实验类型：在这个协议中，我们通过选择材料和处理来对步骤进行分层。TPP 可以在现场进行寄生虫或寄生虫裂解物，并通过在 10 个温度范围内熔化样品（“温度范围”）或超过 10 个在单一温度下熔化的化合物浓度范围（“浓度范围”）。这些变化产生了程序中描述的四种排列，如(B) 裂解物温度范围实验，(C) 寄生虫温度范围实验，(D) 裂解液浓度范围实验和（E）寄生虫浓度范围实验。每个实验有优点也有缺点（Franken等人，2015 年；Dai等人，2019 年；Mateus等人，2020b）。为了例如，使用活细胞的实验更具生理性，但结合了直接和间接影响。裂解物实验可以更直接地识别配体-蛋白质相互作用，但细胞丢失划分也可能导致非生理相互作用。浓度范围实验产生更多信息丰富的热剖面，但如果热挑战可能会错过真正的相互作用温度不理想（太低或太高），蛋白质组的整体覆盖率降低由于全局变性。

治疗条件：我们对细胞外寄生虫进行了热分析实验，以避免添加宿主蛋白质组的复杂性和化合物渗透性和宿主的混杂效应代谢。通常对细胞内寄生虫进行复合治疗；然而用于热分析实验的适当化合物浓度应通过以下方式确定使用细胞外寄生虫进行检测。热分析实验应模拟测定条件，如尽可能接近。考虑因素包括化合物到达所需的时间扩散和结合平衡，发生平衡的缓冲液，以及平衡温度（例如，室温与 37°C）。哺乳动物研究经常进行孵化在 PBS 中（Reinhard等人，2015 年；Savitski等人，2014 年；Franken等人，2015 年）。我们使用了缓冲区组成类似于宿主细胞质的离子组成（Herneisen等人，2020 年；Harding等人，2020）。缓冲液应不含血清，这会淹没可通过 MS 量化的寄生虫信号。我们的目标是每个参考样品处理 25 µg 蛋白质，根据我们的经验，这相当于来自1×10 7 I型RH菌株的细胞外寄生虫的材料。我们主题浓度范围样品到至少两个不同的热挑战温度；我们发现 54°C 和 58°C 可以工作同时仍然提供足够的蛋白质组覆盖范围。热挑战温度可能需要针对每个实验进行优化；数据分析部分提供了进一步的评论。

裂解条件

最终裂解缓冲液组合物应包含 0.5-1% IGEPAL CA-630（也称为 NP-40），其在溶解膜蛋白而不重新溶解聚集蛋白之间提供平衡（莱因哈德等人，2015 年）。对于大多数实验，裂解缓冲液应包含蛋白酶抑制剂（和可选的磷酸酶抑制剂，取决于实验的重点）和 benzonase

在 SP3 净化之前消化核酸。如果认为感兴趣的化合物会影响蛋白酶、磷酸酶或核酸结合活性，则应省略这些补充剂直到分离可溶性蛋白和聚集蛋白之后。我们的裂解缓冲液具有离子

组成类似于 PBS（Herneisen等人，2020 年）和细胞内样缓冲液（Harding等人，2020 年），取决于应用程序。缓冲液的离子组成（例如，ATP 和代谢物的存在）可以显着影响蛋白质的熔解行为（Lim等人，2018 年；Sridharan等人，2019 年）。寄生虫裂解物的浓度也会影响熔解行为；因此，计算裂解前的寄生虫数量，并对寄生虫数量使用一致的裂解缓冲液体积。收获后，寄生虫应至少在洗涤缓冲液中重悬一次裂解缓冲液（但不含去污剂）的成分以稀释细胞培养污染物，例如血清蛋白质。

材料和试剂

1. T12.5 烧瓶（例如，Corning Falcon Tissue Culture Flasks，目录号：29185-298）

2. T175烧瓶（例如，蜂星。®过滤器帽细胞培养烧瓶，目录号：82050-872）

3. 15 厘米培养皿（例如，Corning Falcon ®组织培养皿，目录号：25383-103）

4. Corning ® 150 ml 瓶顶真空过滤器，0.22 µm 孔径 13.6 cm 2 CA 膜（Corning,

目录号：430624）

5. 50 ml锥形管（Corning，目录号：430829）

6.人包皮成纤维细胞（HFF）细胞（ATCC，目录号：SCRC-1041）

7.弓形虫细胞系（RH，例如ATCC 50838 或 PRA-319）

8. T. gondii过滤器（Whatman Pop-Top 和 Swin-Lok 塑料过滤器支架，用于 47 毫米膜

过滤器尺寸，例如VWR 目录号：28163-089，使用 GE Healthcare Whatman Nuclepore

亲水膜 3 或 5 µm 圆，目录号：111112 或 111113）

9. 细胞刮刀（Corning ® Small Cell Scraper，目录号：3010）

10. 蛋白质低结合管（例如，Eppendorf TM LoBind微量离心管，1.5 ml Thermo FisherScientific，目录号：13698794）

11. 8 条 PCR 管（例如，Genesee Scientific，目录号：27.125 U）

12. 厚壁聚碳酸酯开顶超速离心管（0.2 ml，7 × 20 mm；Beckman Coulter，目录号：343775）

13.蛋白质低结合96孔板（Eppendorf，目录号：951032905）

14.注射器20毫升（BD Biosciences，目录号：302830）

15.疏水Sera-Mag Speed Beads（GE Healthcare，目录号：65152105050250，~50mg/ml，保持在 4°C 直至使用）

16.亲水Sera-Mag Speed Beads（GE Healthcare，目录号：45152105050250，~50mg/ml，保持在 4°C 直至使用）

17. DMEM（Thermo Fisher Scientific，目录号：11965118，在使用前保持在4°C）

18. 美国产新生小牛血清，热灭活，无菌过滤，适用于细胞培养（SigmaAldrich，目录号：N4762-500ML，保持在 -80°C 直至使用）

19. 10 mg/ml 庆大霉素（Life Technologies，目录号：15710072，室温）

20. 200 mM L-谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：25030081，保持在-20°C直至使用）

