材料和试剂

1. 无菌 50 ml 离心管（Corning，目录号：430829）

2. 40 μm 细胞过滤器（Falcon，目录号：352340）

3. 无菌 100 × 20 mm 细胞培养皿（Corning，目录号：430167）

4. 0.22 μm 过滤器（Millipo，目录号：GNWP02500）

5. 8 周龄健康昆明 (KM) 小鼠

6. DMEM 基本型（1×）（Gibco，目录号：C11995500BT）

7. 胎牛血清（FBS）（ExCellBio，目录号：FSD500）

8. 胶原酶 IV（Biosharp，目录号：C-5138）

9. NaCl（广州化学试剂厂，目录号：7647-14-5）

10. KCl（广州化学试剂厂，目录号：7447-40-7）

11. Na ₂HPO ₄·12H ₂O（广州化学试剂厂，目录号：7558-79-4）

12. KH ₂PO ₄（广州化学试剂厂，目录号：7778-77-0）

13. 青霉素 G 钾盐（MDBio，目录号：W627099）

14. 硫酸链霉素（钻石，目录号：G821BA0034

15. 100%乙醇（国药集团，目录号：64-17-5）

16. 氯化硝基四唑蓝（NTB）（Sigma-Aldrich，目录号：N6876-50G）

17. DHEA（Sigma-Aldrich，目录号：252805-10MG）

18. DMSO（Sigma-Aldrich，目录号： D2650-100ML）

19. β-NAD（Sigma-Aldrich，目录号：N1511-250MG）

20. I ^125-睾酮 Coat-A-Count RIA 试剂盒（北京北方生物技术研究所，目录号：201202）

21. 促黄体激素（Sigma-Aldrich，目录号：869003）

22. HSD3B抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-515120）

23. StAR抗体（CST，目录号：D1Z2A）

24. SF-1抗体（CST，目录号：D10H12）

25. 山羊抗-兔IgG H＆L（Alexa氟^®488）（Abcam公司，目录号：ab150077）

26. 山羊抗小鼠IgG H＆L（Alexa氟^®647）（Abcam公司，目录号：ab150115）

27. 用于免疫染色的一抗和二抗稀释剂（Yeasen，目录号：36323ES60）

28. 多聚甲醛（上海凌峰，目录号：30525-89-4）

29. 1× PBS（见食谱）

30. D-PBS（见食谱）

31. 青霉素/链霉素溶液（见食谱）

32. 0.75 mM KCl 低渗缓冲液（见配方）

33. 75% 乙醇（见配方）

34. 10 mg/ml 胶原酶 IV 溶液（见配方）

35. HSD3B 染色溶液（见配方）

36. 完全培养基（见食谱）

37. 4% 多聚甲醛溶液（见配方）

38. StAR 抗体稀释溶液（见配方）

39. HSD3B 抗体稀释溶液（见配方）

40. SF-1 抗体稀释溶液（见配方）

设备

1. 手术器械：

剪刀（玉燕仪器，目录号：Y15103）

4×镊子（玉燕仪器，目录号：Y15201）

尖头钳（Fine Science Tools，目录号：11252-00）

2. 低速离心机（Zonkia，型号：SC-3610 ）

3. 生物安全柜（Heal Force，型号：HFsafe-I200LC）

4. 水浴壶（景红，型号：XMTD-8222）

5. 细胞培养箱（Thermo Fisher，型号：371）

6. 全自动高压灭菌器（STIK，型号：MJ-78A）

7. 倒置显微镜（尼康，型号：TS100）

8. 电子分析天平（Sartorius，型号：BSA124S-CW）

9. 伽马放射免疫测定计数器（安徽科大中科，型号：GC -1200γ）

10. 血细胞计数器（Marienfeld，目录号：0650030）

程序

本手稿中描述的协议在图 1中进行了总结。

图 1. 协议工作流程。

示意图总结了协议的主要步骤。

有关 Leydig 细胞分离的过程，请参见视频 1。

视频 1. 睾丸分离、清洗和脱囊。

1. 在干燥器中使用 CO ₂处死 10 只 8 周大的健康昆明 (KM) 小鼠（Leary，2013 年）。等到呼吸停止，将小鼠在 75% 酒精中浸泡 10 分钟以对其进行消毒，然后将它们放在手术台上（图 2A）。

