材料和试剂

0.45-μ米聚偏二氟乙烯 (PVDF) 过滤器 (米伊利波，目录编号： SLHV033R乙)
1,000 μl、200 μl、10 μl 移液器吸头 (基尔根, 目录号： KG1333, KG1232, KG1031)
6孔细胞培养板 (康宁，目录编号： 3516)
24 孔细胞培养板（Corning，目录号： 3527)
60 毫米细胞培养盘子康宁，目录编号： 430166)
100-mm 细胞培养皿（Corning，目录号：430167）
埃彭多夫管, 1.5 毫升 (埃彭多夫，目录编号： 0030125150)
15毫升离心机管（康宁，目录号： 430791)
50 毫升离心管（康宁，目录号： 430829)
低温的管子（康宁，目录号： 430659)
棉签
293T 细胞系（美国典型培养物保藏中心，目录号： CRL-3216)
F98 细胞系（美国典型培养物保藏中心，目录号：CRL-2397）
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM; 吉博，目录编号： 11995065)
Opti-MEM（Gibco，目录号：11058021）
胎牛血清 (FBS; 吉博，目录编号： 10099141C)
磷酸盐缓冲盐水（PBS；Gibco，目录号： 10010023)
青霉素-链霉素 (5,000 U/ml) (吉博, 目录编号： 15070063)
胰蛋白酶（0.25%），酚红（Gibco，目录号： 15050065)
氨苄西林 (冷却器，目录号：LG-CA0006)
聚凝胺转染试剂（密理博，目录编号： TR-1003-G)
维戈效应（活力生物技术，目录号：T001）
胰蛋白胨（OXOID，目录号：LP0042B）
酵母抽提物（OXOID，目录号：LP0021B）
海卫一 X-100（Thermo Fisher Scientific，目录号： BP151-100)
氯漂白剂
慢病毒包装质粒 pMD2.G （Addgene，目录号：12259）
慢病毒包装质粒 psPAX2 （添加基因，目录编号： 12260)
通用基因组 DNA 试剂盒（西澳生物技术研究所, 目录编号： CW2298S)
Endofree 质粒 MIDI 试剂盒（CWBIO，目录编号： CW2105S)
EnGen 突变检测试剂盒（试剂盒组件：Q5 Hot Start High-Fidelity 2× Master Mix，NEBuffer 2，EnGen T7 核酸内切酶 I，蛋白酶 K。New England Biolabs，目录号： E3321S)
Flag抗体（Sigma-Aldrich，目录编号： F1804)
亚历克斯·福陆 594 山羊抗鼠IgG (ZSGB-BIO，目录号： ZF-0513)
异氟醚 (RWD 生命科学，目录号： R510-22)
强力霉素饮食, 100 ppm (ReadyDietech, 目录编号： RD07053006)
rAAV2-retro-hSyn-Cre-P2A-GFP (1.7 × 10 13 vg/ml) 购自奥比奥技术（中国上海）

注意：等分试样应储存在 -80°C。

定制 AAV9-TRE 3G-DIO-SaCas9-3×标志（3.2 × 10 13 vg/ml) 和 AAV9-c-fos-rtTA-U6-gRNA (1.7 × 10 13 vg/ml) 是构造由 Vigene Biosciences（中国济南）编辑和包装

笔记：等分试样应储存在 -80°C。

293T 和 F98 细胞的完全生长培养基（见配方）

设备

移液器 (吉尔森, Pipetman 经典 P10, P200, P1000)
-80℃ 冰柜（海尔，型号：DW-86L388J）
II类生物安全柜（ESCO，型号： AC2-4S8-CN)
热循环仪（生物辐射, 型号：C1000 Touch)
冷冻离心机 (Eppendorf, 模型： 5424R)
CO 2 孵化器 (热费舍尔科学的, 型号：Heracell 240i)
共聚焦激光扫描显微镜（徕卡, 型号：TCS SP8)
凝胶电泳室（生物辐射, 型号：Mini-Sub Cell GT Cell)
小动物麻醉机 (RWD 生命科学，模型： R500)
数字立体定位仪（后轮驱动生命科学, 模型： 68026)
微量注射器, 1 μl/OD: 0.55 mm (RWD Life Science, 型号: 79002)
外科剪刀（RWD 生命科学，型号： S14001)
止血钳（RWD Life Science，型号： F22006)
手术钳（RWD 生命科学，型号： F13017)
医用缝线 (RWD 生命科学，型号： F33309)
颅骨钻（RWD 生命科学，型号： 78001)
钻头（RWD 生命科学，型号： 78043)
微注射器泵（KD Scientific，型号：Legato 130）
低温恒温器切片机（徕卡，型号： 1950年)
恐惧调节和惊吓系统（Panlab，西班牙，型号：LE116）