21. 250 U/µl benzonase（Sigma Aldrich，目录号：E1014-25KU，-20°C 储存）

22. 100× Halt Protease Inhibitor Cocktail（Life Technologies，目录号：87786）

23. IGEPAL ® CA-630粘稠液体（Sigma Aldrich公司，目录号：I3021-50ML）

24. 适用于组织培养的 10× PBS（例如，VWR，目录号：45001-130）

25. DC蛋白质测定（Bio-Rad，目录号：5000116）

26. 三（2-羧乙基）膦（TCEP；Pierce，目录号：20490；保持在 -20°C 直至使用）

27.甲硫代磺酸甲酯（MMTS；Thermo Fisher Scientific，目录号：23011，保留4°C)

28. 乙醇，Pure 200proof，HPLC/分光光度级（Sigma-Aldrich，目录号：459828-1L)

29.测序级胰蛋白酶（例如，Promega，目录号：V5113，保持在-80°C直至使用）

30. 三乙基碳酸氢铵缓冲液 1.0 M，pH 8.5（Sigma-Aldrich，目录号：T7408-

100ML，保持在4°C）

31. Pierce Quantitative Fluorometric Peptide Assay（Thermo Fisher Scientific，目录号：

23290，在使用前保持在 4°C）

32. TMT10plex Isobaric Label Reagent Set（Thermo Fisher Scientific，目录号：90110，保留-20°C 直至使用）

33. 50% 羟胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：90115）

34. Pierce 高 pH 分馏试剂盒（Thermo Fisher Scientific，目录号：84868，保持在 4°C直到使用）

35. 超高效液相色谱 (UPLC)-MS 乙腈 (Thermo Fisher科学的，目录号：A9561）

36. UHPLC-MS 水（Thermo Fisher Scientific，目录号：W81）

37. Pierce 甲酸，LC-MS 级（Thermo Fisher Scientific，目录号：28905）

38. DMEM + 3% CFS（见食谱）

39. PBS（见食谱）

40. 10% IGEPAL CA-630（也称为 NP-40）（见配方）

41. 10× CETSA 缓冲液（见配方）

42. CETSA 洗涤缓冲液（见配方）

43. CETSA 裂解缓冲液（见配方）

44. 1 M TCEP 库存溶液（见配方）

45. 200 mM MMTS 原液（见配方）

46. 缓冲液 A（见食谱）

47. 缓冲液 B（见食谱）

设备

1. CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific Forma Steri-Cycle 370，目录号：370）

2. 临床台式离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5810R，目录号：022625101)

3. 微量离心机（Eppendorf，型号：Centrifuge 5424R [已停产]，替代品包括离心机 5425/5425 R)

4.微型离心机（VWR Galaxy Mini Centrifuge，目录号：37000-700）

5.血细胞计数器（VWR Counting Chamber，目录号：1517O-173）

6. 热循环仪（Bio-Rad C1000 Touch TM Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction模块目录号：1851148 和带有 96-Deep 的Bio-Rad C1000 Touch TM热循环仪井反应模块，目录号：1851197）

7. 台式超速离心机（Beckman Ultra MAX [已停产]，替代品包括 OptimaMAX-XP 和 Optima MAX-TL)

8.热混合器（Eppendorf，型号：ThermoMixer C，目录号：5382000023，1.5mlSmartBlock，目录号：5360000038）

9.磁性支架（Invitrogen Dynamag 2，目录号：12321D）

10. 真空离心机（Savant TM

通用 SpeedVac TM真空系统，目录号：SPD111V 和，目录号：UV5450）

11.冻干机（Labconco FreeZone Triad Freeze Dryer，目录号：794001030）

12. Orbitrap 质谱仪（Thermo Fisher Scientific Q Exactive HFX [已停产] 或Exploris 480，目录号：BRE725533），带有可选的 FAIMS Pro 接口（Thermo Fisher科学，目录号：FMS02-10001）

13. MS 耦合 LC 系统（Thermo Fisher Scientific EASY-nLC 1200，目录号：LC140）使用 Acclaim PepMap 100 75 µm × 2 µm nanoViper 捕集柱（Thermo Fisher Scientific，目录号：164946）和 PepMap RSLC C18 3 µm，100A，75 µm × 15 cm 分析柱（Thermo Fisher Scientific目录号：ES900）

14. Pierce 甲酸，LC-MS 级（Life Technologies，目录号：28905）

15. UPLC-MS 乙腈（Thermo Fisher Scientific，目录号：A9561）

16. UPLC-MS 水（Thermo Fisher Scientific，目录号：W81）

软件

1. Proteome Discoverer，2.4 版（Thermo Fisher Scientific）

2. R，4.0 或更高版本：https : //cran.r-project.org/

3. Tidyverse 包，1.3 版：https ://cran.r-project.org/web/packages/tidyverse/index.html

4. TPP 包，3.12 版：https : //bioconductor.org/packages/TPP/

程序

该协议假设读者熟悉弓形虫寄生虫和宿主细胞繁殖。为了标准评论，见 Roos等人。(1994) 和 Jacot等人。(2020)。

A. 寄生虫收获

1. 用 2 × 10 7 -5 × 10 7 RH 速殖子融合的 HFF 感染 T175 烧瓶或 15 厘米培养皿每个，相当于来自一个完全溶解的 T12.5 烧瓶中的寄生虫，在检测前 40-48 小时。应感染足够的T175 以收获 4 × 10 8寄生虫用于测定。产量可能会有所不同取决于宿主细胞年龄、寄生虫菌株和治疗；根据我们的经验，3-4 个 15 厘米的盘子通常足以达到这个数量的寄生虫。

