的EXO70目标 mRNA 高度富集其自身的 RNA。许多 RNA 对所有菌株都是通用的，包括未标记的对照细胞，因此被视为背景。在已鉴定的约 7,100 个基因中，仅显示了少数选定的基因。 (B)用于 RaPID-MS 的 SDS-PAGE 凝胶的银染（转载自 Nair等人，2021）。培养表达带有或不带有 3'UTR 的MS2 适体标记的MFA1 、 MFA2和STE2的酵母菌株以及ASH1 ，并针对 RaPID-MS 进行处理。箭头表示存在于STE2车道（以及所有MFA1和MFA2车道）中的 ~150 kDa 条带，但不在ASH1或STE2 Δ3'UTR车道中。将该条带从凝胶上切下并送去进行 MS。蓝色方块——表示 MCP-GFP-SBP 的波段。 kDa——千道尔顿。

C. 沉淀蛋白分析

1. 要识别未知蛋白质，有两种选择。首先是在中等大小的 1.5 mm 厚凝胶（例如，20 cm × 15 cm，Bio-Rad）9% SDS-PAGE 凝胶上分离蛋白质。使用允许在每个泳道加载整个样品体积（约 180 μL）的梳子。

2. 根据制造商的说明，使用银染试剂盒 (Pierce) 进行银染。它与随后的质谱分析完全兼容。

3. 分析染色结果。如果检测到特定条带（参见图 3B），请用无菌刀片将其切除并发送到质谱仪进行识别。

4. 第二种可能性是将整个样品送去进行质谱分析。

5. 我们建议在实验前与所选蛋白质组学机构的人员讨论蛋白质样品制备和提交、肽测量和数据分析。在 D 节中，我们提供了一些细节以作为讨论的基础。

D. RaPID-MS的数据分析

反相纳米液相色谱-电喷雾电离串联质谱和数据分析在以色列国家个性化医学中心（Weizmann Institute，Rehovot，Israel）进行。凝胶切片在核心设施进行处理和胰蛋白酶消化。使用了使用 FlexIon 纳米喷雾装置 (Proxeon) 耦合到四极轨道阱质谱仪 (Q Exactive HF)的nanoUPLC（10 μm 尖端；新物镜；Woburn，MA，USA）。使用的参数是：MS1 分辨率设置为 120,000（m/z 200），质量范围为 m/z 300-1650，AGC 为 3e6，最大进样时间设置为 60 ms。 MS2 分辨率设置为 30,000，四极杆隔离 m/z 1.7，AGC 为 1e5，动态排除时间为 20 秒，最大进样时间为 60 毫秒。核心设施使用 Proteome Discoverer（1.4 版）处理数据，使用 UniprotKB 酵母蛋白数据库，使用两种搜索算法 - SequestHT 和 Mascot。添加了常见实验室污染物列表以及以下变量修改：C 上的氨基甲酰甲基、M 上的氧化和 N 端乙酰化。过滤数据以获得最大 1% 的错误发现率。

通过使用 RaPID-MS，我们成功识别并验证了与 MS2 标记的 mRNA 及其相关 mRNA 相互作用的新蛋白质（来自 RaPID-seq）（Slobodin 和 Gerst，2010；Zabezhinsky等，2016；Nair等。 , 2021)。尽管在每种情况下，我们都专注于单个切除带和单个已识别蛋白质以进行进一步探索，但该协议可能会产生多种 RNA 相互作用蛋白质进行研究。

讨论

为了验证 RaPID RNA-seq 和 RaPID-MS 结果，建议分别使用 qRT-PCR (RaPID-qPCR) 和西方印迹进行后续 RaPID 实验。在这些后续行动中包括适体标记和非标记表达 MS2 外壳蛋白的菌株也很重要。这允许测量来自标记菌株与非标记菌株的 mRNA 和蛋白质的定量富集，并分别指示 RNA 和蛋白质的下拉特异性。还强烈建议使用适当的阴性对照（例如，不相关的标记菌株），使用输入样本标准化基因表达，并通过额外的实验验证结果。例如，可以使用单分子荧光原位杂交 (smFISH) 实验验证表明 RNA-RNA 相互作用的 RaPID-seq 结果，使用可以检测潜在相互作用伙伴的双组标记探针。该协议不区分通过碱基配对或相互蛋白质结合的 RNA-RNA 相互作用。使用补骨脂素交联的方案 [例如，PARIS（RNA 相互作用和结构的补骨脂素分析）（Lu等人，2018）或 SPLASH（补骨脂素交联、连接和选择的杂交体的测序）（Aw等人，2017 年）]为此目的对 RaPID 进行补充。为了验证 RaPID-MS 结果，我们建议进行交互实验——即亲和纯化蛋白质并测试 mRNA 是否与蛋白质共沉淀。

