材料和试剂

1. 移液器吸头

2. 0.2 µm 孔径过滤器

3. 1.5 ml 微型离心管（Eppendorf，目录号：0030120159）

4. 0.5 ml 可密封 UV-Cuvette（Fisher Scientific，目录号：10386712）

5. Whatman 膜过滤器，尼龙孔径 0.2 μm，直径 47 mm（Millipore Sigma，目录号：WHA7402004）

6. 封口膜（Bemis，目录号：11772644）

7. ST/NS 24/40 接头的两个橡胶隔垫（Millipore Sigma，目录号：Z553980）

8. ST/NS 24/40 接头的两个玻璃塞（Millipore Sigma，目录号：Z229571）

9. 用于密封比色皿的 12.5 mm 橡胶隔垫（Millipore Sigma，目录号：Z167274）

三件 1 m 长 4 mm 内径橡胶管（Fisher Scientific，目录号：11876293）
一个玻璃漏斗
两个 5 毫升注射器（Terumo，目录号：Z116866）
两个 120 毫米，21 号针（Sterican，目录号：466 5643）
两个 40 毫米，21 号小针（BD Microlance 3，目录号：304432）
PEPC 酶：从大肠杆菌中纯化的野生型或突变型 PEPC ，储存于 -80°C
磷酸烯醇式丙酮酸三钠盐（PEP，Millipore Sigma，目录号：P7002），储存在-20°C
苹果酸脱氢酶（MDH，Millipore Sigma，目录号：M2634），储存在4°C
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，Millipore Sigma，目录号： 10107735001), 储存于 -20°C
氯化镁（MgCl ₂，Millipore Sigma，目录号：63069）
碳酸氢钾（KHCO ₃，Millipore Sigma，目录号：60339）
Tricine（Millipore Sigma，目录号：T0377）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris 碱）（Millipore Sigma，目录号：252859）
氯化钾（KCl，Millipore Sigma，目录号：T0377）
氢氧化钾（KOH，Millipore Sigma，目录号：757551）
超纯去离子水
Tris-HCl（见配方）
Tricine-KOH（见食谱）

设备

1. 移液器

2. 1700 系列带胶结针头的气密注射器（Hamilton，目录号：80200）

3. 氮气供应

4. 氮气罐（最低 99.998% N ₂，BOC，目录号：44-W）

5. 两个 250 ml 双颈圆底烧瓶（Millipore Sigma，目录号：Z516872）

6. 具有三个位置的玻璃单排歧管（Millipore Sigma，目录号：Z532169）

7. 磁力搅拌器

8. 磁力搅拌板

9. 带温度控制的分束分光光度计。例如，Cary 300 紫外-可见分光光度计（安捷伦）。换细胞器不是必需的，但它很方便。

软件

1. Cary WinUV 软件（安捷伦，www.agilent.com）

2. Igor Pro（7.0.8.1 版；Wavemetrics Inc.，俄勒冈州奥斯威戈湖，www.wavemetrics.com）或能够进行非线性回归分析的等效软件包。

程序

A. 无 CO ₂测定组分的制备

此过程需要超过 12 小时，因此应在计划分析的前一天开始。目的是通过用氮气鼓泡主要测定组分来尽可能多地去除溶解的HCO ₃^-。水和缓冲液组成约。75% 的测定溶液，并且足够稳定，可以长时间用氮气鼓泡。典型的脱气装置包括一种缓冲溶液和一种去离子水溶液（图 1 ）。

图1 。一种典型的脱气装置，用于降低测定组分中溶解的 CO ₂浓度。

1. 制备缓冲液储备溶液（200 mM Tris-HCl pH 7.4，或 Tricine-KOH pH 8.0，如下所述）并获得超纯水。将溶液（约50 毫升）倒入单独的双颈圆底烧瓶中，并添加磁力搅拌器。用橡胶隔膜密封圆底烧瓶的一个颈部，并用玻璃塞密封另一个。隔垫可以用封口膜加固以防止气体泄漏。

2. 通过一个隔垫，穿过一根长针，确保针尖浸没在化验组件中。将一根短针穿过同一个隔垫。通过将管子的末端插入注射器主体，为针头创建一个歧管。使用封口膜密封注射器主体和管道之间的连接。将长针连接到氮气源。

