材料和试剂

1. 塑料制品

15 ml锥形管（VWR，目录号：76176-950）

48 孔细胞培养板（Corning，Costar，目录号：3548）

离心管（VWR，目录号：87003-294）

T-75培养瓶（Corning，目录号：43064）

2. 细胞系

HEK293S GnT1 ^–（ATCC，目录号：CRL-3022）（见注3）

3. 细胞培养试剂

含有 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺的 DMEM（Lonza，目录号：12-604Q）

胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：16000-044）

非必需氨基酸（NEAA）（Gibco，目录号：11140-050）

青霉素/链霉素（Gibco，目录号：15140-122）

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Gibco，目录号：10010-023）

聚乙烯亚胺，支化（PEI）（Sigma-Aldrich，目录号：408727-100 ml）

4. 盐 - 储存在室温下

过硫酸铵（APS）（Bio-Rad，目录号：1610700）

氯化钙（CaCl ₂）（Sigma-Aldrich，目录号：223506-500G）

HEPES钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H7006-500G）

氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9333-500G）

氯化镁（MgCl ₂）（Sigma-Aldrich，目录号：442611-500G）

氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：SX0420-5）

丙戊酸钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：P4543-25G）

5. 醇类

异丙醇（VWR，BDH，目录号：BDH1133-4LG）

甲醇（Supelco，EMD Millipore，目录号：MX0475-1）

6. 增溶化学品 - 储存于 -20°C

月桂基麦芽糖新戊二醇（LMNG）（Anatrace，目录号：NG310-25GM）

胆固醇半琥珀酸酯（CHS）（Anatrace，目录号：CH210-5GM）

7. 其他化学品

6-氨基己酸（Sigma-Aldrich，目录号：07260-1KG）

30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 29:1（Acryl/Bis）（Bio-Rad，目录号：1610156）

无脂肪酸 BSA（FAF BSA）（PAA Laboratories，目录号：K35-002）

氧化谷胱甘肽（GSSG）（Sigma-Aldrich，目录号：G4376-10G）

谷胱甘肽还原（GSH）（Sigma-Aldrich，目录号：G4251-25G）

咪唑（EMD Millipore，目录号：5720-500GM）

氢氧化钠（NaOH）（VWR，BDH，目录号：BDH3247-1）

四亚甲基二胺（TEMED）（Bio-Rad，目录号：161-0800）

Tricine（Sigma-Aldrich，目录号：T0377-250G）

蛋白酶抑制剂片剂（Thermo Scientific，Pierce，目录号：A32955）

8. 肽类

人α降钙素基因相关肽（Bachem，目录号：4013281）

人肾上腺髓质素（Bachem，目录号：4034489）

人肾上腺髓质素2/中间体（Bachem，目录号：4044529）

9. 酵素

Apyrase（New England BioLabs，目录号：M0398L）

10. 膜制剂和纯化的蛋白质

HEK293S GnT1 的粗膜制备^——使用 pHLsec 表达载体瞬时共表达标记的 MBP-CLR-EGFP 和 MBP-RAMP 的细胞（Aricescu等，2006）；制备方法发表于 Roehrkasse等人。(2020) – 在液氮中速冻并储存在 -80°C。最终制剂储存在 25 mM HEPES、pH 7.5、10% (v/v) 甘油、25 mM NaCl、2 mM MgCl ₂和 1x 蛋白酶抑制剂片剂中。蛋白质浓度为 ~4-6 mg/ml，受体为 ~100 nM。

纯化的 H ₆-SUMO-mini-G 蛋白（使用了 mini-G _s、mini-G _s/i和 mini-G _s/q；本协议利用来自 miniG_的示例数据）；Carpenter 和 Tate（2016 年和 2017 年）、Nehmé等人发表的方法。(2017) 和 Roehrkasse等人。(2020) – 储存在 -80°C。纯化的蛋白质以 ~25-30 mg/ml 储存在 25 mM HEPES、pH 7.5、50% (v/v) 甘油、150 mM NaCl、0.5 mM DTT、1 mM MgCl ₂和 1 μM GDP的缓冲液中（见注释 1 和 2）。

