材料和试剂

注意：除非另有说明，所有材料和试剂均应在无 DNase 和 RNase 的环境中制备。

1. 移液器吸头：10 µl、20 µl、200 µl、1,000 µl 微量吸头（Axygen ^®，目录号：TF-300-RS、TF-20-RS、TF-200-RS、TF-1000-RS）

2. Eppendorf 管（Axygen ^®，目录号：MCT-150-C）

3. 35 mm × 10 mm 碟（康宁，目录号：CLS430165）

4. 24 孔板（Corning，目录号：3524）

5. 多聚甲醛（PFA；Sigma-Aldrich，目录号：P6148-1kg）

6. DPBS（Gibco，目录号：14190144）

7. Tween-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416-100ML）

8. Invitrogen UltraPure ^TMSSC，20 ×（Thermo Fisher Scientific，目录号：15557044）

9. 酵母 RNA（Sigma-Aldrich，目录号：10109223001）

10. 肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3149-500ku）

11. RiboLock RNase Inhibitor（Thermo Fisher Scientific，目录号：Eo0382）

12. ScriptMAX Thermo T7 转录套件（Toyobo，目录号：TYB-TSK-101）

13. 甲醇（例如., Sensi Chemical）

14. 甲酰胺（例如., Sensi Chemical）

15. 蛋白酶 K 溶液（Invitrogen，目录号：AM2548）

16. 戊二醛（国药集团，目录号：30092436）

17. DIG RNA 标记混合物（Sigma-Aldrich，目录号：11277073910）

18. 抗地高辛AP抗体（Roche ，目录号：11093274910）

19. NBT/BCIP 原液（Sigma-Aldrich，目录号：11681451001）

20. 甘油（Sigma-Aldrich ，目录号：G9012-100 ml）

21. QIAquick Gel提取试剂盒（QIAGEN ，目录号：28704）

22. MEGAclear ^TM套件（Ambion ，目录号：AM1908）

23. DNase I（无RNase）（New England Biolabs，目录号：M0303S）

24. 30% H ₂O ₂(w/w) in H ₂O （Sigma-Aldrich ，目录号：H1009-100ML）

25. UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0（Invitrogen，目录号：15575020）

26. 白蛋白，牛血清，分数 V，结晶（Sigma-Aldrich，目录号：9048-46-8）

27. NaCl （Sigma-Aldrich ，目录号：S5886-1KG）

28. Tris 碱（Sigma-Aldrich ，目录号：TRIS-RO）

29. 氯化镁（MgCl ₂；1.00 M ± 0.01 M；Sigma-Aldrich，目录号：M1028-100ML）

30. KOD FX neo （Toyobo ，目录号：KFX-201）

31. UltraPure ^TMDNase/RNase-Free 蒸馏水（Invitrogen，目录号：10977015）

32. 4% PFA（见配方）

33. PTW 缓冲液（见配方）

34. 20 mg/ml 酵母 RNA（见配方）

35. 50 mg/ml 肝素（见食谱）

36. 杂交溶液（见配方）

37. 10× TBST 库存（见食谱）

38. 阻塞缓冲区（见食谱）

39. NTMT 缓冲液（见配方）

40. 4% PFA/0.1% 戊二醛（见配方）

41. 6% H ₂O ₂/PTW 溶液（见配方）

设备

1. 热循环仪（Applied Biosystems，型号：9700）

2. 带盖的薄壁 PCR 管（Axygen ^®，目录号：PCR-02-LC）

3. NanoDrop 2000 (Thermal Scientific)

4. 杂交培养箱（SciGene，型号：2000）

5. 奥林巴斯 SZX10/16 显微镜

程序

注意：除非另有说明，否则所有步骤都应在无 DNase 和 RNase 的环境中执行。

A. 样本/胚胎的收集

1. 用 DPBS 在 35 毫米培养皿或 24 孔板中小心地收集组织样本/小鼠胚胎（图 1）（Downs 和 Davies，1993 年；Piliszek等人，2011 年；Pereira等人，2011 年）。

