材料和试剂

1. 0.22-μm 孔径聚醚砜膜（默克，目录号：S2GPU11RE）

2. 1 毫升、26 号、1/2 英寸注射器（TERUMO CORPORATION，型号：SS-01T2613S）

3. 35 毫米无涂层塑料盘塑料盘（IWAKI，型号：1000-035）

4. 60 毫米无涂层塑料盘塑料盘（IWAKI，型号：1010-060）

5. ≥ 8 周龄雌性小鼠

6. ≥ 12 周龄雄性小鼠

7. 酸性 Tyrode 溶液（默克，目录号：T1788）

8. AlbuMAX ^TMI 富含脂质的 BSA（Thermo Fisher Scientific，目录号：11020021）

9. CaCl ₂·2H ₂O（默克，目录号：C7902）

10. 胶原酶（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：038-22361）

11. 马绒毛膜促性腺激素 (eCG) (ASKA Animal Health)

12. FHM 培养基（默克，目录号：MR-024-D）

13. 葡萄糖（默克，目录号：G6152）

14. 戊二醛溶液 20%（w/v）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：072-02262）

15. Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific，目录号：H1399）

16. 人绒毛膜促性腺激素 (hCG) (ASKA Animal Health)

17. IV-S型透明质酸酶（默克，目录号：H4272）

18. KCl（默克，目录号：P5405）

19. KH ₂PO ₄（默克，目录号：P5655）

20. MgSO ₄·7H ₂O（默克，目录号：63138）

21. 矿物油（默克，目录号：M8410）

22. NaCl（默克，目录号：S5886）

23. NaHCO ₃（默克，目录号：S5761）

24. 青霉素-链霉素（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：168-23191）

25. 酚红 0.04%（w/v）（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：163-20623）

26. 丙酮酸钠（默克，目录号：P4562）

27. 无菌水，无内毒素（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation，目录号：196-15645）

28. TYH 培养基（见食谱）

设备

1. #5 镊子（DUMONT，型号：11252-20）

2. 合适的 CO ₂培养箱（ASTEC，型号：SCA-30DR）（用于维持 5% CO ₂气氛）

3. 合适的荧光倒置显微镜（例如，Olympus，型号：IX71）

4. 合适的体视显微镜（例如，Olympus，型号：SZX16）

5. 取蛋口移液器（DRUMMOND，型号：2-040-000），其接头与直径约 150-μm 的火抛光玻璃管（DRUMMOND，型号：2-000-100）和吹嘴（MINATO） MEDICAL CORPORATION，型号：KA239-02），根据知名教科书的说明（例如，Behringer等人，2014）（图 1A）

6. 精细剪刀（Natsume Seisakusho，型号：B12-H）

7. 直刃 Vannas 剪刀（Natsume Seisakusho，型号：MB-54-1）

8. 合适的热板（例如，TOKAI HIT，型号：TPi-SZX2X）（建议在所有实验中使用热板在体视显微镜上保持 37°C 的温度）

软件

1. OriginPro 2020b (LightStone)

程序

A. 卵母细胞的制备

1. 使用1 毫升、26 号、1/2 英寸注射器，每隔 48 小时对 8 周龄以上的适当品系雌性小鼠进行 7.5 IU eCG 和 7.5 IU hCG 的腹腔注射[例如，四只杂交 B6D2F1 雌性小鼠用于实验，当使用野生型小鼠时（大约 150 个卵母细胞排卵）]。

2. 在 hCG 注射后 15-17 小时处死小鼠。

3. 根据信誉良好的教科书的说明，使用细剪刀和 #5 镊子（例如，Behringer等人，2014 年）解剖输卵管。

4. 将输卵管转移到覆盖矿物油的 35 毫米塑料盘中。

5. 新排卵的卵母细胞被卵丘细胞 [卵丘-卵母细胞复合体 (COC)] 包围，位于输卵管壶腹中。

6. 将一根输卵管放在 60 毫米塑料盘中的 50 微升 TYH 培养基中，放在一滴矿物油覆盖的旁边（图 1B 和 1C）。

7. 使用 #5 镊子抓住输卵管，并使用辅助镊子在靠近卵母细胞所在位置的输卵管中产生撕裂（图 1C）。

图 1. 配子融合试验前的准备工作。

A. 处理鸡蛋的嘴吸管的图像。B. TYH 滴剂的制备。TYH 培养基在制作 TYH 滴剂后浇上矿物油。C. 配子的制备。卵母细胞制备和精子制备分别显示在顶行和底行。这些图片分别对应于副标题 A 和 C。比例尺：1 毫米。

B. 去除透明带（图 2）

配子融合试验广泛用于评估膜融合的建立，大多数研究采用 Hoechst 33342 预加载方法。在融合精子可视化之前，在 ZP 去除过程中请小心。

1. 酸性泰罗德溶液法

a. 将 COC 的离合器释放到 50 微升 TYH 培养基中，在 60 毫米塑料盘中加入 0.33 毫克/毫升透明质酸酶（图 1C）。

b. 允许一些 COC 在 50 微升含有 0.33 毫克/毫升透明质酸酶的 TYH 培养基中在 37°C 下在 5% CO ₂空气中孵育，直到完全去除卵丘细胞（在 5 分钟内）。