11. 高分辨率透明天然 PAGE 凝胶（参见配方）

12. 4 ×结合缓冲液（见配方）

13. 4×洗涤剂缓冲液（见配方）

14. 运行缓冲区（见配方）

15. 培养基（见食谱）

16. 转染培养基（见配方）

17. 100 mM GSH 和 GSSG 氧化还原缓冲液（见配方）

设备

1. Mini-PROTEAN 电泳仪（Bio-Rad，型号：1658001FC）

2. Chemidoc MP 成像仪（Bio-Rad，型号：12003154）

3. CO ₂培养箱（NuAire，型号：NU-5800）

4. 成像托盘（Bio-Rad，目录号：12003028）

5. 摇摆器（Reliable Scientific，型号：55）

6. 管不倒翁（Labnet International，型号：H5500）

7. 台式微型离心机（Eppendorf，型号：5415R）

软件

1. ImageLab（Bio-Rad，https: //tinyurl.com/2v4t44re ）

2. 棱镜（GraphPad，https ://www.graphpad.com/ ）

程序

A. 制备：高分辨率透明天然 PAGE (hrCNE) 凝胶（Wittig等，2007）和缓冲液

1. 根据下面的配方部分准备 hrCNE 凝胶（参见配方 1，表 2）。我们使用了 8% 的分离胶，但也可以使用其他比例的分离胶（见注释 12）。

2. 根据以下配方（配方 2 和 3）准备 4 ×结合缓冲液和 4 ×增溶缓冲液库存。

3. 准备 hrCNE 20 ×阴极和 50 ×阳极缓冲液，并将它们在室温下储存在暗柜中（配方 4）。

B. 贴壁细胞培养——对于贴壁细胞培养筛选格式（见注 4）

1. 制备：细胞培养基

a. 培养基（见配方 5）。

b. 转染培养基（参见配方 6）。

2. 播种

a. 种子 120,000 个细胞/孔 HEK293S GnT1 ^——在经过细胞培养处理的48 孔透明板中加入 250 μl 培养基。

b. 将板在 37°C 下用 5% CO ₂孵育24 小时，并生长至 ~90% 汇合度。

3. 使用 PEI 瞬时转染 DNA

制备质粒 DNA 转染混合物并添加到细胞中。

a. 原料

1）。DMEM（剩余体积共 30 μl）。

2）。受体表达质粒 DNA（每孔共 300 ng）（见注 5）。

3）。PEI 与 DNA 的比例为 1.5:1（0.45 μl 的 1 mg/ml 原液）。

4）。46.67 mM 丙戊酸（2.8 μl 500 mM 储备液）。

b. 组装和添加到细胞

i. 对于转染混合物，将编号为 1)-3) 的成分组合到微量离心管中（添加顺序为 DMEM à DNA à PEI）并通过上下移液混合均匀。

ii. 在室温下孵育 10 分钟。

iii. 当转染混合物孵育时，小心地从 48 孔板中吸出培养基并更换为 250 μl 的转染培养基。

iv. 向离心管中加入丙戊酸（成分编号4 ）并充分混合。

v. 将 30 μl 转染混合物转移到 48 孔板中的相应孔中，并通过轻轻旋转板混合。

vi. 在 30°C 下用 5% CO ₂孵育板72 小时。

C. 准备：实验当天（筛选格式或定量格式）

1. 通过在 ddH ₂O 中稀释 20× 和 50× 储备液来制备 1× 阴极和 1× 阳极缓冲液，并在运行天然凝胶之前在 4°C 下冷却几个小时，向阴极缓冲液中添加去污剂系统。

a. 1× 阴极缓冲液（参见配方 4）。

b. 1× 阳极缓冲液（参见配方 4）。

2. 在冰上解冻 4 × 结合缓冲液和 4 × 去污剂缓冲液、腺苷三磷酸双磷酸酶和肽激动剂。

3. 用 0.1 mg/ml FAF-BSA 制作 1× 结合缓冲液：对于 500 μl 总体积，将 372.5 μl ddH ₂O 与 125 μl 4×结合缓冲液和 2.5 μl 20 mg/ml FAF-BSA（溶解在 ddH ₂O 中）混合）。