3. 要开始喷射过程，请打开由长针发出的气泡指示的气体供应。确保气泡的产生不超过大约。每秒一个气泡。更快的供应将导致测定溶液的损失。打开磁力搅拌器。检查所有连接处是否有氮气泄漏，如有必要，用封口膜修补。

4. 使用前在密闭容器中用氮气大量喷射 12 小时。

5. 喷射期后，关闭氮气供应。将装置连接到高纯度氮气瓶。在第一次测定之前，以类似的速率将气体鼓泡 1 小时，大约。每秒一个气泡。

6. 取出针头并密封烧瓶直至使用。由于此过程后将保留一些背景碳酸氢盐，因此需要按照以下步骤 B4和过程 C 中的描述确定背景浓度。降低的碳酸氢盐浓度将稳定 8 小时。

B. 仪器设置、试剂制备和质量控制

此处描述的浓度测定必须在进行动力学测量的每一天进行，而不仅仅是在制备、解冻或纯化酶时。在用高纯度氮气（1 小时，如步骤 A5 中所述）最后喷射缓冲液期间，可以方便地测量酶和底物的浓度。

1. 仪器设置

此过程需要使用具有温度控制的高质量分束分光光度计。我们还没有找到合适的读板器，因为很难防止与大气 CO ₂平衡的分析；如果能解决这个问题，这个过程就不会那么费力了。这些说明是针对 Cary分光光度计给出的，但可以很容易地适用于任何可比供应商的设备。分光光度计设备需要空间让比色皿安装气密密封。

在开始测量前至少 30 分钟打开仪器，使灯稳定。打开水浴或 Peltier 温度控制并设置为 25°C。

2. 偶联测定材料的制备（苹果酸脱氢酶和 NADH）

从冰箱 (-20°C) 中取出 NADH 并在打开前使其达到室温以防止冷凝。制备 NADH 溶液 [355 mg in 25 ml for a ca. 20 mM 水溶液 (MiliQ)]。用分光光度法确定浓度 ( ε₃₄₀= 6220 M ^–¹cm ^–¹)。这些溶液可以分装冷冻 (-20°C) 并保持稳定约 1 个月。不要重新冷冻。苹果酸脱氢酶在 4°C 下储存直至使用。

3. 磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 原液的制备。

从冰箱 (-20°C) 中取出并在打开前使其达到室温以防止冷凝。准备储备溶液（15 ml 总溶液和 4.3 g PEP 应该导致大约. 400 mM PEP 溶液）. 由于 PEP 含有未知量的水合水，因此需要通过终点分析法通过分光光度法确定浓度。使用 10 mM 碳酸氢盐和 100 µM PEP（估计值），如下所述（程序 C）准备一式三份的测定。在这些条件下，预计A Δ A ₃₄₀= 0.622 ；使用上述消光系数确定您的库存 PEP 浓度。在该测定中，碳酸氢盐必须超过 PEP。该储备溶液可以冷冻 (-20°C) 并保持稳定一个月。

4. 测定背景碳酸氢盐（总溶解 CO ₂）。

需要通过终点分析来确定去除背景 CO ₂的有效性。如果背景碳酸氢盐浓度高于 50 µM，则需要用高纯度氮气将主要成分再鼓泡一小时。如下所述（程序 C），在不添加碳酸氢盐和 20 mM PEP 的情况下准备一式三份的测定。PEP 必须超过背景碳酸氢盐。

C. PEP 和背景碳酸氢盐的终点测定

需要对 PEP 和背景碳酸氢盐进行这些检测，以建立准确的底物浓度。该方法与动力学分析基本相同，除了我们感兴趣的是 340 nm 处信号的总变化，而不是初始速率。可以调整所用 PEPC 的浓度，以确保在合理的时间范围内看到基本上完全转化为产品。如果您可以使用细胞更换器，它们可以并行运行。

故障排除提示：如果您的检测不是气密的，您将在碳酸氢盐检测中看到缓慢的线性阶段，表明与大气进行了气体交换。

1. 将玻璃漏斗连接到正常的氮气供应，以创建一个氮气场，在该场下组装化验。将 PEP、MgCl ₂、NADH、KCl、MDH 和碳酸氢盐（如果需要）添加到空试管中（表 1）。将氮气通过漏斗以创建一个氮气场，并将装有组件的比色皿放在氮气下。取下玻璃塞后，从圆底烧瓶中取出喷过的水和缓冲液。在组装所有检测之前，不建议停止通过缓冲液和水的氮气流。尽快更换玻璃塞，以确保圆底烧瓶在使用后密封。移液器在氮气下混合测定成分并用隔膜密封。

