材料和试剂

1. 1.5 mL Eppendorf管小号（例如，微量离心，目录号：0030120086 ）
2.培养皿，塑料10厘米直径（例如，隼，目录编号：353003）
3.无菌移液器吸头
4.牙签（高压灭菌）
5.干我CE
6.琼脂（例如，Becton Dickinson，目录号：214030）
7. Bacto Peptone（例如，Becton Dickinson，目录号：211677）
8.氯仿3 （酸性p苯酚的制备，例如，赛默飞，目录号：AM9720）
9. DEPC-ddH 2 O（焦碳酸二乙酯-处理过的水，例如，Invitrogen，目录号：750024）
10. EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物，例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：E6635）
11.乙醇（乙醇，例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：459836）
12.甲酰胺（例如，Sigma-Aldrich，目录号：11814320001）
13.葡萄糖（例如，Molekula，目录号：13002238）
14.盐酸（盐酸一个CID，例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：320331）
15.醋酸钠（甲nhydrous小号憎恨乙酸盐，例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：S2889）
16.氢氧化钠（钠氢氧化物小丸，例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：1064980500）
17. SDS（十二烷基硫酸钠，例如，Merck，目录号：13760）
18.三（2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇，例如，Sigma-Aldrich公司，目录号：T1503）
19.酵母ë XTRACT（例如，赛瓦，目录号：24540）
20.酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD）培养基（见配方）
21. 1 M Tris -H Cl 溶液，pH 7.5（参见配方）
22. 0.5 M EDTA 溶液，pH 8.0（见配方）
23. 20% SDS 溶液（见配方）
24. Tris-EDTA-SDS（TES）溶液（见配方）
25. 3 M NaAc 溶液，pH 5.2（见配方）

设备

1.高压釜
2.离心机和台式离心机
3.涡流
4.烧瓶，可高压灭菌
5.孵化器
6. pH计
7.移液器（1 - ml、200 - μl、20 - μl、2 - μl）
8.搅拌棒和小号TIR板，磁性
9.热循环仪

软件

bbmap（BBMap – Bushnell, B.；版本 38.90；sourceforge.net/projects/bbmap）请在参考资料部分包含此参考资料。
Biocmanager ( https://cran.r-project.org/web/packages/BiocManager/vignettes/BiocManager.html ; 版本 3.12; https://bioconductor.org/install/ )
bioconda（Grüning等人，2018 年；http : //bioconda.github.io/user/install.html ）
bowtie2（Langmead 和 Salzberg，2012 年；2.4.2 版；http : //bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml ）
bwa（Burrows-Wheeler Aligner，Li 和 Durbin ，2009 年；0.7.17 版；http: //bio-bwa.sourceforge.net/ ）
DESeq2 （Love等人，2014 年；1.30.1 版，http: //bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html ）
fastqc（安德鲁斯，2010 年）; FastQC：高通量序列数据的质量控制工具；0.11.9 版本；https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)
htseq-count（Anders等人，2014 年；0.11.1 版；https: //htseq.readthedocs.io/en/release_0.11.1/install.html ）
集成基因组学查看器（Robinson等人，2011 年；2.9.2 版；https: //software.broadinstitute.org/software/igv/download ）
R（R 核心团队，2017 年；4.0.4 版；https: //cran.r-project.org/bin/windows/base ）
samtools（Li等人，2009 年；1.11 版；http: //www.htslib.org/download/ ）
tophat（Langmead等人，2009 年；2.1.1 版；https : //ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml ）
修剪（Bolger等人，2014 年；0.40 版；http: //www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic ）