4. 稀释 500 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶原液

a. 筛选格式：在结合缓冲液中以 1:10 的比例加入 FAF-BSA 至 50 U/ml 并保持在冰上。

b. 定量格式：1:100 在结合缓冲液中加入 FAF-BSA 至 5 U/ml，并保持在冰上。

5. 使用 0.2 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶制备 4× 洗涤剂缓冲液：对于 200 µl 总体积，将 199.2 μl 4× 洗涤剂缓冲液与 0.8 μl 50 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶稀释液混合（见注释 6）。

6. 在设置检测之前，在冰上解冻膜制备和 mini-G 蛋白。

7. 制作100 mM GSH 和 GSSG 氧化还原缓冲液（参见配方 7）（参见注释 7）：

8. 使用 100 mM GSH 和 100 mM GSSG 库存为特定检测格式制作工作库存。

a. 筛选形式

2.4 mM GSH/0.48 mM GSSG 库存（100 μl：97.12 μl ddH ₂O、2.4 μl 100 mM GSH、0.48 μl 100 mM GSSG）。

b. 定量格式

50 mM GSH/10 mM GSSG 原液（100 μl：40 μl ddH ₂O、10 μl 100 mM GSSG、50 μl 100 mM GSH）。

D. 贴壁细胞培养筛选格式

1. 结合反应

最终反应由 25 μl 4× 去垢剂缓冲液和 75 μl 结合反应体积组成；在引入 48 孔板中的转染细胞之前，结合反应在微量离心管中组装。

a. 配料（按添加顺序）

1）。1× 结合缓冲液（剩余体积共 75 μl）。

2）。200 μM GSH/40 μM GSSG（6.25 μl 2.4 mM GSH/0.48 mM GSSG 储备液）。

3）。4% v/v 甘油（6 μl，来自 50% v/v 储备液）。

4）。66.66 μM mini-G 蛋白（体积取决于 mini-G 库存浓度）。

5）。13.33 μM 肽激动剂（体积取决于肽储备浓度）。

b. 组装和添加到细胞

i. 将编号为 1)-4) 的成分混合并搅拌均匀。

ii. 在冰上孵育 30 分钟，以减少 mini-G 蛋白。

iii. 将肽激动剂（成分 5）添加到所需的反应中并充分混合。

iv. 从 48 孔板中的细胞中吸取培养基。

v. 用 250 μl 1× PBS 清洗孔。

vi. 吸出 PBS 并将板置于冰上。

vii. 向每孔细胞中加入 75 μl 结合反应液，旋动板混匀。

viii. 将 48 孔板在冰上孵育 30 分钟。

2. 增溶

a. 向每个孔中加入 25 μl 4× Detergent 缓冲液 ± 0.2 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶，并旋转板混合（见注释 6）。

b. 将板放在 4°C 的摇杆上，让细胞溶解 2 小时。

c. 移液器将裂解物移至冰上预冷的离心管中。

d. 使用 hrCNE 凝胶电泳和图像凝胶进行分析，如程序 FG 中所述。

E. 定量分析格式

1. 定量分析结合格式 1（图 1）——激动剂对 mini-G 偶联受体的表观亲和力

a. 最终反应由 ¼ 4× 去污剂缓冲液和 ¾ 体积结合反应组成；结合反应由 mastermix 和激动剂系列稀释组合而成，以产生最终所需的浓度（每个步骤的浓度见表 1）。

b. 为了最大限度地提高重现性，将在所有反应中均等的反应组分组合在一个 mastermix (MM)（受体膜制备、过量的 mini-G 蛋白和腺苷三磷酸双磷酸酶）中；GSH 和 GSSG 与 mini-G 一起添加以保持 mini-G 蛋白减少（见注 7）。

c. 主混音：

i. 成分（按添加顺序显示 400 μl MM 的体积）

1）。ddH ₂O（剩余体积共 400 μl）。

2）。1× 结合缓冲液（100 μl 4× 储备液）。

3）。0.1 mg/ml FAF-BSA（2 μl 20 mg/ml）。

4）。400 μM GSH/80 μM GSSG（3.2 μl 50 mM GSH/10 mM GSSG 储备液）。

5）。0.133 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶（10.64 μl 5 U/ml 原液）（见注释 8）。