c. 使用卵子处理口移液器（图 1A）移入和移出来清洗无卵丘卵母细胞，然后将卵母细胞转移到新鲜的 50 微升 TYH 培养基中（重复洗涤至少 3 次）。

d. 将无卵丘的卵母细胞转移到在 60 毫米塑料盘中制备的 50 微升矿物油覆盖的酸性 Tyrode 溶液中。

e. 为了去除残留培养基，将卵母细胞转移到第二个 50 微升的酸性 Tyrode 溶液中。

f. 反复吸取卵母细胞，直到 ZP 在立体显微镜下溶解 [它应该在 30 秒内发生; 否则，卵母细胞的存活率会显着下降（死卵母细胞会破裂）]。

g. 将无 ZP 的卵母细胞转移到新的 50 微升 TYH 培养基中，将其清洗至少 3 次，以去除残留的酸性 Tyrode 溶液。

h. 将不含 ZP 的卵母细胞在 50 微升 TYH 培养基中于 37°C 和 5% CO ₂空气中孵育 1 小时以上，以恢复表面蛋白。

2. 胶原酶法

a. 将 COC 的离合器释放到 50 微升 TYH 培养基中，在 60 毫米塑料盘中加入 1 毫克/毫升胶原酶。

b. 在空气中5% CO ₂下，在 37°C 下孵育 30 分钟。

c. 用处理鸡蛋的嘴吸管小心地拿起无 ZP 的卵母细胞。

d. 将无 ZP 的卵母细胞转移到新的 50 微升 TYH 培养基中，将其清洗至少 3 次。

e. 将无 ZP 的卵母细胞保持在 TYH 培养基中，温度为 37°C ，空气中含有 5% CO ₂直至使用。

图 2. 酸性 Tyrode 溶液和胶原酶处理的无 ZP 卵母细胞之间的比较。

A. 场发射扫描电子显微镜 (FE-SEM) 成像的无 ZP 卵母细胞的高分辨率超微结构。两种方法获得的卵母细胞的表面结构没有差异。黄色和红色框对应于每个放大的图像。比例尺：15 μm（顶部）；10微米（中）；5 微米（底部）。B. 用抗小鼠 ZP2 的单克隆抗体 (IE-3) 观察溶解的 ZP 的表面残留物，ZP2 是 ZP 的主要成分。两种方法制备的无 ZP 卵母细胞用 2 μg/ml IE-3 染色。随后，使用 5 μg/ml Alexa Fluor 647 标记的山羊 α-大鼠 IgG (H+L) 抗体检测抗体。图像是用共聚焦显微镜拍摄的。当使用酸性 Tyrode's 溶液方法时，在卵母细胞表面仍然发现溶解的 ZP 的残余物，而当使用胶原酶方法时，它们检测不到。比例尺：100 μm。

C. 成熟精子的收集

1. 从的≥12周龄雄性小鼠解剖附睾尾适当应变，用细剪刀和＃5镊子，按照从有信誉的教科书的指令（例如，贝灵格等人，2014）（例如，一个混合B6D2F1 雄性小鼠，用于使用野生型小鼠的实验）。

2. 将附睾尾转移到矿物油覆盖的 35 毫米塑料盘中。

3. 将附睾放在 60 毫米塑料盘中的 200 微升 TYH 培养基中，并用矿物油覆盖（图 1C）。

4. 使用 #5 镊子抓住附睾尾，并用直刀片 Vannas 剪刀在输精管的粗导管近端切开，在那里存储活动精子（图 1C）。

5. 从切割端挤出精子后，将一大群精子粘在辅助钳的尖端（图 1C）。

6. 将大量精子引入 200 μl TYH 培养基中（图 1C）。

7. 孵育1小时后，观察分散良好的精子，检查精子活力，计算精子浓度。

8. 在空气中5% CO ₂下，在 37°C 的 TYH 培养基中再培养精子 1 小时，以在受精前诱导获能和自发的顶体反应。

D. 融合精子的可视化

1. 按照副标题 B 中的描述制备无 ZP 的卵母细胞。

2. 将无 ZP 的卵母细胞引入 50 微升 1 微克/毫升 Hoechst 33342 [替代试剂是 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (Kaji等人, 2000)] TYH 培养基 (每个点最多 50 个卵母细胞）在一个 60 毫米的塑料盘中，并在 5% CO ₂空气中在 37°C 下静置 10 分钟。