2. 当寄生虫从单层中完全溶解后，刮掉烧瓶并收集培养基含有细胞外寄生虫。完全裂解的单层含有丰富的细胞外寄生虫和少数剩余的附着宿主细胞。去除宿主细胞碎片将培养基通过 3 µm 过滤器放入每个烧瓶或培养皿中的一个 50 ml 锥形瓶中。

3. 通过在室温下以 1,000 × g离心10 分钟来浓缩寄生虫溶液在带有摆动斗转子的离心机中的温度。丢弃上清液。重新暂停寄生虫沉淀在 1 ml 洗涤缓冲液（不含去污剂、抑制剂酶的裂解缓冲液）中并将寄生虫悬浮液转移到 1.5 ml 蛋白质低结合管中。

4. 按 1:500 稀释寄生虫悬液并使用血细胞计数器计数。

5.在室温下以 1,000 × g离心寄生虫10 分钟。丢弃上清液。

6. 根据所需的处理，进入(B)部分裂解物温度范围实验，(C) 寄生虫温度范围实验，(D) 裂解物浓度范围实验，或（E）寄生虫浓度范围实验。

B. 裂解液温度范围实验

1. 寄生虫裂解

一种。每 2 × 10 7 个寄生虫在 100 µl 裂解缓冲液中重悬寄生虫悬浮液（见裂解背景中的考虑因素）。应收获足够的寄生虫 (4 × 10 8 )至少 1.1 ml 裂解液，少量过量以解决移液错误

下面的步骤。湾允许裂解在冰上进行 15 分钟，偶尔通过移液混合。

2. 复合处理一种。在裂解缓冲液中制备 2 倍所需终浓度的化合物稀释液和含有等量 DMSO（或适当的载体）的载体溶液。等分 550 µl将每种溶液倒入 1.5 ml 蛋白质低结合管中。湾将 550 µl 寄生虫裂解物与 550 µl 2x 化合物或载体溶液混合，然后轻轻移液器混合。该化合物现在处于所需的最终浓度。

C。将 100 µl 含有载体或化合物的寄生虫悬液分装到 10 个标记的 PCR 中对应于预期熔化温度的管（见下文）。

d. 让溶液在室温或 37°C 下平衡至少 5 分钟（参见背景中的治疗注意事项）。

3. 热挑战一种。使用带 PCR 管的微型离心机简要收集管底部的液体适配器。离心大约 3 秒。

湾将 PCR 管以适当的方向放置在热循环仪上，使管与裂解物匹配所需的温度。

注意：应提前启动热循环仪程序，使孔处于加入管子时的温度；精确的顺序取决于温度可以由用户的热循环仪实现的梯度。我们使用了熔化温度分别为 37°C、41°C、43°C、47°C、50°C、53°C、56°C、59°C、63°C 和 67°C穿过 48 孔热循环仪中的两个 PCR 试管。

C。允许变性发生 3 分钟。

d. 快速从热循环仪中取出管子，放在冰上 5 分钟。

e. 使用小型离心机，在管底部短暂收集蒸发的液体PCR管适配器。离心大约 3 秒。

F。继续执行下面描述的步骤，F. 可溶性和聚集蛋白的分离。

C. 寄生虫温度范围实验

1. 复合处理一种。制备 2 倍所需终浓度的化合物溶液和载体溶液用等量的 DMSO（或适当的载体）。等分 550 µl 的每种溶液到 1.5 ml 蛋白质低结合管中。湾将 550 µl 寄生虫悬浮液与 550 µl 2x 化合物或载体溶液混合并轻轻但彻底地移液混合。该化合物现在处于所需的最终专注。

C。将 100 µl 含有载体或化合物的寄生虫悬液分装到 10 个标记的 PCR 中对应于预期熔化温度的管（见下文）。

d. 让化合物在室温或 37°C 下与寄生虫平衡至少 5 分钟（参见背景中的治疗注意事项）。

2. 热挑战一种。使用小型离心机，在管底部短暂收集蒸发的液体PCR管适配器。离心大约 3 秒。湾将 PCR 管以适当的方向放置在热循环仪上，使管与裂解物匹配所需的温度。

注意：应提前启动热循环仪程序，使孔处于加入管子时的温度；精确的顺序取决于温度热循环仪可实现的梯度。我们使用的熔化温度为37°C, 41°C, 43°C, 47°C, 50°C, 53°C, 56°C, 59°C, 63°C, 和 67°C 分为两个 PCR条形管和 48 孔热循环仪。

C。允许变性发生 3 分钟。

d. 快速从热循环仪中取出管子，放在冰上 5 分钟。

3. 寄生虫裂解一种。使用带 PCR 管的微型离心机，简要收集管中蒸发的液体适配器。离心大约 3 秒。湾向每个管中加入 20 µl 6× 裂解缓冲液，轻轻移液器混合（见处理背景中的考虑因素）。让寄生虫在冰上裂解至少 15 分钟。

C。继续执行下面描述的步骤，F. 可溶性和聚集蛋白的分离。

D. 裂解液浓度范围实验

1. 寄生虫裂解一种。每 2 × 10 7 个寄生虫在 100 µl 裂解缓冲液中重悬寄生虫悬浮液（见裂解背景中的考虑因素）。应收获足够的寄生虫 (4 × 10 8 )至少 1.1 ml 裂解液，少量过量以解决移液错误下面的步骤。湾允许裂解在冰上进行 15 分钟，偶尔通过移液混合。