图 1. 在 E6.5、E7.0 和 E7.5 阶段收集的未染色小鼠原肠的代表性图像。

图像是用 Olympus SZX10/16 显微镜采集的。比例尺：100μ米。

2. 在 4 °C 下过夜固定 4% PFA（见食谱）中的胚胎。

3. 在室温 (RT) 下将胚胎转移到分级系列的甲醇中 (25% 甲醇/DPBS;50% 甲醇/DPBS;75% 甲醇/DPBS;100% 甲醇)。胚胎在每种条件下脱水 5 分钟。应施加足够的体积以完全淹没胚胎样品。

注意：在使用前准备分级系列的甲醇缓冲液。

暂停点：脱水的胚胎可以在 -20°C 的 100% 甲醇中储存长达 1 周。

B. 地高辛标记的 RNA 探针的制备

1. 目标cDNA序列克隆的引物设计：

为了在体外直接转录 PCR 产物，应在引物的 5' 末端添加一个最小的 T7 启动子序列 (5-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3)。探针序列长度为250-1500个碱基；600-900 个碱基的探针表现出最高的灵敏度和特异性。

2. 探针DNA的PCR扩增和纯化：

具有高度富集的目标转录本的 cDNA 库被用作 PCR 模板，用于扩增探针 DNA。推荐使用具有高保真特性的 DNA 聚合酶，例如 KOD FX Neo。应根据所选探针调整确切的 PCR 条件。琼脂糖凝胶分离后，精确切除目标 DNA 片段并按照制造商的说明进行凝胶提取（图 2）。使用 NanoDrop 2000 确定获得的 DNA 的浓度。

注意：对于质粒的体外转录，应使用适当的限制酶消化将质粒线性化，并使用商业试剂盒进行纯化。

图 2.通过 PCR 扩增的特定探针 DNA（此处为Tal1基因）。

为了确定 PCR 特异性，PCR 产物需要进行琼脂糖凝胶电泳。可以观察、切除和纯化特定的 DNA 带以供进一步使用。

3. DIG 探针的转录：

a. 准备以下反应体系：

成分	对于 1 µg DNA
脱氧核糖核酸	1微克
10×转录缓冲液	3微升
DIG-核苷酸混合物	2微升
RiboLock RNase 抑制剂	1 微升
T7 RNA聚合酶	2微升
水	至 30 微升
全部的	30 微升

b. 在热循环仪中在 37°C 下孵育反应 3 小时，盖子温度不高于 55°C。

c. 要去除模板 DNA，直接将 0.5 µl DNase I 添加到反应混合物中并充分混合，然后将混合物在 37°C 下孵育 15 分钟。

d. 按照制造商的说明使用 MEGAclear ^TMKit纯化获得的 RNA 转录物，或执行苯酚：氯仿提取，然后手动进行酒精沉淀。RNA 探针可以直接溶解在无核酸酶的水中。

C. 样品再水化、抗原修复和透化

1. 在分级甲醇/PTW 缓冲液（参见配方）（PTW 中的 75%、50% 和 25% 甲醇）中对胚胎进行再水化，每个浓度为 2-4 分钟，使胚胎在变化之间沉降到底部。用 PTW 清洗胚胎 10 分钟两次。

注意：在使用前准备分级系列的甲醇缓冲液。

2. 在 RT 的6% H ₂O ₂/PTW 溶液中孵育胚胎10 分钟，然后用 PTW 缓冲液清洗两次。

3. 在 PTW 缓冲液中稀释蛋白酶 K，使反应混合物中的蛋白酶 K 终浓度为 10 µg/ml。彻底去除 PTW 缓冲液，并在室温下在 10 µg/ml 蛋白酶 K 反应混合物中孵育胚胎。不同胚胎阶段的反应持续时间不同。具体来说，对于从 E7.0 到 E9.0 的胚胎，适当的反应持续时间应为 7-20 分钟，但对于更高级的胚胎，应预先测试更长的时间。强烈建议进行条件优化的预实验。