2. 拉起下腹部皮肤，用无菌手术剪水平剪开，用无菌手术剪定位并取出睾丸。镊子，和将它们转移到含有 30 ml 预冷 PBS 的 50 ml 管中。

3. 将睾丸移至生物安全柜，将睾丸和PBS倒入空的干净细胞培养皿中，四个培养皿中分别加入20ml PBS（含1×青霉素/链霉素溶液），冲洗睾丸四次（图） 2B)。

4. 使用镊子将睾丸一个一个夹在一个空的细胞盘上，并用另一个尖头镊子刺破睾丸。挤出内容物并将其放入含有 20 ml PBS 的新细胞培养皿中（图 2C）。最后，将所有样品收集到装有 10 ml 胶原酶 IV (1 mg/ml) 溶液的 50 ml 管中。

5. 将试管置于摇晃的水浴中，在 37°C 下消化 7 分钟。

6. 向管中加入 20 ml 完全培养基，以在室温下终止消化（图 2D）。

7. 让内容物静置 5 分钟，直到生精索沉入离心管底部。

8. 将上清液转移到新的 50 ml 离心管中，用 40 μm 细胞滤网过滤，250 × g离心10 分钟。

9. 离心后，弃去上清液，加入 2 ml 完全培养基，将细胞重悬于管中。

10. 将细胞悬液均匀地接种到两个含有 5 ml 完全培养基的 100 mm 培养皿中。

11. 在 5% CO ₂培养箱中在 37°C 下孵育菜肴1 小时（图 2E）。

12. 一小时后，去除非贴壁细胞，向培养皿中加入 6 ml 新鲜完全培养基，继续培养 24 小时（图 2F）。

13. 24小时后弃去原培养基，用4ml KCl低渗溶液处理细胞5分钟，进一步去除肌样细胞，PBS洗3次。

14. 每道菜添加 6 ml 新鲜完全培养基，并继续培养 48 小时（图 2G）。

15. 培养 48 小时后，收获 Leydig 细胞以进行进一步实验。

16. HSD3B酶染色以鉴定 Leydig 细胞的纯度（图 2H）。使用一个执行总细胞计数血细胞计数器. 从十只小鼠中可以获得大约 200 万个细胞。收获大约 20,000 个细胞，将它们重悬在 PBS 中，涂抹在载玻片上，然后晾干。加入50-100 μl HSD3B酶染液覆盖细胞，37°C避光孵育30分钟。丢弃染色溶液并用 PBS 清洗载玻片两次。使用TS100 倒置显微镜捕获图像，并使用 ImageJ 进行分析。

17. 将完全培养基（含 1ng/ml LH）加入 Leydig 细胞，继续培养 48 小时，从第 15 步开始。然后收集上清液，用 I ^125-睾酮涂层 A-Count RIA 试剂盒通过放射免疫测定法测量睾酮(RIA) (图 2I) 根据制造商的协议。

18. 对 Leydig 细胞标记 StAR、HSD3B 和 SF-1 进行免疫染色（图 2J-2L）。将细胞在 4% 多聚甲醛溶液中固定 10 分钟，用 PBS 清洗细胞 3 次，在 0.5% Triton-X 中透化细胞 10 分钟，然后在室温下使用 5% BSA 封闭非特异性粘附位点 1 小时。稀释抗体稀释溶液中的一抗和二抗。将细胞与一抗溶液（如 StAR、HSD3B 和 SF-1）在 4°C 下孵育过夜。用 PBS 洗涤 3 次，然后用二抗在室温下孵育细胞 1 小时。用 PBS 洗涤 3 次，用 DAPI 染色细胞核。使用 LSM710 共聚焦显微镜 (蔡司) 捕获图像。

图 2. 小鼠原代 Leydig 细胞的分离和鉴定。

A. KM 小鼠被处死并在 75% 酒精中消毒。B. 睾丸取自处死的小鼠。C. 去除白膜的睾丸。D. 胶原酶 IV 消化后的睾丸。E. 细胞粘附 1 小时（比例尺：100 μm）。F. 细胞粘附 24 小时（比例尺：100 μm）。G. 细胞粘附 72 小时（比例尺：100 μm）。H. 针对 HSD3B 酶（紫色）染色的分离细胞（比例尺：100 μm）。I. 细胞上清液的睾酮水平含有 1 ng/ml LH (LH) 和不含 LH（对照）。J. Leydig 细胞标记物 StAR 的免疫染色（比例尺：20 μm）。K. Leydig 细胞标记物 HSD3B 的免疫染色（比例尺：10 μm）。L. Leydig 细胞标记物 SF-1 的免疫染色（比例尺：20 μm）。