2. 复合处理一种。制备十个浓度的化合物的稀释系列，包括单独的载体，在裂解缓冲液中所需终浓度的 2 倍。等分 110 µl 2x 化合物溶液放入 PCR 管中。

注意：我们建议确保在所有车辆中保持相同的车辆浓度通过将稀释系列制备成含有赋形剂浓度的裂解缓冲液来制备样品等于最高化合物浓度。

湾将 110 µl 寄生虫裂解物分装到含有 2x 化合物溶液的 PCR 管中。

化合物现在处于最终所需浓度，每管中的体积为 220

微升。

C。使用多道移液器轻轻混合裂解液并将一半体积 (110 µl) 转移到

另一组 PCR 管。现在有两组 10 个管，每管 110 µl。

d. 让溶液在室温或 37°C 下平衡至少 5 分钟（参见

背景中的治疗注意事项）。

3. 热挑战

一种。使用带 PCR 管的微型离心机简要收集管底部的液体适配器。离心大约 3 秒。

湾为了诱导热变性，将一组管放在预热至54°C 和预热至 58°C 的深井热循环仪中的另一组管（参见背景中的考虑因素）。

注意：应提前启动热循环仪程序，使孔处于添加管时的温度。

C。允许变性发生 3 分钟。

d. 快速从热循环仪中取出管子，放在冰上 5 分钟。

e. 继续执行下面描述的步骤，F. 可溶性和聚集蛋白的分离。

E. 寄生虫浓度范围实验

1. 复合处理

一种。制备浓度范围为 2 倍的 10 种化合物溶液，包括赋形剂裂解缓冲液中所需的最终浓度。将 110 µl 2x 化合物溶液分装到一个PCR管。

注意：我们建议确保在所有车辆中保持相同的车辆浓度通过将稀释系列制备成含有赋形剂浓度的裂解缓冲液来制备样品等于最高化合物浓度。湾将 110 µl 寄生虫悬液分装到含有 2x 化合物的 PCR 管中解决方案。化合物现在处于最终所需的浓度，每个化合物的体积

管为 220 µl。

C。使用多道移液器轻轻混合寄生虫悬浮液并转移一半体积 (110 µl) 到另一组 PCR 管。现在有两组 10 管，110

µl 复合溶液中的寄生虫。

d. 让化合物在室温或 37°C 下与寄生虫平衡至少 5 分钟（参见背景中的治疗注意事项）。

2. 热挑战

一种。使用带有 PCR 管适配器的微型离心机，简单地收集管中的液体。离心大约 3 秒。

湾为了诱导热变性，将一组管放在预热至54°C 和预热至 58°C 的深井热循环仪中的另一组管（参见背景中的考虑因素）。

注意：应提前启动热循环仪程序，使孔处于添加管时的温度。

C。允许变性发生 3 分钟。

d. 快速从热循环仪中取出管子，放在冰上 5 分钟。

3. 寄生虫裂解

一种。使用带 PCR 管的微型离心机，简要收集管中蒸发的液体适配器。离心大约 3 秒。

湾向每个管中加入 20 µl 6× 裂解缓冲液，轻轻移液器混合（见处理背景中的考虑因素）。让寄生虫在冰上裂解至少 15 分钟。

C。继续执行下面描述的步骤，F. 可溶性和聚集蛋白的分离。

F. 可溶性和聚集蛋白的分离下面，我们描述了用于分离可溶性蛋白质的两种分离方法。为了更多信息，请参见注释 1。

1.超速离心法

一种。将热挑战的裂解物（约 100 µl 的体积）转移到超速离心机中在冰床上预冷的管子。

注意：这些试管的最小体积为 100 µl。使用较低的容量有不平衡的风险离心机转子。

湾将试管装入台式超速离心机（例如，BeckmanUltra MAX) 冷却至 4°C。TLA-100 转子最多可安装 20 个管子，足以满足温度范围实验的两种处理条件或两种挑战温度浓度范围实验。管子必须适当平衡以避免转子和超速离心机损坏。

C。使用超速离心机在 4°C 下以 100,000 × g离心样品20 分钟。到计算合适的转速，使用转子半径规格和在线计算器例如https://www.beckman.com/centrifuges/rotors/calculator。

d. 轻轻取下转子，注意不要打扰管子，并立即转移管冰。如果有条件，请在寒冷的房间里工作。

e. 去除上清液体积约 80% 的顶部并转移到预冷的蛋白质中低结合管。重要的是不要破坏含有聚集蛋白质和膜质部分。

F。继续下一部分，F. 使用 SP3 协议进行蛋白质清理和消化。

2、滤板法

一种。用 100 µl 1× 裂解缓冲液（含有化合物/处理液，如果适用）预先润湿滤板。将滤板放在 96 孔板的顶部。在摆动桶中以 500 × g离心离心 5 分钟，直到溶液通过过滤器进入 96 孔板。丢弃解决方案。湾将滤板放在干净的蛋白质低结合或聚丙烯 96 孔板上。转移

热激发裂解物 (~100 µl) 到平衡的滤板和离心机在 500 ×g在 4°C 下离心 5 分钟以将可溶性蛋白质与聚集体分离。可溶性蛋白通过通过过滤器进入 96 孔板。

C。将可溶性部分从 96 孔板转移到蛋白质低结合管。体积可溶性蛋白质溶液相对于输入体积减少，应进行测量在下一步之前，G. 蛋白质清理和消化。

G. 使用 SP3 协议进行蛋白质净化和消化

1. 量化蛋白质丰度

一种。确定参考样品中的蛋白质浓度（温度范围为 37°C实验和浓度范围实验的最低化合物浓度）使用蛋白质定量测定，例如，DC蛋白质测定（Bio-Rad），根据制造商的说明。稀释溶液应包含感兴趣的化合物或车辆，如果适用，因为它可能会显着改变吸光度读数。大量的在此步骤中确定的蛋白质将用于计算用于检测的 SP3 珠的量样品净化和胰蛋白酶添加消化。我们通常量化 20-60 µg 的可溶性参考样品中的蛋白质。以下步骤假设参考中的产量为 50 µg样本; 相应地调整体积以减少蛋白质含量。湾将与参考样品中 50 µg 蛋白质相对应的体积转移到新的蛋白质低结合管。将相同体积的剩余样品转移至低蛋白也绑定管子。用裂解缓冲液将体积提高到 100 µl。