3. 将卵母细胞转移到另一滴用矿物油覆盖的新鲜 50 μl TYH 培养基中。

4. 在空气中5% CO ₂下，在 37°C 下孵育染料加载的卵母细胞 15 分钟，以释放任何多余的染料。

5. 再重复第 3 步和第 4 步三次，并对卵母细胞进行配子融合试验。

6. 按副标题 C 所述培养精子以诱导获能。

7. 将染料负载的卵母细胞与 2 × 10 ⁵精子/ml 在 100 微升 TYH 培养基中孵育30 分钟，在 37°C 下，在空气中的5% CO ₂下。

8. 将精子结合的卵子转移到 50 微升含有 0.25% 戊二醛的 FHM 培养基中进行缓慢固定 [在此阶段可以省略固定以进行实时成像 (Satouh等人, 2012)]。

9. 在室温下静置 5 分钟。

10. 将受精卵转移到新鲜的 FHM 培养基中 3 次，无需移液进出。

11. 在荧光显微镜下观察（20× 或 40× 物镜，405 nm 激发光）。该程序仅通过在膜融合后将染料转移到精子中来对融合精子的细胞核进行染色，而无法检测到非融合精子。减数分裂中期 II 期间的染色体外观呈簇状（图 3）。

12. 手动改变倒置显微镜的几个焦点，并计算每个卵母细胞融合精子的数量。

图 3. 荧光染料转移法配子融合分析示例：Dcst1/2破坏的精子无法与卵母细胞融合。

融合的精子用预装在卵母细胞上的 Hoechst 33342 染色。箭头和圆圈分别显示融合的精子和减数分裂中期 II 染色体。一些Dcst1/2 ^+/-精子成功地与卵母细胞融合，而Dcst1/2 ^-/-精子与卵母细胞的融合从未发生。比例尺：100 μm。

数据分析秒

使用合适的荧光倒置显微镜（例如，Olympus IX71）捕获图像并使用内置软件对其进行分析。在显微镜下对融合的精子进行计数后，使用OriginPro 2020b (LightStone)进行统计分析。

食谱

1. TYH培养基

6.976 克/升氯化钠

0.356 克/升氯化钾

0.162 克/升 KH ₂PO ₄

1.0 克/升葡萄糖

0.056 g/L 丙酮酸钠

0.252 g/L CaCl ₂·2H ₂O

0.294 g/L MgSO ₄·7H ₂O

2.106 克/升碳酸氢钠₃

4 g/L AlbuMAX ^TMI 富含脂质的 BSA

10毫升/升青霉素-链霉素

15 ml/L 酚红 0.04% (w/v)

用无菌、无内毒素的水调节至 1 L

通过 0.22-μm 孔径聚醚砜膜过滤后，将 TYH 介质分配到适当体积的聚苯乙烯锥形管中，并储存在 -20°C 直至使用。使用前用CO ₂平衡 TYH 培养基。

致谢

实验程序基于 Inoue等人最初描述的论文。(2021) (DOI: 10.7554/eLife.66313)。这项工作得到了 JSPS KAKENHI 资助号 JP18H02453 和群马大学分子和细胞调节研究所的联合研究计划 (19014) 的支持。

利益争夺

作者声明没有经济上的竞争利益。

伦理

所有动物研究均经日本福岛医科大学动物护理和使用委员会批准（批准号：2020017），并在福岛医科大学的指导方针和规定下进行。

参考问题

1. Aydin, H.、Sultana, A.、Li, S.、Thavalingam, A. 和 Lee, JE（2016 年）。人类精子IZUMO1和卵子JUNO受精复合物的分子结构。自然534（7608）：562-565。

2. Behringer, R.、Gertsenstein, M.、Nagy, KV 和 Nagy, A.（2014 年）。操纵小鼠胚胎：实验室手册。（第 4 版）。纽约冷泉港实验室出版社。

3. Bianchi, E.、Doe, B.、Goulding, D. 和 Wright, GJ（2014 年）。Juno 是卵子 Izumo 受体，是哺乳动物受精所必需的。自然508(7497)：483-487。

4. Bianchi, E. 和 Wright, GJ（2020 年）。发现并融合：精卵识别中未解之谜。 PLoS 生物学18(11)：e3000953。

5. Barbaux, S.、Ialy-Radio, C.、Chalbi, M.、Dybal, E.、Homps-Legrand, M.、Do Cruzeiro, M. 和 Vaiman, D. (2020)。精子 SPACA6 蛋白是哺乳动物精子-卵子粘附/融合所必需的。科学报告10(1): 5335。