程序

样品制备和 RNA 提取
处理RNA时，这是最重要的是所有的材料和试剂是RN一个本质-免费。此外，必须注意的是，在所述的相对表达值的计算P rocedure d至少需要三个生物replic吃秒。因此，例如，如果一个突变菌株的表达水平进行比较与野生-型菌株，六个RNA样品需要准备（3每个菌株），然后其可用于创建6个RNA - SEQ库.
这里，有效和可靠的方法来提取RNA，尽管所述健壮酵母细胞壁被描述（Collart等人。，2001）：
1.用无菌牙签或移液管尖端，挑的单个菌落的酿酒酵母和接种2 ml的YEPD过夜，在30℃生长的液体培养基。
2.用 50 μl 过夜培养物接种 10 ml 液体 YEPD 。
3.收获的细胞的对数中期（OD 600 〜1.0）通过离心，并转移到一个1.5 -毫升Eppendorf管中。重悬于300微升DEPC-的DDH 2 O，快速自旋在一个台式离心机（高达9500 ×克），除去在干冰上上清液，闪速冷冻，并储存在-80℃。
4.重悬在400细胞沉淀微升TES溶液。添加400微升酸p苯酚的制备（氯仿3 ），帽管，并涡旋剧烈10小号（避免渗漏和处理小心LY ！）。在 65°C 下孵育 60分钟，每 15分钟涡旋一次（Collart 和 Oliviero，2001 年）。
5.在冰上放置 5分钟。旋在一微离心在18 ，000 ×克10在4℃下分钟。传送所述含水顶层到一个干净的试管（避免了白蛋白相）。加入400微升氯仿3和涡大力为10和小号。旋在一微离心在18 ，000 ×克10在4℃下分钟。传送所述含水顶层（小心移液管并避免氯仿到一个干净的试管3层）。
6.添加一个1/10体积3的中号醋酸钠，pH值5.2 ，和2.5体积超微电极乙醇（-20℃）。在- 80°C 下沉淀至少 60分钟。旋在一微离心在18 ，000 ×克10在4℃下分钟。小心取出的上清液和洗涤的通过涡旋在70％的乙醇沉淀（-20℃）。旋在一微离心在18 ，000 ×克10在4℃下分钟。
7.重悬的在100％的甲酰胺沉淀（在4℃）。首先尝试将等量的液体制成颗粒，然后从那里向上移动。大多数 RNA 应立即溶解。为了帮助溶解，在室温下静置 15分钟，每 5分钟移液一次。如果所述样本需要进行非常集中，储存于4℃过夜。
8.确定的由浓度稀释H中1/100 2 ö和测量一吨OD 260/280 （OD 260 1≈40微克/ ml的RNA）。记得添加甲酰胺在1/100稀释到空白。

RNA - seq 文库生成和测序
在样品制备和提交到测序设施之前，强烈建议与受过培训的人员讨论项目的目标。对于成功的文库生成，输入 RNA 浓度至关重要，通常每个样品的浓度范围从 1 μg 到 10 ng。虽然有可能产生RNA -从头序列库（即，生产适配器，缓冲液，聚合酶，等等。，用你自己的材料），强烈建议使用需要最低限度的共同实验室资源和市售的试剂盒，最重要的是，在不熟悉 RNA - seq 文库形成的研究人员手中更可靠。
在 RNA - seq 文库生成过程中，特定平台的接头会连接到提取的 RNA 分子上；吨herefore，所述文库试剂盒必须根据所使用的测序平台选择。在此，所述QuantSeq 3'的mRNA -s当量库Prep试剂盒FWD对于Illumina公司（Lexogen）用于单端的生成（即，50的片段将被从一端仅测序）- bp的读取，足以用于RNA -酵母中的seq表达分析。对于含有较大量的内含子的更复杂的真核基因组，并且当读出较长的需要，考虑配对末端文库试剂盒和测序（即，碎片将从两端进行测序），与sequenc协商后荷兰国际集团设施的工作人员。
1.仔细按照制造商手册中描述的步骤，生成包含测序仪和样品特异性接头的 cDNA 文库。
2.检查生成的文库的质量并测量 cDNA 浓度。
3.对 cDNA 文库进行测序。这里使用了 Illumina HiSeq 4000 测序仪。
4.检查原始读出的数据，典型地在FASTQ格式（供给的质量图URE 1 ）。最常见的检查涉及的数目每样本的读取（应的大小的顺序相同的所有测序样品，这意味着该文件小号在尺寸上应类似），GC含量（应当匹配宿主生物体的总体GC含量) ，以及整体基础质量。存在多种质量控制工具；在这里，使用fastqc（见也Batut ，2021）。强烈建议在每个处理步骤之后进行质量控制，以确保数据的整体完整性。

图 1.在 Illumina 平台上以 FASTQ 格式进行测序的示例。大号INE 1包含的基本读出的信息，线2包含实际序列，和第4行中包含质量分数在Phred33或Phred64每个基地鳕ë 。

原始序列数据的处理
Ç 1 。数据处理的准备
下面的步骤描述在描述的计算工作流设置小号TEP Ç 2 ，以及在所描述的数据分析程序D.此工作流程我们上课在Linux操作系统上（和其衍生物）可用的开放源程序。WH ILE就可以在Mac上处理顺序文件-或Windows - OPERAT编仪器，读者强烈建议使用基于Linux的公用事业由于其广泛的适用性，及时更新，并以社区为基础的故障排除。
对于大多数的处理在步骤中描述小号TEP Ç 2和d ，多个工具存在; 特别是，用于获取基因组组装和基因注释（15），创建的索引文件（16），适配器修整（17），读出的对准（18），和读滤波基于质量（19）。虽然它扩展超出了本手稿描述所有范围的具体工具，以替代在这个协议中使用的程序提出了建议。
此处使用的一些工具可通过所谓的包管理器获得，例如 Bioconda 或 Biocmanager，允许轻松安装最新版本的软件和依赖项；^ h ENCE ，建议遵循此处介绍的安装顺序。