2. 减少半胱氨酸

一种。向每个样品中加入 0.5 µl 1 M TCEP 溶液。TCEP 的浓度现在是 5 mM。湾将样品在 55°C 下孵育 10 分钟，例如，在加热块或热混合器上。

3. 烷基化半胱氨酸

从 55°C 中取出管子，让它们冷却至室温。添加 7.54 µl 的 200mM MMTS 库存溶液使浓度达到 15 mM。允许反应发生室温下 10 分钟。注意：替代方案中的碘乙酰胺 (IAA) 烷基化黑暗的。我们更喜欢 MMTS 进行溶液内消化，因为它的反应速度快、稳定性好且较低

非特异性烷基化（Müller 和 Winter，2017），这可以增加肽的数量MS 分析后的鉴定。烷化剂的选择将决定搜索对半胱氨酸的修饰，即MMTS 的甲硫基 (+45.988 Da) 或氨基甲酰甲基 (+57.021Da) 为 IAA。

4. 使用 SP3 协议清理样本（Hughes等，2019）。有关更多信息，请参阅注意2.

一种。制备足够的疏水性和亲水性 Sera-Mag 珠，浓度为 50 µg/µl，用于 1:10相对于参考样品的珠子/蛋白质 (wt/wt) 比率。例如，要处理 10样品与 50 µg 参考样品，制备 5 mg 珠子。

一。在 1.5 毫升管中，将 50 微升 50 毫克/毫升疏水珠与 50 微升 50mg/ml 亲水珠。

ii. 将珠子放在磁性架上，让它们分开。使用 P200 移液器

取出并丢弃上清液。

三、在 100 µl MS 级水中清洗珠子。将珠子放在磁性架上，然后

再次丢弃上清液。

四、在 100 µl MS 级水中重悬珠子，最终浓度为 50 µg/µl。

湾向每个样品中加入 10 µl 50 µg/µl 珠子。珠子/蛋白质 (wt/wt) 比率现在至少为

10:1。

C。通过添加 4 倍体积的 100% HPLC 级乙醇将蛋白质结合到珠子上。为了

例如，将 100 µl 样品与 0.5 µl TCEP、7.54 µl MMTS 和10 µl Sera-Mag 磁珠，加入 472 µl 100% 乙醇。注：蛋白质溶液现为80%按体积计乙醇。我们发现这个比例对于弓形虫蛋白的结合是最佳的到 Sera-Mag 珠子。

d. 将试管放入热混合器中，让蛋白质与珠子聚集，然后在 24°C 下以 1,000 rpm 的速度振荡至少 10 分钟。珠子在结合时应该“结块”蛋白质。

e. 将管子放在磁性架上，让珠子分开，这需要大约 30 秒。将上清液丢弃到适合 80% 的废物流中乙醇。

F。用 180 µl 80% 乙醇清洗珠子 3 次，可通过稀释制备HPLC 级乙醇与 HPLC 级水。每次，让珠子磁性与溶液分离 30 秒，并将上清液处理为适当的废物溪流。

注意：在最后的漂洗中，尽可能多地去除乙醇洗涤液，以尽量减少酶消化步骤中的残留物。我们去除几乎所有的液体将珠子以 16,000 × g 离心 30 秒，然后将 P200 和 P10 尖端双重堆叠以去除上清液。

5. 将蛋白质消化成肽

一种。在 50 mM TEAB 中以 1:50 (wt/wt) 蛋白质:胰蛋白酶的比例制备胰蛋白酶消化溶液。

为要处理的样品数量准备足够的储备溶液，例如20 个样品对于具有控制和处理条件的温度范围实验以及 10熔化温度各一个。湾向每个管中加入 35 µl 消化液。用尖端轻轻将珠子移入液体中移液器，但避免移液珠子，因为它们很粘。

C。将试管放入加热至 37°C 的热混合器中，并以 1,000 rpm 的速度摇动过夜（16-18 小时）。

d. 在室温下以16,000 × g离心管1 分钟以沉淀珠子和收集蒸发的液体。

e. 将管子放在磁性架上，让珠子分离 30 秒。转移将含有消化肽的水性上清液转移到新的蛋白质低结合管中。肽被洗脱后，样品可以在液氮中速冻并在冷凝器温度为 -80°C 且腔室压力约为 0 毫巴的冻干机。肽通常在四小时或更短的时间内冻干成粉末。冻干肽可在 -80°C 下保存数月。

H. 串联质量标签标记样品多路复用是使用同量异位质量标签进行的，这些标签可在 10-

plex 和 16-plex 格式（Werner等人，2014 年；Li等人，2020 年）。我们保持TMT 10-的工作库存plex 试剂，浓度为 6.66 µg/µl（每 15 µl 100 µg），在 -80°C 的乙腈中保存 3-6 个月。我们以 2:1 (wt/wt) TMT:peptide 进行标记（Zecha等，2019）。应在标记之前选择 TMT 标记方案。每个温度或浓度用一个 TMT 通道标记。执行两个完整的 10 重标记反应每个实验： 10 熔化温度与载体和化合物的温度范围实验或 10 个化合物浓度在两个温度下熔化以进行浓度-范围实验。我们在顺序标记时观察到报告离子干扰（Brenes等人，2019 年）。因此，推荐使用图 1所示的标记方案。

图 1. 推荐的温度和浓度范围的 TMT 标记策略实验。t 1 /c 1是指实验中的最低温度或浓度。

1. 使用 Pierce 荧光肽测定法量化肽丰度在开始之前，量化参考样品中的肽数量（温度为 37°C范围实验和浓度范围的最低化合物浓度实验）根据制造商的说明使用 Pierce 荧光肽测定法指示。如果肽已被冻干，则重悬在 35 µl 50 mM TEAB pH 8.5 中。1:20稀释通常足以将样品置于标准曲线的范围内，例如0.5 µl样品 + 9.5 µl 水。对于标准的全蛋白质组 TMT 反应，使用 25-50 µg 的肽在 35 µl 50 mM TEAB 中，根据需要稀释样品。使用等量和稀释