由于 MS2 适体和 MCP 之间的高亲和力，RaPID 的独特之处在于它能够从数千个表达的 RNA 中沉淀出单个 RNA （Slobodin 和 Gerst，2010 和 2011）。虽然这种无偏的亲和纯化方法可能适用于任何适体结合组分对（例如，PP7、S1m）（Larson等人，2011；Leppek 和 Stoecklin，2014），但 RaPID 已经证明在沉淀已知和使用单靶 mRNA 作为诱饵的新型蛋白质-RNA 以及 RNA-RNA 相互作用（Slobodin 和 Gerst，2010；Zabezhinsky等，2016； Nair等，2021）。我们的方案已用于酵母中的多种 mRNA，其中一些以低水平表达（例如， UGO1 ；每个细胞<5 个拷贝）和一些高表达（例如， HSP104 ；加热后每个细胞>100 个拷贝） -shock），在所有情况下都能正常工作。因此，该协议应适用于大多数 mRNA。尽管如此，我们还是建议使用 MS2 系统或单分子 FISH 进行实时成像，以估计一般转录本丰度并扩大稀有转录本的协议。最后，我们注意到 RaPID 与 m-TAG 非常吻合，m-TAG 是一种 MS2 适体基因组标记方法，最初开发用于在酵母中定位内源表达的信息（ Haim-Vilmovsky 和 Gerst，2009）。总之，这两种方法可用于开发酵母转录组范围的 mRNA 相互作用图。

笔记

1. 在当前协议中，我们使用版本 3 (V3) MS2 适配体进行 mRNA 下拉实验，如最初为 m-TAG 开发的 (Haim et al ., 2007)。不过，胜家集团还开发了其他版本的 MS2 适配体。例如，V6 MS2 适体（Tutucci等人，2018）可能是有利的，因为它不会显示 V3 有时可能产生的 3'UTR 衰变产物的积累，特别是在使用非天然启动子和/或在诱导 P 体形成的条件下（Haimovich等人，2016 年）。我们建议使用 12 或 24 SL 盒，因为它也可用于单分子 mRNA 成像。较短的磁带很难成像，但可能适用于 RaPID。然而，重复次数越多，mRNA 与链霉亲和素珠结合的机会就会增加。我们没有使用少于 12 次 SL 重复的经验。

2. 结合蛋白的诱导不一定允许内源性表达的 RNP 颗粒的可视化，因为 MCP-GFP SBP 融合只有一个 GFP（与 m-TAG 不同，其中 MCP 与三个 GFP 融合）。我们进行了 45 分钟的诱导步骤，这就足够了。长时间的诱导（即，在我们的酵母菌株中 > 90 分钟）会导致MCP-GFP-SBP 的过度表达，并且可能导致使用 RaPID 的沉淀蛋白质的背景水平更高。为了针对其他菌株/生长条件优化 RaPID，用户可以使用不同的诱导时间执行 RaPID，并将来自感兴趣的 mRNA 的亲和纯化的 RNA 和蛋白质与使用对照菌株或来自不同条件的下拉获得的背景进行比较。

3. 在酵母中进行 RaPID-seq 和/或 RaPID-质谱分析所需的蛋白质提取物的量通常在 80-100 毫克之间。 5-10 mg 的总蛋白提取物足以使用西方分析鉴定沉淀的蛋白质，或通过 qRT-PCR 分析 RNA。因此，酵母的培养体积可能会有所不同，这取决于所需的下游应用以及裂解步骤的效率。

4. 对于每个 RaPID 反应，建议使用等量的细胞提取物。因此，应准确测量总细胞蛋白的浓度。用于此过程的裂解物通常是浓缩的；我们以 1:10 和 1:100 稀释它们，以准确确定蛋白质浓度。但是，也建议从每个反应的等量细胞开始。

5. 为了标准化 qRT-PCR 的基因表达，根据制造商的说明，使用 cDNA 试剂盒从标记和未标记或对照菌株的输入样本中提取等量的 RNA，用于 cDNA 制备。 qRT-PCR 使用基因特异性引物进行。使用以下公式计算倍数富集：

富集倍数 = 2 ^–[（^Ct^{标记的 RaPID –}^Ct^{标记的输入） – （}^Ct^{未标记的 RaPID –}^Ct^{未标记的输入）]}

Ct 指周期阈值。

食谱

1. 三乙二胺四乙酸 (EDTA) 缓冲液 (TE)

10 mM Tris-HCl 和 1 mM EDTA 在双蒸（或完全去离子）水 (DDW) 中

酸碱度 7.5

2. 1 M LiOAc

TE 中 10.2% (wt/vol) 的醋酸锂

过滤灭菌并在室温下储存长达 1 年。

3. 0.1 M LiOAc

将 0.1 体积的 1 M LiOAc (pH 7.5) 与 0.9 体积的 TE 混合。

在无菌条件下制备溶液并在 RT 中储存长达 1 年。

4. 50% (wt/vol) 聚乙二醇 (PEG) 3350

将 250 g PEG 3350 溶解在 300 mL TE 缓冲液中，同时搅拌并升温至 50°C。

加注至 500 mL，过滤除菌。

5. 鲑鱼精子 DNA (ssDNA)