数据分析

1. 每张载玻片检查五个随机显微镜视野。HSD3B 酶染色的阳性率是通过 ImageJ 使用分析粒子功能计算的。设置 1,000 作为最小粒径。

2. 只有阳性率超过 85% 的分离细胞才能用于进一步的实验。

食谱

1. 1 × PBS (pH = 7.4)

8 克氯化钠

0.2 克氯化钾

3.63 克 Na ₂HPO ₄·12H ₂O

0.24 克 KH ₂PO ₄

添加 1 L ddH ₂O

121度消毒℃ 30 分钟。

2. D-PBS (pH = 7.4)

8 克氯化钠

0.2 克氯化钾

1.15 克 Na ₂HPO ₄·12H ₂O

0.2 克 KH ₂PO ₄

添加 1 L ddH ₂O

3. 青霉素/链霉素溶液（10×）

3.1 克青霉素 G 钾盐

5克硫酸链霉素

50 毫升 1× PBS（pH = 7.4）

通过 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌。

4. 0.75 mM KCl 低渗缓冲液

14 克氯化钾

添加 250 毫升 ddH ₂O

5. 75% 酒精

750 毫升 100% 乙醇

250 毫升 ddH ₂O

6. 10 毫克/毫升胶原酶 IV 溶液

100 毫克胶原酶 IV

10 毫升 1× PBS（pH = 7.4）

7. HSD3B染色液

a. 解决方案一：

1 毫克 NTB

0.6 毫克 DHEA

0.6 毫升二甲基亚砜

b. 解决方案B：

10 毫克 β-NAD

9.5 毫升 D-PBS

将 0.30 ml 溶液 A 加入 4.75 ml 溶液 B 中并充分混合。

8. 完全培养基

10% 胎牛血清

90% DMEM 基础 (1×)

9. 4%多聚甲醛溶液

4.0 克多聚甲醛

添加 100 ml 1×PBS

10. StAR抗体稀释液

5 μl StAR 抗体

添加 5 ml 一抗和二抗稀释剂用于免疫染色

11. HSD3B抗体稀释液

5 μl HSD3B 抗体

添加 5 ml 一抗和二抗稀释剂用于免疫染色

12. SF-1抗体稀释液

5 μl SF-1 抗体

添加 5 ml 一抗和二抗稀释剂用于免疫染色

致谢

这项工作得到了国家自然科学基金（81871150、31801235、82071634）、广东省自然科学基金（2018A030313473）和广州市科技计划项目（2015080200216104A）的支持201803010044、201704YG066、2020A1515011203）。该协议改编自以前的工作（Yang等人，2020）。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益。

参考

1. Artyukhin, AA 和 Zaraiskii, EI (2007)。一种培养 Leydig 细胞的新方法及其在男科学中的实际应用前景。Bull Exp Biol Med 143(1): 155-159。

2. Conn, PM、Tsuruhara, T.、Dufau, M. 和 Catt, KJ (1977)。通过密度梯度离心分离高度纯化的 Leydig 细胞。内分泌学101（2）：639-642。

3. Engeli, RT、Fürstenberger, C.、Kratschmar, DV 和 Odermatt, A.（2018 年）。目前可用的鼠 Leydig 细胞系可用于研究类固醇生成的早期步骤，但不能用于研究睾酮合成。太阳系4(2)：e00527。

4. Gale, JS, Wakefield, JS 和福特, HC (1982)。通过密度梯度离心分离大鼠 Leydig 细胞。J Endocrinol 92(2): 293-302。

5. Jiang, MH, Cai, B., Tuo, Y., Wang, J., Zang, ZJ, Tu, X., Gao, Y., Su, Z., Li, W., Li, G., et al . (2014)。将巢蛋白阳性干 Leydig 细胞表征为治疗睾丸 Leydig 细胞功能障碍的潜在来源。细胞研究24(12)：1466-1485。

6. Leary, S. (2013)。AVMA 动物安乐死指南。2013 年版。阿拉斯加大学锚地。

7. Sun, J., Xi, YB, Zhang, ZD, Shen, P., Li, HY, Yin, MZ, Li, WY 和 Shi, CR (2009)。Leydig 细胞移植可恢复手术阉割的青春期前大鼠的雄激素生成。

8. Yang, Y., Zhou, C., Zhang, T., Li, Q., Mei, J., Liang, J., Li, Z., Li, H.,向Q., Zhang, Q.,等。(2020)。使用定义的小分子将成纤维细胞转化为功能性 leydig 样细胞。干细胞报告15(2):408-423。