非参考样本。以下步骤适用于含有 50 µg 的样品35 µl 中的肽。

2. TMT标记反应

一种。在室温下平衡 TMT 试剂 3 分钟。

注意：记录该批次的试剂批号和同位素校正。此信息可用于在 Proteome Discoverer 中创建自定义定量方法，以纠正用于天然碳同位素产生的同位素杂质。

湾将 TMT 试剂以 13,000 × g离心1 分钟，然后将每个小瓶重新悬浮在 120 µl 的

100% MS 级乙腈。创建 15 µl 等分试样并在 -80°C 下储存长达 6 个月。

注意：如果长时间不使用重新悬浮的 TMT 试剂，请冻干

试剂并以粉末形式储存于 -20°C。

C。将 15 µl TMT 试剂 (100 µg) 添加到参考样品（35 µl 50 mM 中的 50 µg 蛋白质）

茶）。如果使用更多或更少的肽输入，保持最终的体积/体积比

乙腈（TMT 试剂）到水性缓冲液（TEAB 缓冲液）。例如，如果仅标记

在 35 µl TEAB 中加入 25 µg 肽，在 7.5 µl 和 7.5 µl 100% 中加入 50 µg TMT 试剂

乙腈使最终组合物达到 30% vol/vol 乙腈。

d. 将管以 13,000 × g离心30 秒以收集液体。

e. 将管子放入热混合器中，并在室温下以 400 rpm 的速度摇动 60 分钟。

F。每 50 µl 反应加入 3.2 µl 5% 羟胺，淬灭未反应的 TMT 试剂。

将试管放入 ThermoMixer 中，并在室温下以 400 rpm 的速度摇动 15 分钟。

G。将样品混合在 1.5 ml 蛋白质低结合管中。使用相同的移液器吸头

转移以避免因与新表面接触而丢失肽。音量现在应该大约为 530 µl。

H。在液氮中快速冷冻汇集的样品并冻干直至干燥。注：样品体积也可以通过真空离心减少。

一世。干燥样品可在 -80°C 下储存数月。

3. 脱盐分馏

应在 MS 数据采集之前对 TMT 标记的样品进行分级以减少分离MS 分析期间的干扰。我们进行高 pH 反相肽分级分离使用 HPLC（例如，使用 Shimadzu LC-20AD；参见 Herneisen等人，2020）或 Pierce High pH反相肽分馏试剂盒根据制造商的说明，我们已经发现提供了对弓形虫蛋白质组的等效覆盖，并且还可以作为脱盐步骤。我们将样品分成八个部分用于 LC-MS。馏分可以冻干并在 -80°C 下无限期保存。

一、质谱数据采集

数据采集方法高度依赖于设施。至少，TMT 标记的样本应该使用足够的分辨率来分辨报告离子并使用长梯度获得分离复杂的肽混合物并减少共分离干扰。在这里，我们描述

我们的 Exploris 480 轨道阱的数据采集协议与 FAIMS Pro 接口耦合到一个Easy-nLC 1200 系统。

1. 样品重悬和进样

A. 将每个冻干部分重悬在缓冲液 A 中至估计浓度为 0.5-1 µg肽/微升。我们通常将每个样品重新悬浮在 25 µl 中。确保冻干物是完全溶解；它可能有助于彻底清洗管子的侧面并收集

通过以 16,000 × g离心1 分钟来分离液体。

B. 将每个重悬部分转移到自动进样器管中。一旦样本重悬后，应保存在 4°C。

C. 注入 0.5-1 µg 肽用于 MS 分析（通常为 1-2 µl）。属于同一类的样品TMT 标记实验可以顺序注射（即，组份）。我们执行不同 TMT 标记实验之间的空白进样以减少残留。

2. LC 梯度

我们的样品在表 1 中描述的 90 分钟梯度内分离。梯度包括可选的 12 分钟跷跷板用于色谱柱维护。我们的 LC 系统包括一个商业捕获柱（Acclaim PepMap 100 75 µm × 2 µm nanoViper）连接到 15 cm商业分析柱（PepMap RSLC C18 3 µm，100A，75 µm × 15 cm）。

3. MS 采集设置

带有 FAIMS Pro 界面的轨道阱 Exploris 480 的方法参数总结在表2。根据我们的经验，在 -50 和 -65 的补偿电压之间交替产生对弓形虫蛋白质组的最佳报道。ddMS 2分辨率 30,000 已优化对于 TurboTMT 扫描选项（Bekker-Jensen等人，2020 年）；选择不使用此功能的用户设置应选择更高的分辨率。

表二带有 FAIMS Pro 接口的 Orbitrap Exploris 480 的 MS 采集设置

数据分析

A. 使用 Proteome Discoverer 进行蛋白质定量

采集 MS 数据后，使用多种分析管道中的任何一种对 RAW 文件进行处理，以从 MS/MS 扫描和报告离子丰度获得蛋白质定量。本协议描述了使用 Proteome Discoverer 2.4 软件进行的数据处理。替代方案是其他地方有记录（Perez-Riverol等人，2014 年；Franken等人，2015 年）。

1. 通过创建新的研究和分析将数据加载到 Proteome Discoverer 2.4。

一种。选择适合所用仪器的处理和共识工作流程用于数据采集和基于报告离子的定量方法。我们使用常见的Thermo Fisher 为 Q Exactive 为我们的轨道阱平台提供的模板。

湾选择 TMT 10-plex 作为量化方法。我们创建自定义量化方法带有特定批次的更正，但默认的量化方法就足够了。

C。添加 RAW 光谱文件作为分数（如果遵循此处的协议，则每添加 8 个 RAW 文件

实验）。我们分别分析每组分数。例如，车辆温度范围实验的处理将与复合治疗。

2. 调整处理工作流程中的设置以符合实验。我们使用默认Minora Feature Detector、Spectrum Selector 和 Percolator 节点的设置（严格目标 FDR 为 0.01，基于 q 值，宽松的 FDR 为 0.05）。重大调整Sequest 搜索引擎节点包括