6). 133.5 μM mini-G 蛋白（体积取决于 mini-G 原液浓度）（见注 9）。

7）。26.67 nM 受体膜制剂（106.68 μl 100 nM 储备液）。

ii. 部件

将编号为 1)-6) 的成分混合并搅拌均匀。

在冰上预孵育 30 分钟，以减少 mini-G 蛋白。

添加受体膜制剂并通过上下移液混合均匀。

d. 激动剂稀释：

i. 在含有 0.1 mg/ml FAF-BSA（浓度见表 1）的 1× 结合缓冲液中，在冰上的微量离心管中将激动剂肽稀释至最终所需最高浓度的 2.67 倍。

ii. 在含有 0.1 mg/ml FAF-BSA 的 1×结合缓冲液中连续稀释激动剂肽 3 倍（例如，在含有 0.1 mg/ml FAF-BSA 的 20 μl 1×结合缓冲液中稀释 10 μl 激动剂稀释液）。

e. 结合反应：通过将等体积 (15 μl + 15 μl) 的激动剂稀释液和 mastermix 结合来组装结合反应。

f. 在冰上孵育结合反应 30 分钟，然后进行增溶（步骤 E3）。

2. 定量分析结合格式 2 – mini-G 对激动剂占据的受体的表观亲和力

a. 最终反应由 1/4 4x 去污剂缓冲液和 3/4 结合反应组成，如测定格式 1；结合反应由 mastermix 和 miniG 系列稀释组合而成，以产生最终所需的浓度（见表 1）。

b. 为了最大限度地提高重现性，将在所有反应中均等的反应组分组合在一个 mastermix (MM) [10 nM 的受体复合物，过量的 (10 μM) 激动剂（见注释 14）]；GSH 和 GSSG 在连续稀释中与 mini-G 一起加入，以保持 mini-G 蛋白减少。

c. 主混音：

i. 成分（按照显示的 400 μl MM 的体积添加顺序）

1）。ddH ₂O（剩余体积共 400 μl）。

2）。1× 结合缓冲液（100 μl 4× 储备液）。

3）。0.1 mg/ml FAF-BSA（2 μl 20 mg/ml）。

4）。0.133 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶（10.64 μl 5 U/ml 原液）（见注释 8）。

5）。26.67 μM 激动剂（体积取决于激动剂库存浓度）。

6). 26.67 nM 受体复合物（106.68 μl 100 nM 储备液）。

ii. 按照指示的顺序组装所有成分并混合均匀。

d. Mini-G 稀释液：

i. 在含有 0.1 mg/ml FAF-BSA 的 1× 结合缓冲液中，将 mini-G 蛋白稀释至最终所需最高浓度 (200 μM) 的 2.67 倍。

ii. 添加 3 倍摩尔过量的 GSH/GSSG (600 μM)，混合均匀，并在冰上预孵育 30 分钟，以减少 mini-G。

iii. 在含有 0.1 mg/ml FAF-BSA 的 1×结合缓冲液中连续稀释 mini-G 3 倍（例如，在含有 0.1 mg/ml FAF-BSA 的 20 μl 1×结合缓冲液中稀释 10 μl 激动剂稀释液） ; 请注意，GSH/GSSG 与 mini-G 蛋白按比例稀释。

e. 结合反应：通过结合等体积 (15 μl + 15 μl) 的 mini-G 稀释液和 mastermix 来组装结合反应。

f. 在冰上孵育结合反应 30 分钟，然后进行增溶（步骤 E3）。

图 1. 定量分析格式概述。

描述了与程序 CG 和协议中的数据分析相对应的定量 hrCNE 凝胶测定格式的关键步骤。

表 1. 协议各个阶段的缓冲液和结合反应成分浓度。

¹结合缓冲液：25 mM HEPES，pH 7.5，140 mM NaCl，10 mM KCl，1 mM MgCl ₂，2 mM CaCl ₂+ Pierce 蛋白酶抑制剂 (PI)。