1.通过GIT中安装康达包管理ħ UB和R，bowtie2 ，以及使用该特定信道samtools ，Bioconda。

curl -O https://repo.anaconda.com/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
sh Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
conda install -c bioconda R
conda install -c bioconda bowtie2
conda install -c bioconda samtools

2.从 R 中安装 Biocmanager 和 DESeq2 包。

电阻
if (!requireNamespace(“BiocManager”, quiet = TRUE))
install.packages(“BiocManager”)
BiocManager::install()
BiocManager::install(c(“DESeq2”))

C2 。原始序列读取文件的处理
通过质量检查之后，该序列现在读取经历预处理，并最终，对准到宿主生物体的基因组中。首先，基因组装配，基因注释，和基因组索引需要准备（C2 。1和C2 。2 ）。序列读数包含适配器污染，随机引物序列，和低-质量尾读取，需要被移除（C2 。3的过滤对准读取到宿主生物（基因组之前）C2 。4 ）。最后，读出基于它们的质量得分（过滤C2 。5 ）和索引用于下游分析（C2 。6 ）。

1.下载的酿酒酵母基因组组装和基因注释。在这里，UCSC版本，sacCer3.fa和sacCer3.ensGene.gtf ，分别使用（从下载http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/sacCer3/bigZips/）。除了在UCSC基因组浏览器，其他平台允许的基因组组装和基因注释（下载例如，美国国立卫生研究院/ NCBI或ENSEMBL）。由于每个平台维持一个稍微不同的命名约定，重要的是，基因组组装一个第二基因注释是一个ç quired在加工过程中在同一个平台，以避免程序错误。
2.创建的基于基因组上的组件（“索引文件sacCer3.fa从步骤”）C2 。1 . 在这里，索引输出文件以基本文件名“ sacCer3 ”存储。” 该索引将由步骤C2 中的对齐程序使用。4 ; ħ ENCE，索引步骤必须适于所选择的对准器，以及一个用于BWA例子在下面给出。警告：bwa 不是拼接感知对齐工具。如果剪接事件需要分析期间要考虑的，将被用于创建索引以及对准（步骤等顶帽需要对准C2 。4 ）。

bwa 指数 sacCer3.fa

3.取出随机引物序列，接头污染，低-质量尾巴。在这里，bbmap 用于步骤B1 中描述的库套件，根据制造商的推荐设置（请参阅下面的命令，来自 www.lexogen.com/quantseq-data-analysis）。bb map 是用于 RNA 和 DNA 测序读取的快速、剪接感知全局比对工具。脚本“bbduk.sh”与 polyA-tail 序列 ( polyA.fa.gz ) 和 Illumina 特定的适配器序列信息 ( truseq.fa.gz ) 一起使用，位于安装文件夹bbmap/resources/ 中。
衔接子序列和低-质量读取也可以使用不同的工具，例如“trimmomatic”（见被移除的软件部分）。独立于所使用的软件，参数需要根据所使用的库套件和测序平台进行调整。作为修剪的结果，所述的尺寸输出文件应略小于该的输入文件。

bbmap/bbduk.sh in=sample1.fastq out=sample1_trimmed.fastq ref=bbmap/resources/polyA.fa.gz,bbmap/resources/truseq.fa.gz k=13 ktrim=r forcetrimleft=11 useshortkmers=t mink= 5 qtrim=t trimq=10 minlength=20；完毕

4.创建来自步骤C1的预处理序列读数的比对。1使用的对准工具，如顶帽，bbmap，bowtie2 ，或BWA。这里使用了 bwa。根据序列文件大小（即，所述的读取次数），基因组大小，和CPU使用，此步骤可能需要几分钟到几个小时。在英特尔®吉翁® CPU E5-2699 V3 @ 2.3GHz的，对齐包换花了约3小号每100 ķ读取。
以下命令将输入文件读数 (sample1_trimmed.fastq) 与步骤C2 中的基因组索引对齐。2 (sacCer3) 并将结果写入“sample1_trimmed_aligned.sam” 。”

bwa mem sacCer3.fa sample1_trimmed.fastq > sample1_trimmed_aligned.sam

5.使用 samtools通过MAPQ 过滤根据数据质量过滤数据。这里，所有与平均碱基阅读读取质量分数小于50（即，正确的映射的概率为> 99.999％，图URE 1）我们再从步骤生成的映射读取文件除去C2 。4 . 由于质量过滤，输出文件大小将小于输入文件大小。如果没有，或者很少，读取仍然存在，尝试用更少的严格的质量得分过滤（例如，20）。如果这恢复了读取次数，下游分析仍然是可能的，尽管不太可靠。

samtools 查看 -bq 50 sample1_trimmed_aligned.sam > sample1_trimmed_aligned_mapq50.bam