一种。输入正确的蛋白质数据库（对于刚地弓形虫RH 菌株，最新版本的GT1 注释的蛋白质 *.fasta，可以在https://toxodb.org/toxo/app/downloads/Current_Release/TgondiiGT1/fasta/data/ )

湾选择所需的动态修改。我们在 M 上使用了氧化 (+15.995 Da)，

S/T/Y 上的磷酸化 (+79.966 Da)，以及 N 末端的乙酰化 (+42.011 Da)蛋白质。包括额外的动态修改会增加搜索空间，但根据蛋白质处理步骤中使用的条件，这可能是常见的做法。

C。选择合适的静态修饰：肽 N 上的 TMT 6-plex (+229.163 Da)

末端和 K，以及 C 上的甲硫基 (+45.988 Da)。注意使用其他烷化剂（例如，IAA）将需要对半胱氨酸进行替代修饰。对于超级困惑SILAC，见注 3。

3. 调整Consensus Workflow中的设置，启用熔解的下游处理

曲线：一种。仅使用独特的肽段进行定量。湾关闭缩放。

C。对于温度范围实验，将 Normalization Mode 设置为 none；重要的是不要按通道标准化丰度，因为蛋白质丰度在全球范围内下降熔化温度。

d. 对于浓度范围实验，可选择将标准化模式设置为无。数据可以在 TPP R 包中标准化（见下一节）。我们也选择了正常化在 Proteome Discoverer 中并放弃 TPP 包中的标准化。

e. 可选择调整共同隔离阈值或平均报告者 S/N 阈值。降低这些阈值可能会增加量化，但会降低数据质量。

4. 分析完成后，将蛋白质水平定量导出为 *.txt 文件。

B. 曲线拟合

曲线拟合是使用 TPP R 包执行的，该包已被广泛记录（Franken等人，2015 年；Childs等人，2019 年；Kurzawa等人，2020 年）。最近，替代热已经提出了蛋白质组分析数据分析包（Dziekan等人，2020 年），并且用户可以开发自己的自义归一化和曲线拟合方法。输出文件来自必须修改 Proteome Discoverer 以匹配 TPP 包的输入格式。

表 S1-S4代表来自 Proteome Discoverer 的示例输出。

表 S5-S9显示流线型表用作 TPP 包的输入，

表 S10是代表输出。

表 S1。温度范围，细胞，从 Proteome Discoverer 2.4 软件复制 1 个输出。

表 S2。温度范围、细胞、Proteome Discoverer 2.4 软件的重复输出 2。

表 S3。温度范围，裂解物，复制 Proteome Discoverer 2.4 软件的 1 个输出。

表 S4。温度范围、裂解物、Proteome Discoverer 2.4 软件的复制 2 输出。

表 S5。温度范围，单元，将 1 个修整输入复制到 TPP R 封装。

表 S6。温度范围，电池，将 2 个修整输入复制到 TPP R 封装。

表 S7。温度范围，裂解物，将 1 个修整输入复制到 TPP R 包。

表 S8。温度范围，裂解物，将 2 个修整输入复制到 TPP R 包。

表 S9。指定实验、条件和重复的示例配置表用于 TPP R 包中的曲线拟合。

表 S10。TPP R 包的示例输出。

C. 预期结果在典型的温度范围实验中，我们检测到 3,000 多种蛋白质，其中约 80% 具有足以进行曲线拟合的量化值。我们的其他蛋白质组学实验鉴定了 4,600-4,800 种蛋白质，表明热分析方法固有的热挑战

减少蛋白质组覆盖。我们在生物副本中进行实验。图 2A揭示复制计算出的蛋白质熔解温度的变异性。为了生成参考数据集，我们对属于弓形虫RH/TIR1 菌株的活寄生虫或裂解物进行热分析并使用 SILAC 对样本进行超融合（Harding等人，2020 年；Herneisen等人，2020 年）；见注 4。使用协议F 部分中描述的过滤板方法分离聚集体。作为对于其他生物体（Jarzab等人，2020 年）观察到，蛋白质组范围内的热稳定性在裂解物比细胞中的多（图 2B）。为了在们的分析中包括热稳定蛋白质，我们计算了曲线下的数值面积 (AUC) 使用梯形规则（图 2C）。相比之下

熔化温度，这需要至少 50% 的热变性，AUC 度量可以是对具有完整热曲线的所有蛋白质进行计算。图 2D显示了两者之间的关系熔化温度和 AUC。这样的参考数据集可用于选择温度范围和热挑战涉及化合物处理的实验的温度。表 3总结了分布来自两组不同实验的寄生虫和裂解物的熔化温度。首先在 37-67°C 的温度范围内实验融化的寄生虫或裂解物并分离可溶性通过超速离心从聚集体中分离蛋白质（Herneisen等，2020）。第二个实验，此处展示的是在 41-73°C 的温度范围内融化的寄生虫或裂解物并分离用滤板聚合。研究人员可以参考与他们最相似的分布预期的工作流程。检测依赖于化合物的热稳定性，浓度范围实验应在略高于目标蛋白质的熔解温度下进行载体处理条件（Franken等人，2015 年）。在蛋白质靶点未知的情况下，我们选择在对应于中位数的两个温度下执行热挑战和熔化分布的四分之三温度。然而，熔化温度往往取决于蜂窝环境。图 2E和F显示了熔解温度和 AUC 值通过基于 MS 的 LOPIT 方法（Barylyuk等，2020）通过亚细胞分配进行分层。一些亚细胞结构，如微管蛋白细胞骨架和蛋白酶体的 20S 亚基，证明特别耐热；检测属于的蛋白质的化合物依赖性热位移这些子结构需要很高的热挑战温度。相比之下，蛋白质细胞核和核仁往往容易沉淀，并使用中值热挑战温度会导致这些亚结构中蛋白质的定量和覆盖率不佳。其他细胞器对细胞制备特别敏感；例如，组件的60S 核糖体在细胞中共熔，但在裂解物中表现出不同的熔解曲线。因此，研究人员应该利用他们对化合物作用机制的观察和预测来选择最合适的热分析参数。