²GSH:GSSG 的摩尔比始终为 5:1，而对于 mini-G _s和 mini-G _s/q_而言，GSH:miniG 的比例始终为 3:1 ；有关 mini-G _s/i_的其他信息，请参阅 Roehrkasse等人。(2020)。

3. 增溶

a. 通过上下移液混合解冻的 4x 洗涤剂缓冲液。

b. 在每个结合反应中加入 10 μl 4×洗涤剂缓冲液（配方 3）；这将使所有浓度达到最终浓度的 1 倍

c. 将微量离心管放在冷藏室 (4°C) 中的离心管上，让反应溶解 2 小时（见注 10）。

d. 最终缓冲条件：

25 mM HEPES，pH 7.5

140 毫米氯化钠

10 毫米氯化钾

1 毫米氯化镁₂

2 mM CaCl ₂

0.5% w/v LMNG/0.05% w/v CHS

Pierce 蛋白酶抑制剂，0.538×

注意：这仅来自缓冲液，最终溶液还包括来自 mini-G 储存缓冲液的成分，添加量因测定形式以及膜制备储存缓冲液而异。我们样品中甘油的最终浓度从在未添加 mini-G 蛋白的样品中为 1% v/v，在含有最高量 mini-G 蛋白的样品中为 3%。

F. 凝胶电泳（见注释 11 和 12）

1. 在冷藏室 (4°C) 中设置 hrCNE 凝胶，并使用程序 C 中制备的预冷阴极和阳极缓冲液。

2. 在 100 V 下预运行凝胶 20 分钟，让洗涤剂进入凝胶。

3. 将步骤 D2 或 E3 中的1.5 ml 离心管放入预冷至 4°C 的离心机中。

4. 在微量离心机 (Eppendorf 5415R) 中，4°C 下以 16,100 × g离心10 分钟。

5. 将 20 μl 的每个反应上清液装入孔中。这可能是一个具有挑战性的步骤，可能需要一些练习，因为没有使用加载染料。

6. 在 200 V 下运行凝胶 3.5 小时。

G. 通过凝胶内荧光成像凝胶

1. 轻轻地将凝胶与玻璃板分离，并在 ddH ₂O 中冲洗 3 次。

2. 使用 BioRad ChemiDoc MP 成像仪成像，使用印迹/紫外线/无染色成像板。

3. 预设程序：用于 EGFP 荧光的 ProQ Emerald 488。

4. 曝光时间因条带强度而异。对于定量凝胶，确定最佳曝光时间并同时对所有凝胶成像；80-120 秒是一个合理的起点。

H. 使用 Bio-Rad Image 实验室软件量化条带强度

1. YouTube 上的 Bio-Rad 提供了教程视频：https : //www.youtube.com/watch?v= IV_P47ScoYo & list = PLrAEgIY86I6zytNeMPGBhvXnKIm5MS-6J & index =3& t =8s。

2. 使用图像工具根据需要拉直/旋转图像。

3. 使用泳道和波段工具定义泳道并选择波段

a. 手动分配 10 个泳道并调整泳道以与凝胶对齐。

b. 使用“添加波段”功能为所有二聚体和四元复合波段选择波段。

c. 在条带不易看到的区域，您可以查看车道剖面工具以查看微弱的条带。

4. 使用泳道剖面图选择/调整谱带峰的宽度。

a. 通过使用背景选择，可以根据需要调整和排除背景。

b. 查看每个波段的宽度并根据需要进行调整。注意带宽，以确保它们是均匀的。

5. 使用分析数据功能导出数据。

数据分析

在对数刻度上绘制由密度测定法确定的调整后的体积对激动剂（格式 1）或迷你 G（格式 2）浓度。使用 3 或 4 参数逻辑方程通过非线性回归拟合激动剂和 mini-G 结合数据，并确定 pEC ₅₀（四元复合物外观）或 pIC ₅₀值（二聚体消失），以确定表观结合亲和力（见注13)。可以绘制四元复合带的出现和二聚体带的消失。我们已经看到 pEC ₅₀和 pIC ₅₀值之间的良好一致性，如果 mini-G/激动剂亲和力足够高以完全可视化从二聚体到四元复合物的转变。