软件

CRISPR RGEN 工具 ( http://www.rgenome.net/cas-designer/ )
GraphPad Prism 8（下载自 https://www.graphpad.com/)
一世法师J 软件（已下载从 NIH 网页）
Packwin V2.0 软件（Panlab，西班牙）

程序

gRNA设计

为了选择 gRNA 目标，我们推荐 CRISPR RGEN 工具 ( www.rgenome.net/cas-designer/ )。21 个核苷酸的目标序列应该靶向早期外显子（靠近转录起始位点）或基因功能的关键外显子，在 5′——神经网络protospacer 相邻基序（SaCas9 的 PAM）序列。我们推荐选择靶向序列与更高帧外得分（≥ 65 为受到推崇的) 并且预测较少错配 (≤ 3 个错配碱基不是推荐）在整个基因组中，以尽量减少 SaCas9 的脱靶效应。核苷酸 GC 含量应在 20% 到 80% 之间。丢弃具有超过 4 个重复胸腺嘧啶 (TTTT) 的目标，以减少聚合酶 III 可能导致的终止。一个额外的“核苷酸应该附加到 5′ gRNA 的末端，这是 U6 启动子强表达所必需的（表 1）。
慢替韦阿尔表达 SaCas9 和 gRNA 的载体 ( CMV-SaCas9-P2A-mCherry-U6-gRNA ) 可从 Vigene Biosciences 购买。

表 1. 本协议中使用的 gRNA 序列

gRNA评估体外

慢病毒生产

转染前一天，种子约 500k 293T 细胞成 60 毫米 4毫升的盘子的完全生长培养基. 将 293T 细胞均匀分布在培养皿中换挡盘子左右和前后.

备注：健康 293T细胞是基本的用于病毒包装。切勿使用超过 25 代、生长不均匀的细胞，或看起来形态异常。

仔细检查增长率 293T电池s; 我们建议在慢病毒包装前 40-60% 汇合。用新鲜的（2 ml）更换细胞培养基转染前1小时, 然后在 37°C 的CO 2培养箱中培养。
一种化脓性转200 微升 Opti-MEM 到 1.5 ml 管中，用于每个要转染的培养皿。添加 400 纳克CMV-SaCas9-P2A-mCherry-U6-gRNA、200 ng pMD2.G 和 300 ng psPAX2 到中等的并缓慢移液混合.
无菌转移另一个对于要转染的每个培养皿，将 200 μl Opti-MEM 加入 1.5 ml 试管中。加4 微升 VigoFect 的到 200 μl Opti-MEM, 缓慢移液混合, 并平衡至室温 5 分钟。
将 VigoFect 溶液加入质粒溶液中一滴一滴. 移液器这转染液轻轻地，避免产生气泡，然后平衡至室温为了 15 分钟
添加转染 293T细胞解决方案一滴一滴, 并通过移动盘子轻轻混合。
代替培养基新鲜的（4 毫升）转染后6小时。
验证 mCherry 表达 293T 荧光显微镜下的细胞转染后24小时——转染效率应在80%以上。
在 15 ml 离心管中收集慢病毒上清液， 36 和 60 转染后h.
将慢病毒上清液以 3,000 rpm 的速度离心 5 分钟至颗粒碎片, 并在新管中收集上清液.
过滤慢病毒我们上清与 0.45-μm PVDF过滤器, 等分这慢病毒溶液装入一次性小瓶中，然后储存在 -80°C。

笔记：

遵守以下准则 BSL-2，通过浸泡10%对所有进入慢病毒接触的材料进行消毒氯漂白剂处理前 30 分钟。
对于另一种 gRNA (gRNA1-gRNA5) 的慢病毒生产，重复步骤 B1c-B1k.