图 2.弓形虫蛋白质组的熔化行为。(A)熔融温度的再现性在完整细胞熔解实验的两个重复中定量的蛋白质的数量。(B)分布在完整细胞和裂解液的复制品中定量的蛋白质的平均熔解温度温度范围实验。(C)曲线下面积 (AUC) 是如何计算的描述使用蛋白质 CDPK1 的梯形规则进行数值积分。(D)之间的关系两个值都可用的蛋白质的平均解链温度和 AUC。点与较浅的灰色阴影不太适合 S 型熔解曲线 (R 2 < 0.8)。(E)分布通过 Barylyuk 的 LOPIT 分配，细胞或(F)裂解物中的平均解链温度和 AUC等。(2020)。

表 3.弓形虫裂解物和完整细胞的熔解温度分布

两组不同的实验

笔记

1. 在热挑战和整体蛋白质变性之后，可溶性蛋白质从未折叠的蛋白质聚集体。最初的 CETSA 协议描述了在微型离心机中的离心以20,000 ×克（贾法里等人。，2014），随后将其升温至100000 ×g下在一个

超速离心机以提高 MS 分析的信噪比（Franken等，2015）。筛选板可用作替代品，具有更高的吞吐量（Mateus等人2018年）和 2020a；Dziekan等人。, 2020)。可溶性蛋白质与蛋白质分离后聚集体，样品可以在液氮中速冻并在 -80°C 下储存次

个月。

2. 使用改良的 SP3 清理和处理含有可溶性蛋白质的溶液

基于 Hughes等人的协议。(2019)，它提供了很好的高捕获和吞吐量

适用于稀释和低丰度 TPP 样品。不推荐蛋白质沉淀，因为

它会导致不均匀的样品损失，从而降低熔解曲线的质量。该协议有

针对弓形虫蛋白质样本进行了优化（Harding等人，2020 年；Herneisen等人，2020 年）和

洗脱时与 TMT 标记兼容。

3. 为了减少 MS 时间和运行间变异性，我们使用了超复杂的 TPP 实验

SILAC，如其他地方所述（Herneisen等，2020）。这种变化需要增长

在 TPP 实验之前，将寄生虫在重质和轻质 SILAC 培养基中进行 3 次传代。寄生虫

在不同培养基中生长的被视为生物副本并以相等的权重组合

在烷基化之前。源自重样品的量化值通过以下方式获得

寻找含有重精氨酸 (+10.008 Da) 和重赖氨酸-TMT6plex 的肽

Proteome Discoverer 中的 (+237.177 Da) 修改。

4. MS 蛋白质组学数据已通过以下方式存入 ProteomeXchange Consortium

PRIDE (Perez-Riverol et al ., 2019) 合作伙伴存储库，数据集标识符为 PXD024912 和

10.6019/PXD024912。

食谱

1. DMEM + 3% CFS（用于常规寄生虫传代）每 500 毫升

5 毫升 200 毫米谷氨酰胺

500 微升 10 毫克/毫升庆大霉素

15 毫升小牛血清

通过瓶顶过滤器将补充的 DMEM 过滤到一个干净的玻璃瓶中

用洗涤剂洗过。

2. PBS

100 ml 10× 组织培养级 PBS

900 毫升去离子水

过滤灭菌并在室温下储存

3. 10% IGEPAL CA-630（也称为 NP-40）（50 毫升）

5 毫升 IGEPAL CA-630

45 毫升去离子水

4°C 保存 6 个月

4. 10× CETSA 缓冲液（1 L）

（50 mM NaCl、1.42 M KCl、10 mM MgCl 2、56 mM 葡萄糖、250 mM HEPES pH 7.2）

2.922 克氯化钠

105.86 克氯化钾

2 克氯化镁2

10.1 克葡萄糖

59.575 克 HEPES

加入去离子水至 1 L 并用 KOH 调节 pH 至 7.2

对溶液进行无菌过滤并在 4°C 下储存

5. CETSA 洗涤缓冲液（1 毫升）

（5 mM NaCl、142 mM KCl、1 mM MgCl 2、5.6 mM 葡萄糖、25 mM HEPES pH 7.2）

100 µl 10× CETSA 缓冲液

900 微升去离子水

6. CETSA 裂解缓冲液 (1 ml)

100 µl 10× CETSA 缓冲液

80 微升 10% IGEPAL CA-360

10 µl Halt 蛋白酶抑制剂

1微升苯甲酸酶

809 µl 去离子水

7. 1 M TCEP 库存解决方案

1 克 TCEP HCl

3.489 毫升去离子水

在 -80°C 下储存为 500 µl 等分试样，在 -20°C 下储存为 20 µl 工作等分试样

8. 200 mM MMTS 库存溶液

200 毫克 MMTS

7.924 毫升异丙醇

在 4°C 下储存为 500 µl 等分试样

9. 缓冲液 A（100 毫升）

（MS 级水中的 0.1% 甲酸）

100 毫升 MS 级水

100 µl >99% 甲酸

超声 10 分钟

10. 缓冲液 B（25 毫升）

（80% 乙腈和 0.1% 甲酸）

20 毫升 MS 级乙腈

25 µl >99% 甲酸

5 毫升 MS 级水

超声 10 分钟

致谢

这项研究得到了 NIH 赠款 (1R01AI144369) 给 SL 和国家ALH 的科学基金会研究生研究奖学金 (174530)。我们感谢 E. Shortt技术援助。这项工作改编自 Herneisen等人的协议。(2020) 和哈丁等。(2020)。

利益争夺

作者声明没有冲突或竞争利益。

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