DNA 以 10 mg/mL 的浓度溶解在超纯水中。

该溶液需要在室温下搅拌至少 2-4 小时以溶解 DNA。通过将 DNA 溶液快速通过 17 号针头 12 次或通过 23 号针头一次，剪切 DNA 有助于降低粘度。

6. 选择性培养基

合成完全 (SC) 基本上根据 Rose等人的方案混合。（1990）。

简而言之，1 L 合成培养基是通过混合 7 g 合成干混合物（由 294 g 酵母氮碱、硫酸铵和不含氨基酸的混合物组成；精氨酸、半胱氨酸和脯氨酸各 0.3 g；各 0.45 g异亮氨酸、赖氨酸和酪氨酸；谷氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸各 0.75 g；天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸各 1.0 g）和 850 mL DDW，加入 350 µL 10 N NaOH，然后搅拌并高压灭菌一个大的（即3 升）锥形瓶。将高压灭菌混合物冷却至 55 °C 后，加入 100 mL 的预热 20% 葡萄糖（重量/体积）以及 10 mL 的无菌过滤的 100 氨基酸库存溶液（见下文）。 100 种氨基酸原液由多达 6 种氨基酸/碱基（例如腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和尿嘧啶）组成，用于制备特定的选择性培养基。例如，SC 培养基包含所有六种，而缺乏组氨酸 (SC-H) 的合成培养基将包含除组氨酸之外的所有培养基。 100 个氨基酸储备液的制备方法如下：首先将 0.4 g 所需的每种氨基酸/碱加入 150 mL DDW，然后在搅拌下加入 3 mL 浓 HCl，使体积达到 200 mL，然后无菌过滤。液体培养基可在室温下储存长达 2 个月。 100 种氨基酸的原液在 4 °C 下可储存长达 1 年，而合成干混合物可在室温下储存长达 1 年。

！注意：NaOH 和 HCl 具有很强的腐蚀性，会导致严重烧伤。可能造成严重的永久性眼损伤。摄入后非常有害。皮肤接触或吸入有害。使用安全眼镜、足够的通风和氯丁橡胶或 PVC 手套！

7. 甘氨酸溶液

1 M 甘氨酸溶液，pH 7.0

8. 酵母裂解缓冲液

20 mM Tris-HCl，pH 7.5

150 毫米氯化钠

0.5%（体积/体积）Triton X-100

1.8 毫米氯化镁₂

使用无 RNase 水制备

9. 完全酵母裂解缓冲液

用以下试剂补充酵母裂解缓冲液（使用前新鲜添加）：

1 ×蛋白酶抑制剂混合物

1 mM 二硫苏糖醇 (DTT)

80 U/mL RNAsin ^®核糖核酸酶抑制剂

10. 抗生物素蛋白溶液

在 PBS 中制备 1 mg/mL

储存于 -20°C

11. 酵母tRNA

10 mg/mL 无核酸酶水溶液

储存于 -20°C

12. BSA 溶液

4% PBS溶液

储存于 4°C

从 BSA 馏分 V 制备

13. 洗涤缓冲液

20 mM Tris-HCl，pH 7.5

300 毫米氯化钠

NP-40 的 0.5% (vol/vol)

14. 生物素溶液

二甲亚砜 (DMSO)原液

在 4°C 下储存长达两周。

对于洗脱，在预热至 37°C 的 PBS 中制备 6 mM 溶液。

该溶液应在使用前直接制备并充分混合。

15. 2×交联反向缓冲液

100 mM Tris-HCl，pH 7.0

10 毫米乙二胺四乙酸

20 毫米数字地面电视

2% (wt/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS)

16. 5×蛋白质样品缓冲液

400 mM Tris-HCl，pH 6.8

50% (v/v) 的甘油

10%（重量/体积）SDS

0.5% (wt/v) 溴酚蓝

存储在 RT。

使用前，加入新鲜的 0.5 M DTT 或 5% (v/v) 的 β-巯基乙醇。

警告！ DTT 和 β-巯基乙醇在吸入或皮肤接触时可能有害。在准备含有这些试剂的缓冲液时使用罩。

致谢

这项工作得到了塔基夫家族基金会、珍妮和约瑟夫尼西姆生命科学中心 (魏茨曼科学研究所) 和以色列科学基金会 (#578/18) 对 JEG 的资助。 RRN 得到了中国和印度博士后研究员 VATAT 奖学金（以色列高等教育委员会）的支持。 JEG 担任微生物学和寄生虫学 Besen-Brender 主席（魏茨曼科学研究所）。

该协议描述于： Nair, RR, Zabezhinsky, D., Gelin-Licht, R., Haas, BJ, Dyhr, MC, Sperber, HS, Nusbaum, C. 和 Gerst, JE (2021)。多路 mRNA 组装成核糖核蛋白颗粒在酵母细胞生理控制中起类似操纵子的作用。 埃莱夫10 ：e66050。

利益争夺

作者声明他们没有相互竞争的财务或非财务利益。

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