转导 F98 细胞体外

转染前一天，种子大约 100k F98 细胞成一口井 6孔盘子用 2 ml 完全生长培养基，并将细胞均匀分布在孔中。
解冻慢病毒溶液, 加入适当体积的聚凝胺 (1:1,000 比例) 并缓慢移液混合。
用 1 ml 慢病毒溶液替换培养基，然后放回培养箱.
转染后 12 小时，用新鲜培养基（2 毫升）更换培养基。

注意：为了实现 Cas9 和 gRNA 的更高转录，它是可选的重复步骤 B2b-B2d（重复将慢病毒溶液添加到相同的细胞）。

转染后 72 小时，用荧光显微镜验证 F98 细胞中的 mCherry 表达。
提炼根据制造商的方案，使用通用基因组 DNA 试剂盒在慢病毒转染 72 小时后检测基因组 DNA 。

核糖核酸评估通过 T7 核酸内切酶测定

通过 PCR 扩增 600 至 1,000 bp 片段 SaCas9 位于切割位置的侧翼。短暂旋转和混合每个组件使用前. 设置反应如下：

Q5 热启动高保真 2× 主混音 2.5 微升

10 μM 正向引物 1.25 微升（0.5 微米）

10 μM 反向引物 1.25 微升（0.5 微米）

模板DNA 500 纳克

无核酸酶 H 2 O 至 25 微升

gRNA 的引物序列：

gRNA-1-F GATTTTGGATCATTGTT

gRNA-1-R CCTGTGTCAAAGTCTCA

gRNA-2-F GCTGTGCTGTTTCTGG

gRNA-2-R CAAATCACCTGCCTTCT

gRNA-3-F TAAGTGCCCTGTATGA

gRNA-3-R GTCGGTAAAACTAAGTAAATGTG

gRNA-4-F TGTGCCGTATTCAGTCC

gRNA-4-R CTGCGTCCAAACATAAAC

gRNA-5-F CCAGATGCTGCGTCCAA

gRNA-5-R 中国民航总局

注意：引物应偏离中心扩增子确保消化产生两个 DNA 片段不同的尺寸。

简要地旋转将所有液体收集到管底部，然后使用以下程序开始 PCR：

初始变性 98°C 30 秒

变性 98°C 5 秒（35 个循环）

退火 62℃ 10 秒（35 个循环）

延期 72°C 20 秒（35 个循环）

最终扩展 72°C 2分钟

可选：在琼脂糖凝胶上运行一部分PCR 产物以确认正确扩增。

为了在 PCR 产物之间产生异源双链，建立反应如下：

PCR反应 5 微升（<250 纳克）

10×NE缓冲液2 2微升

无核酸酶 H 2 O 12 微升

笔记：解理可能不完整，如果太许多 PCR 产物被添加到异源双链消化反应中。

为了使产品变性和退火，设置一个程序如下：

变性 95℃ 5分钟

退火 1 95-85°C -2℃/秒

退火 2 85-25℃ -0.1°C/s

抓住 4℃

注：或者，样品可加热至 95°C 10 分钟，然后缓慢冷却至室温。

消化异源双链体es, 建立反应如下：

退火 PCR 产物 19 微升

EnGen T7 核酸内切酶 I 1 微升

搅拌均匀短暂旋转, 将反应在 37°C 下孵育 15 分钟。
加入 1 µl 蛋白酶 K，37°C 孵育 5 分钟以停止异源双链消化。
在2% 琼脂糖凝胶上运行产品以分析 DNA 片段，并选择效率最高的 gRNA进行目标基因座的基因编辑（图 2）。

图 2. 用于基因组修饰的 T7 核酸内切酶检测。

在用指定的 gRNA 转染的 F98 细胞中，SaCas9 介导的 DNA 切割。裂解的分数由红色三角形表示。使用以下公式计算估计的％修改: % 修改 = 100 × [1-(1-fraction) 1/2 ]。