4. 小心取出蛋白酶 K 缓冲液并用 PTW 缓冲液冲洗两次。

5. 在 4% PFA/0.1% 中对消化的胚胎进行后修复戊二醛固定组合（见食谱）。在 RT 中孵化胚胎 20-30 分钟。

6. 取出固定缓冲液，用 PTW 缓冲液仔细清洗两次。

D. RNA探针与胚胎的杂交

1. 用68°C加热的杂交液洗涤胚胎两次；添加杂交溶液（参见配方）并让胚胎平衡直到它们沉入底部。

2. 在 65-72°C 下孵育 2-6 小时。最佳温度因不同的 RNA 探针而异。通常，68°C 杂交温度适用于我们测试过的大多数探针。

3. 取出杂交溶液并用在杂交溶液 (200-500 ng/ ml ) 中稀释的探针代替。在相应的温度下孵化胚胎过夜。

4. 重新收集探针。杂交溶液中的探针可重复使用 6-8 次。重新收集的探针可以在 -20°C 下储存长达两个月。

5. 用在 70°C 加热 30 分钟的杂交缓冲液洗涤胚胎 3 次。

6. 用 50% 杂交缓冲液/50% TBST 缓冲液在 70°C 下洗涤胚胎 20 分钟。

7. 在 RT 的摇臂平台上用 TBST 缓冲液（参见食谱）清洗胚胎 3 次。

E. 抗体孵育和地高辛检测

1. 准备封闭缓冲液（参见食谱）并在室温下与胚胎一起孵育 2-3 小时。

2. 在封闭缓冲液中用 1:2,000 稀释的抗地高辛 AP 抗体制备抗体孵育反应溶液。在摇杆平台上于 4°C 孵育过夜。

3. 弃去抗体溶液，用 TBST 缓冲液清洗胚胎 30 分钟 3 次。如果需要，用延长的隔夜洗涤时间洗涤胚胎以减少背景信号。

4. 用新鲜制作的 NTMT 缓冲液清洗胚胎两次（参见食谱）。

5. 丢弃 NTMT 缓冲液并用 NBT/BCIP 溶液（NTMT 缓冲液中的 1:50）孵育胚胎。

6. 在 NBT/BCIP 溶液孵育的前两个小时内经常观察信号。

注意：如果溶液变成红色，请刷新 NBT/BCIP 溶液。

7. 通过在 TBST 中冲洗胚胎大约 3 次来停止反应，直到出现明显的信号。

8. 将胚胎固定在 4% PFA 缓冲液中过夜。

9. 将胚胎转移到 50% 甘油/PBS 中，并记录胚胎样本的代表性图像（图 3）。

10. 固定后的胚胎可以在 4 °C下储存一年以上。

SHAPE \* MERGEFORMAT

图 3. Wholemount 小鼠早期胚胎Tal1基因原位杂交结果的代表性图像。

图像列表胚胎E7.0和E7.5阶段，从其中TAL1开始在胚外中胚层细胞中表达，通过在E7.0三角形所指示的，并且在E7.5峰值。两个胚胎都用相同的探针针对Tal1转录物染色。图像是使用 Olympus SZX10/16 显微镜拍摄的。比例尺：500 μm。