笔记

1. 我们将 mini-G 蛋白作为 SUMO 融合蛋白生产，最初用于纯化目的，但我们发现对于某些受体复合物，融合蛋白比游离的 mini-G 蛋白效果更好，大概是因为它们的较大尺寸产生了更好的迁移率变化。可能需要测试不同形式的 mini-G 以找到最佳的移动性转变。

2. 已经报道了 mini-G ₁₂_的纯化（Nehmé等，2017）。我们没有在我们的分析中使用这种蛋白质，但我们假设它也能起作用。

3. HEK293S GnT1 ^–细胞系缺乏 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶 I 活性，因此会产生均质的 N-聚糖，从而在凝胶中形成清晰的条带。

4. 在细胞培养罩中使用适当的无菌技术。

5. 我们使用在 N 端用麦芽糖结合蛋白 (MBP) 和在 C 端用 EGFP 标记的 CLR。RAMP 亚基也在 N 端用 MBP 标记。MBP 似乎允许凝胶上有更明确的条带，但这在所有情况下可能不是必需的。此外，柔性受体 C 尾被截断。用于表达的载体是先前描述的 pHLsec 载体（Aricescu等，2006）。

6. 在含有 mini-G 的孔中使用 4x Detergent buffer + 0.2 U/ml apyrase。在所有其他孔中使用 4x Detergent buffer w/o apyrase。

7. mini-G 蛋白有几个暴露于溶剂的半胱氨酸残基，当以高浓度储存时，这些残基有形成分子间二硫键的趋势。我们使用 GSH/GSSG 氧化还原缓冲液来减少 mini-G，而不会损坏我们的受体和肽激动剂，它们包含几个二硫键。在某些情况下，可以更简单地使用低浓度的 DTT 或 TCEP 来降低 mini-G。

8. 在原始论文中，我们按照定量格式中的描述添加了腺苷三磷酸双磷酸酶，但此后我们已转向在增溶步骤中添加腺苷三磷酸双磷酸酶，如粘附筛选格式所述。

9. 我们使用了 25 和 50 μM 的最终 mini-G 浓度。

10. 对于我们研究的大多数相互作用，30 分钟的结合反应和 2 小时的溶解足以达到平衡，但在某些情况下可能需要更长的时间。这应该根据具体情况进行测试。

11. 为天然凝胶配备指定设备是有益的，以避免从以前的 SDS-PAGE 凝胶运行中可能残留的 SDS 残留。

12. 应优化用于 hrCNE 分离胶的丙烯酰胺百分比。对于我们的目的，8% 的分离凝胶效果很好。梯度凝胶也可以考虑。

13. 激动剂、GPCR 和 G 蛋白之间的相互作用很复杂，并且在两个方向上都有变构效应。此外，在电泳过程中可能会扰乱平衡。由于这些原因，我们将来自定量格式的亲和力描述为“表观结合亲和力”。

14. 应选择激动剂浓度以使受体饱和（如果可能，为100×K _D）。

食谱

1. 高分辨率透明天然 PAGE 凝胶（见表 2）

a. 0.1 M 咪唑 (pH 7.0)/2 M 6-氨基己酸的储备溶液可以制备成更大的体积 (250 ml)，并在室温下避光保存。

b. 解析凝胶百分比的选择将取决于要可视化的蛋白质复合物的大小。

c. 在室温下，在15 ml 锥形管中，将 ddH ₂O、0.1 M 咪唑（pH 7.0）/2 M 6-氨基己酸和 30% Acryl:Bis 混合并混合均匀。

d. 加入 APS 和 TEMED，充分混合并立即浇注分离胶。

e. 用异丙醇顶掉凝胶，让凝胶凝固。

f. 倒掉异丙醇并用纸巾轻轻擦拭干净。

g. 用分离胶组装浓缩胶，用 10 孔梳子浇铸，让凝胶凝固。

h. 凝胶可以用保鲜膜包裹的湿纸巾包裹在 4°C 下储存数天。

表 2.hrCNE 凝胶配方。

2. 4×结合缓冲液

100 mM HEPES，pH 7.5，560 mM NaCl，40 mM KCl，4 mM MgCl ₂，8 mM CaCl ₂+ 1× Pierce 蛋白酶抑制剂 (PI) – 10 ml 库存