秒立体定向的 AAV注射
1. 一种嵌套老鼠 (230 到 250 g) 和 1% 戊巴比妥钠（腹腔注射，0.1 g/kg）。

注意：麻醉是通过对麻醉没有反应来确认的。尾巴捏。

将头皮从眼睛刮到耳朵，然后将老鼠放在立体的仪器。

注意：通过颧骨将颅骨沿前后轴和中间轴对齐是至关重要的。耳棒s。

用蘸有碘和酒精的棉签依次对手术区域进行消毒。
沿中线做一个切口手术刀，并用棉签刮掉切口下方的组织和血液。
用一个微型注射器固定在立体定位仪的右臂上，以标记前囟的位置和必要的注射部位：IL [前后 (AP)：2.8 毫米；内外侧 (ML)：±0.5 毫米；背腹侧（DV）：-4.5 毫米]，杏仁核（AP：-2.8 毫米；ML：±4.8 毫米；DV：-8.4 毫米）。
在所需坐标上方钻出小孔，用棉签以阻止潜在的出血。
注射 1 μ升 rAAV2-retro-hSyn-Cre-P2A-GFP 到杏仁核，和 1 μl 的混合物一种AV9-TRE3G-DIO-SaCas9-3×旗帜和 AAV9-c-fos-rtTA-U6-gRNA（1:1 比例）与 IL，流速为 0.1 μl/min，使用显微注射泵。
到使能够病毒扩散并防止针道潜在的泄漏，将针尖留在原位 5 分钟，每次注射后逐渐撤回。

注意：注射后针尖很容易被血液堵塞，因此建议每次使用后用酒精和生理盐水清洗。

缝合切口，然后分散缝合线上方的伤口粉末。
将老鼠转移到他们的家笼子里 s并让他们恢复一周。

情境恐惧条件反射
1. AAV注射后三周，处理老鼠 30 分钟为了三连续的天.
2. 将大鼠放入调理室 (25 × 25 × 25 cm) 持续 300 秒，对足部施加冲击 (0.50毫安, 2 s) 在 120 s、180 s 和 240 s，然后将老鼠转移到它的家笼子里。
3. 两周后，用强力霉素饮食（100 毫克/千克）喂养大鼠一天，以便为活动依赖性细胞标记留出时间窗口。
4. 一天后，将大鼠放入调理室 300 秒到标签具有 SaCas9 的 IL 消光集成细胞。将老鼠转移到它的家笼子里, 并立即撤回强力霉素饮食。
5. 一周后，将大鼠放入调理室 300 s，监测其恐惧消退连续三天.

注意：在引入下一只老鼠之前用乙醇清洁腔室。冻结被定义为一动不动并表示为总会话时间的百分比。

执行标准组织学免疫荧光 (Koffman and Du, 2020) 在脑组织上验证 SaCas9 在情境恐惧条件反射后的表达（图 3）。

图 3. 情境恐惧条件反射后 SaCas9 在 IL 中的表达。

A. 行为测试方案。B. 免疫荧光显示一部分杏仁核投射 IL 神经元 (GFP + )也染了与活动 - 和创-依赖的 SaCas9。比例尺，100 微米。

数据分析

履行免疫荧光每次实验后验证病毒感染情况，将不适当病毒感染的动物排除在分析之外。数据表示为平均值 ± SEM，并使用 GraphPad Prism 进行分析。使用双尾学生t检验对两个实验组进行统计分析以及不同时间点的两组比较使用双向方差分析 (方差分析），P < 0.05 为统计显着.

电阻食谱

用于 293T 和 F98 细胞的完全培养基
1. FBS，在制备培养基前在 50°C 下加热灭活 30 分钟。
2. 通过添加 1% 体积的青霉素-链霉素和 10% 体积的 FBS 到 DMEM。
3. 过滤除菌, 在 4°C 下最多可保存 1 月.

致谢

该协议用于获得一种部分的数据发表于《科学进展》（Sun等人，2020 年；DOI：10.1126/sciadv.aay6687）。这项工作得到了国家自然科学基金 (81974166、31872774、31371119、91732107、81571067 和 81821092) 的资助), 科技部国家基础研究（973）计划中国科技 (2014CB548200 和 2015CB554503), 教育部“111”工程（B07001）, 北京市自然科学基金（5182013），和北京大学交叉医学种子基金（BMU2018MX011）。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

伦理

所有实验程序均符合北京大学医学部动物护理与使用委员会.

参考

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