表 1. PEPC 检测构建

笔记：

a. MDH 浓度因批次而异，相应地调整体积。

b. 使用分析浓度的 PEP。

c. 调整碳酸氢盐的最终浓度以考虑背景。请注意，这是总溶解 CO ₂，真实碳酸氢盐浓度随 pH 值和 I 变化。

d. 添加 KCl 是为了防止因改变 KHCO ₃而导致 I 的变化并保持恒定的 [K+]；x+y (µl) 应该是常数。

e. PEPC库存的浓度各不相同。由于 10 µl 是准确移液的方便体积，因此生产 3 µM 工作储备液通常很有用；用分光光度法检查该浓度。

2. 将组装好的检测放在分光光度计中。测量 340 nm 处的吸光度约 30 秒，以确定起始吸光度。暂停数据采集并使用气密 Hamilton 注射器（通常约100 µl）提供 50 nM PEPC（最终浓度）。轻轻地将比色皿从一侧倾斜到另一侧以混合（不要倒置）并将比色皿放回分光光度计。测量吸光度 30 分钟。此时将达到一个稳定的终点。记录终点的吸光度。根据吸光度测量值的差异确定背景碳酸氢盐或 PEP 库存的浓度。

3. 重复终点测定 3 次以确保确定的浓度一致。将浓度报告为平均值和标准偏差。

D. 动力学分析

这些测定的目标是确定一组准确的初始速率，无论是在固定（饱和）浓度的 PEP 下，还是在改变 PEP 和碳酸氢盐的浓度下。应根据需要调整反应时间和酶浓度，以确保在反应的初始速率阶段收集数据；不需要完成进度。测定基本上如上所述构建。在收集初始利率时绘制它们通常很有用；这允许对实验设计进行“即时”调整，以确保覆盖足够的浓度范围。特别是，如果最低c所用碳酸氢盐的浓度高于表观K _m，然后修改您的设计以包括较低浓度的其他点。

1. 像以前一样构建化验（表 1），将所有非脱气成分组合在一个正常的台式机上，然后用氮气填充化验，添加喷射的成分，并在氮气场下密封比色皿。

2. 通过添加 50 nM PEPC 与气密的汉密尔顿注射器 (如前) 来启动检测。通过轻轻摇晃比色皿来混合（不要倒置）。

3. 将比色皿引入分光光度计并开始记录。通常，在 340 nm 处测量吸光度 15 分钟。

4. 使用仪器软件（例如，Cary WinUV 软件中的动力学标尺）计算初始速率。对于每个点，记录两种底物的浓度、酶（如果在一天中的任何时间点变化）、初始速率、单位（例如，μMs ^-1，ΔA ₃₄₀分钟）^——¹)，并注意轨迹是否看起来可疑（例如，非线性，实质上低于或高于预期的速率或噪音）。速率需要转换成浓度随时间变化的单位；这可以在测定结束后立即进行，也可以在一天结束时分批进行。

5. 每个浓度点应重复运行三次。测定不应按浓度顺序进行；不同测定之间的底物浓度，以防止试剂随时间衰减而引起的系统误差。

6. 在数据收集的中途和最后重复终点分析，以确保背景碳酸氢盐没有增加。如果它增加了，用高纯氮气将缓冲溶液和水喷射一小时，然后重新进行终点分析。

7. 在 Igor Pro（或其他合适的软件包）中根据碳酸氢盐浓度绘制计算的反应速度，然后使用适当的动力学模型进行拟合。可以在文献中找到说明性曲线（例如，Moody等人，2020 年的图 1 ）。作为指导，我们发现 a v _i/[E] of ca。40 s ^-1在使 PEP 和碳酸氢盐饱和时是合理的。

数据分析

在固定的单一 PEP 浓度下，可以使用 Michaelis-Menten 方程（方程 1）分析数据，其中v _i/[E _T]是稳态速率除以总酶浓度，k _cat是周转数，K _m是米氏常数，[S] 是底物浓度。参数值的估计标准误差由软件直接提供，k _cat/ K _M_的标准误差可以使用误差传播来估计；如果遵循此程序，则必须包括协方差项（等式 3）。