库存解决方案

1 M HEPES (pH 7.5) 库存

5 M 氯化钠

1 M氯化钾

1 M 氯化镁₂

1 M 氯化钙₂

将 HEPES 储存在 4°C

所有其他的都可以在室温下储存。

对于 10 ml 储备溶液

1 毫升 1 M HEPES，pH 7.5

1.12 毫升 5 M 氯化钠

0.4 毫升 1 M 氯化钾

0.04 毫升 1 M 氯化镁₂

0.08 毫升 1 M CaCl ₂

7.36 毫升ddH ₂O

1 Pierce ^TMProtease Inhibitor Mini Tablets（1x in 10 ml）

将所有成分与 Pierce 蛋白酶抑制剂片剂一起加入 15 ml 锥形管中并涡旋混合（蛋白酶抑制剂片剂难以溶解）。

以 1 ml 等分试样在 -20°C 下储存。

3. 4× 洗涤剂缓冲液

25 mM HEPES, pH 7.5, 140 mM NaCl, 10 mM KCl, 1 mM MgCl ₂, 2 mM CaCl ₂, 2% w/v LMNG/0.2% w/v CHS

库存解决方案

与配方 2 中相同的储备溶液；洗涤剂储备：10% w/v LMNG/1% w/v CHS 在 ddH ₂O 中，在 -20°C 下以 1 ml 等分试样储存。

对于 10 ml 储备溶液

0.25 毫升 1 M HEPES，pH 7.5

0.28 毫升 5 M 氯化钠

0.1 毫升 1 M KCl

0.01 毫升 1 M 氯化镁₂

0.02 毫升 1 M CaCl ₂

2 ml 10% w/v LMNG/1% w/v CHS

7.34 毫升ddH ₂O

1 Pierce ^TMProtease Inhibitor Mini Tablets（1x in 10 ml）

将除洗涤剂外的所有成分加入15 ml 锥形管中，加入 Pierce 蛋白酶抑制剂片剂并涡旋混合（蛋白酶抑制剂片剂难以溶解）。

加入洗涤剂，轻轻但彻底地混合混合。

以 1 ml 等分试样在 -20°C 下储存。

4. 运行缓冲区

1× 阴极缓冲液：50 mM Tricine，7.5 mM 咪唑，pH 7.0，0.01% w/v LMNG/0.001% w/v CHS

1× 阳极缓冲液：25 mM 咪唑，pH 7.0

20× 阴极缓冲液储备：1 M Tricine，150 mM 咪唑，pH 7.0

50× 阳极缓冲液：1.25 M 咪唑，pH 7.0

5. 文化传媒

DMEM

10% 胎牛血清

1× 国家航空航天局

6. 转染培养基

DMEM

2% 胎牛血清

1× 国家航空航天局

50 U/ml 青霉素

50 微克/毫升链霉素

7. 100 mM GSH 和 GSSG 氧化还原缓冲液（见注 7）

a. 称量 GSH 和 GSSG 粉末并添加到单独的 15 ml 锥形管中。

b. 将 ddH ₂O添加到最终所需浓度并涡旋溶解。

c. 通过添加 NaOH 将 pH 值调整为中性。

致谢

这项工作得到了赠款 NIH R01GM104251 和长老会健康基金会种子赠款 (AAP) 以及 NIH 博士前 MD/PhD 奖学金 1F30 HL142232 (AMR) 的支持。这种方法最初是在 Roehrkasse等人中描述的。(2020) 。

利益争夺

没有作者有任何竞争利益要披露。

伦理

该协议使用标准的永生化人类细胞系，不涉及人类或动物受试者。

参考

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