6. Fujihara, Y., Lu, Y., Noda, T., Oji, A., Larasati, T., Kojima-Kita, K., Yu, Z., Matzuk, RM, Matzuk, MM 和 Ikawa, M. ( 2020）。缺乏受精影响膜蛋白 (FIMP) 的精子无法与小鼠的卵母细胞融合。 Proc Natl Acad Sci USA 117(17): 9393-9400。

7. Inoue, N.、Ikawa, M.、Isotani, A. 和 Okabe, M. (2005)。精子与卵子融合需要免疫球蛋白超家族蛋白 Izumo。自然434（7030）：234-238。

8. Inoue, N. 和 Okabe, M. (2008)。哺乳动物的精子-卵子融合试验。方法 Mol Biol 475：335-345。

9. Inoue, N., Hamada, D., Kamikubo, H., Hirata, K., Kataoka, M., Yamamoto, M., Ikawa, M., Okabe, M. 和 Hagihara, Y. (2013)。IZUMO1 的分子解剖，IZUMO1 是精卵融合必不可少的精子蛋白。发展140(15)：3221-3229。

10. Inoue, N.、Hagihara, Y.、Wright, D.、Suzuki, T. 和 Wada, I.（2015 年）。卵母细胞触发的精子 IZUMO1 二聚化促进小鼠精卵融合。国家通讯社6：8858。

11. Inoue, N.、Hagihara, Y. 和 Wada, I. (2021)。配子融合需要进化上保守的精子因子 DCST1 和 DCST2。Elife 10：e66313。

12. Kaji, K., Oda, S., Shikano, T., Ohnuki, T., Uematsu, Y., Sakagami, J., Tada, N., Miyazaki, S. 和 Kudo, A. (2000)。Cd9 缺陷小鼠的卵子中的配子融合过程存在缺陷。 Nat Genet 24（3）：279-282。

13. Lorenzetti, D.、Poirier, C.、Zhao, M.、Overbeek, PA、Harrison, W. 和 Bishop, CE（2014 年）。小鼠 17 号染色体上的转基因插入使可能参与精卵融合的新型免疫球蛋白超家族基因失活。 哺乳动物基因组25(3-4)：141-148。

14. Lamas-Toranzo, I., Hamze, JG, Bianchi, E., Fernández-Fuertes, B., Pérez-Cerezales, S., Laguna-Barraza, R., Fernández-González, R., Lonergan, P., Gutiérrez -Adán, A. 和 Wright, GJ（2020 年）。TMEM95 是哺乳动物受精所必需的精子膜蛋白。 Elife 9：e53913。

15. Le Naour, F.、Rubinstein, E.、Jasmin, C.、Prenant, M. 和 Boucheix, C. (2000)。严重降低 CD9 缺陷小鼠的雌性生育能力。科学287（5451）：319-321。

16. Miyado, K., Yamada, G., Yamada, S., Hasuwa, H., Nakamura, Y., Ryu, F., Suzuki, K., Kosai, K., Inoue, K., Ogura, A., Okabe, M. 和 Mekada, E. (2000)。受精需要卵细胞质膜上的 CD9。科学287（5451）：321-324。

17. 野田，T.，路，Y.，藤原，Y.，大浦，S.，小谷野，T.，小林，S.，Matzuk，MM和伊川中，M 。(2020)。精子蛋白 SOF1、TMEM95 和 SPACA6 是小鼠精卵融合所必需的。Proc Natl Acad Sci USA 117(21): 11493-11502。

18. Ohto, U.、Ishida, H.、Krayukhina, E.、Uchiyama, S.、Inoue, N. 和 Shimizu, T.（2016 年）。IZUMO1-JUNO 的结构揭示了哺乳动物受精过程中的精子-卵母细胞识别。自然534（7608）：566-569。

19. Satouh, Y.、Inoue, N.、Ikawa, M. 和 Okabe, M. (2012)。小鼠精卵融合时刻的可视化和 IZUMO1 的动态定位。J Cell Sci 125（第 21 篇）：4985-4990。

20. Yamagata, K.、Nakanishi, T.、Ikawa, M.、Yamaguchi, R.、Moss, SB 和 Okabe, M. (2002)。来自钙镁蛋白缺陷小鼠的精子具有与卵细胞质膜结合和融合的正常能力。开发生物学250(2)：348-357。

21. Yamatoya, K.、Ito, C.、Araki, M.、Furuse, R. 和 Toshimori, K. (2011)。用于去除未受精卵中的透明带的一步胶原酶法：用于大规模制备的简单而温和的方法。 Reprod Med Biol 10(2): 97-103。