食谱

1. 4% 煤灰

4 克多聚甲醛在 100 毫升 DPBS 中，彻底溶解。

使用 1 M NaOH 溶液将 pH 值调节至 7.4-7.6，并在 4 °C 下储存长达一周。

注意：注意避免直接接触 PFA 粉末和溶液。

2. PTW 缓冲区

不含钙和镁的 DPBS，含 0.1% Tween-20。

在室温下最多可存放 1 周。

注意：注意避免直接接触 Tween-20 溶液，以免对皮肤造成潜在伤害。

3. 20 毫克/毫升酵母 RNA

将 20 mg 酵母 RNA 溶解在 1 ml 无核酸酶水中并充分混合。

在-20 °C 下储存长达 1 个月。

4. 50 毫克/毫升肝素

将 50 mg 肝素溶解在 1 ml 无核酸酶水中并充分混合。

在-20 °C 下储存长达 1 个月。

5. 杂交方案

在-20 °C 下储存长达 1 个月。

组件（库存浓度） 最终浓度 要添加的音量

甲酰胺 50% 25毫升

SSC（20×，用柠檬酸调节 pH 5.3）1.3× SSC 3.25 ml

EDTA（0.5 M，pH 8.0） 5毫米 0.5毫升

酵母 RNA（在 H ₂O 中为20 mg/ml ） 50 微克/毫升 125 微升

吐温 20 0.002 100 微升

肝素（50 mg/ml 的 H ₂O） 100 微克/毫升 100 微升

UltraPure ^TMDNase/RNase-Free 蒸馏水补充至 50 毫升

全部的 50毫升

6. 10× TBST 库存

在 4 °C 下储存长达 1 个月。

成分 大量的

氯化钠 4 克

氯化钾 0.1 克

1 M Tris-HCl pH 7.5 12.5 毫升

吐温 20 5.5 克

H ₂O 补充至 50 毫升

全部的 50毫升

7. 阻塞缓冲区

1 毫克/毫升 BSA 在 1× TBST 中

在 4 °C 下最多可储存1 周

8. NTMT缓冲区

使用前准备；在室温下最多可存放 2 天。

成分（库存浓度） 终浓度加入体积

2.5 M 氯化钠 0.1M 1毫升

2 M Tris-HCl (pH 9.5) 0.1M 1.25 毫升

1 M 氯化镁₂ 0.05 米 1.25 毫升

吐温 20 1% 0.25 毫升

H ₂O ~21.25 毫升

全部的 25毫升

9. 4% PFA/0.1% 戊二醛

在新鲜制备的 4% PFA 中稀释 25% 戊二醛至最终浓度为 0.1%。使用前准备好。

注意：注意避免直接接触 PFA 和戊二醛溶液。

10. 6% H ₂O ₂/PTW 溶液

在新制备的 PTW 缓冲液中稀释 30% H ₂O ₂库存缓冲液至最终浓度为 6%。使用前准备好。

注意：注意避免与 H ₂O ₂溶液直接物理接触。

致谢

这项工作得到了中国国家重点基础研究发展计划（2018YFA0800100、2019YFA0801402、2018YFA0108000、2018YFA0107200、2017YFA0102700）、国家自然科学基金战略研究计划（X0104000000）和国家战略研究计划（X010040002700）和国家战略研究计划（X0104002700）的部分支持。中国科学基金（31900454）。该协议改编自 Zhu, Q., Song, L., Peng, G., Sun, N., Chen, J., Zhang, T., Sheng, N., Tang, W., Qian, C.,乔，Y.，等。(2014)。转录因子 Pou3f1 通过激活神经谱系基因和抑制外部信号通路促进神经命运承诺。Elife 3：e02224。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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2. Hauptmann, G. 和 Gerster, T. (1994)。与脊椎动物和果蝇胚胎的双色整体原位杂交。趋势基因10(8): 266。

3. Nieto, MA、Patel, K. 和 Wilkinson, DG (1996)。在：细胞生物学方法。卷。51. Bronner-Fraser, M.（主编）。219-235，学术出版社。

4. Peng, G., Suo, S., Chen, J., Chen, W., Liu, C., Yu, F., Wang, R., Chen, S., Sun, N., Cui, G.,等。(2016)。用于中原肠小鼠胚胎谱系命运和细胞身份分子注释的空间转录组。开发单元36(6)：681-697。

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