或者，当两种底物都发生变化时，数据可以用公式 2 描述，其中 A 和 B 是两种底物。

在这两种情况下，选择跨越 0.1 K _M-10 K _M范围的底物浓度范围。通常，在固定浓度的 PEP 下收集数据时，应使用 8 到 12 种不同的底物浓度（即，使用公式 1 进行分析）。当两种底物浓度不同时，应分别使用至少 5 个浓度（即总共 25 次测定）。

k _cat/ K _m的标准误差可以从k _cat和 K _m和协方差（等式 3 [Bevington and Robinson, 1992]）。这里σ _Km, σ _kcat, σ _kcat/Km, cov( k _cat, Km ) 分别是K _m、k _cat、k _cat/ K _m和协方差的标准误。注意，伊戈尔临报告的方差（即，σ ²中的方差-协方差矩阵）。

食谱

1. Tris-HCl，pH 7.4

a. 将 24.23 克 Tris 碱溶解在约 900 ml 水，滴定至 pH 7.53（假设实验室温度为 20℃）。

b. 调整实际实验室温度使用 Δp K _a/ΔT =-0.028 并在容量瓶中使最终体积为 1 L。然后将缓冲液通过 0.2 µm 孔过滤器。

2. Tricine-KOH，pH 8.0

a. 将 35.84 克 Tricine 游离酸溶解在约35.84 克。900 毫升水，滴定至 pH 值 8.10（假设实验室温度为 20°C。

b. 使用 Δp K _a/ΔT = -0.021)调整实际实验室温度，并在容量瓶中使最终体积达到 1 L。然后将缓冲液通过 0.2 µm 孔过滤器。

致谢

NRM 由格兰瑟姆可持续未来中心资助，CP 由 ERC 资助（资助号 ERC-2014-STG-638333）资助，JDR 由生物技术和生物科学研究委员会（BBSRC，英国；奖）资助编号 BB/M000265/1）。该协议是从 Janc等人中描述的协议中修改而来的。(1992)。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

1. Bauwe, H. (1986)。一种测定磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶HCO3 ^-K _m值的有效方法。植物169：356-360。

2. Bevington, PR 和 Robinson, DK (1992)。物理科学的数据简化和误差分析。纽约麦格劳希尔。

3. Blasing, OE, Westhoff, P. 和 Svensson, P. (2000)。Flaveria中 C ₄磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的进化，酶的羧基末端部分中的保守丝氨酸残基是 C ₄特异性特征的主要决定因素。J Biol Chem 275(36)：27917-27923。

4. DiMario, RJ 和 Cousins, AB (2019)。单个丝氨酸到丙氨酸的取代降低了 C ₄Flaveria trinervia 中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的碳酸氢盐亲和力。J Exp Bot 70(3)：995-1004。

5. Duff, SM, Andreo, CS, Pacquit, V., Lepiniec, L., Sarath, G., Condon, SA, Vidal, J., Gadal, P. 和 Chollet, R. (1995)。来自高粱的完整重组 C ₄ 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的非磷酸化、体外磷酸化和磷酸化位点突变 (Asp8) 形式的动力学分析。Eur J Biochem 228(1): 92-95。

6. Jacobs, B.、Engelmann, S.、Westhoff, P. 和 Gowik, U. (2008)。Flaveria中 C4 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的进化：对抑制剂 L-苹果酸的高耐受性的决定因素。植物细胞环境31(6): 793-803。

7. Janc, JW, O'Leary, MH 和 Cleland, WW (1992)。玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的动力学研究。生物化学31（28）：6421-6426。

8. Moody, NR, Christin, PA 和 Reid, JD (2020)。C ₄PEPC 的动力学修饰定性收敛，但在Panicum 中比在Flaveria 中大。Front Plant Sci 11：1014。

9. Paulus, JK、Schlieper, D. 和 Groth, G.（2013 年）。由于单一氨基酸取代，光合碳固定效率更高。国家通讯社4（1）：1518。

10. Phansopa, C.、Dunning, LT、Reid, JD 和 Christin, PA（2020 年）。横向基因转移是高效 C ₄生物化学的进化捷径。Mol Biol Evol 37(11): 3094-3104。

11. 韦伯先生 (1992)。无机磷酸盐的连续分光光度法测定和测量生物系统中磷酸盐的释放动力学。Proc Natl Acad Sci USA 89(11): 4884-4887。