6.对来自步骤C2的过滤、对齐的读数进行排序。5 ，创造了用samtools索引文件。这将创建一个与输入文件同名的索引文件，包括“.bai .bai”的附加结尾。”
除了在使用工具如fastqc输出文件的质量检查，该短片段可以使用集成的基因组浏览器（IGV）进行可视化。除了确保总体映射的读取是正确的，像IGV工具允许确认的通货膨胀预期基因组突变或基因缺失（存在图URE 2）。

samtools 排序 sample1_trimmed_aligned_mapq50.bam -o sample1_trimmed_aligned_mapq50_sorted.bam
samtools 索引 sample1_trimmed_aligned_mapq50_sorted.bam

图 2. IGV 浏览器可视化的快照。在这里，映射到酵母中 Set2（蓝色，YJL168C）基因组区域的读数（灰色条）在野生型（上泳道）和 ∆Set2 突变体（下泳道）之间进行了比较。

数据分析，表达值的计算，和结果的可视化
）在C制备排序，索引文件包含所有的读取都成功地对齐到宿主基因组（在这里，酿酒酵母），从数十万到数百万一般编号的读取每replic吃。如此庞大的信息量是研究人员进行分析的主要障碍。差异基因表达 (DGE) 分析旨在确定哪些基因（如果有）在测试条件下显示更高或更低的对齐读数。为此，读取属于一个特征（即，一个基因）被求和对每个副本TE，和差异表达值跨越条件下计算的考虑荷兰国际集团之间副本的条件内的方差TE小号; ħ ENCE，对于DGE关键的几个复制品TE相同的条件下的s被认为（通常，N = 3）。基因表达值通常报道为log2倍变化，在与调整对-结合v alues描述的变化（截止值变化，但通常的意义P -v alues <0.05被认为是可靠的）。
的对准的读取次数可之间强烈不同复制品TE原因可能会技术原因（例如，在波动的输入RNA，变化的量在温度的文库扩增过程中热循环仪，或在不同的的流通池通道的结合能力）; ħ ENCE，读取必须跨复制品被归一化TE秒和条件。对于DGE值的计算几个归一化方法存在，例如读取每百万映射转录物的每千碱基读取（FPKM），片段每千碱基的每百万映射转录读取（RPKM），每百万转录读取（TPM），或每计数特征（即，基因）（Dillies等人，2013年）。
在这里，基于大多数基因在不同条件下没有差异表达的假设，使用了 DESeq2 基于计数的归一化；吨herefore ，所述每个功能计数从在步骤生成的各文件中提取C2 。6使用htseq（步骤D1 ），组合，和索引（步骤小号D2和D3 ）。最后，该计数被归一化，和DGE值使用DESeq2（步骤计算小号D4和D5 ）。第r esults使用MA图，其中log倍变化作图的平均表达值可视表示（步骤D5 ）。

1.提取物的使用htseq计数每个样品计数。在此，对齐，过滤，和排序读取（例如，从sample1_trimmed_aligned_mapq50_sorted.bam）步骤C2 。6和我们使用了来自步骤C2)1的基因注释文件 (sacCer3.ensGene.gtf) 。此命令生成s a 。txt文件，其中包含分配给 gtf 文件中注释的每个基因的读取数。

htseq-count -f bam sample1_trimmed_aligned_mapq50_sorted.bam sacCer3.ensGene.gtf > sample1_trimmed_aligned_mapq50_sorted_counts.txt

2.使用R和Dseq2计算基于计数的表达值；Ť他的需要计数在文本文档中被组装的数据（在这里，“counts.txt”），以及在一个索引文件（在这里，“table.txt ，”步骤D3 ）。
生成“counts.txt” -file包含š的计数为每个副本TE以及在步骤生成的参考样品（在此，WT_X）给定样品（这里，MUT_X）的D1为制表符分隔的txt列文件（图 URE 3）。作为质量检查，它建议检查几行（即，基因）的一致性（即，间复制品类似读取计数TE的特定条件或多个）。重要的是，所述读出的计数还没有归一化至读计数的每个样品中的总数量，以及相应的变化被预期。

图3 。制表符分隔格式的 counts.txt 文件示例。第一列表示开放阅读框（ORF）的名称，并在第一行表示野生的名称-型和突变重复。数值矩阵包含映射到每个副本te到相应 ORF的读取数。

3.每个样品产生一个“table.txt” -file ，索引数据的每一列（图URE制表符分隔的格式4）。

图4 。制表符分隔格式的 table.txt 文件示例。复制品TE名称，作为指定在从步骤counts.txt D3 ，通过它们的共同的情况（索引例如，野生型或突变体）。

4.在R，加载Dseq2库，从步骤组合的计数，文件D3 ，并且从步骤表文件D4 。

图书馆（DESeq2）
count_table <- read.delim('counts.txt',sep='\t',header=TRUE,row.names='region_name')
sample_table <- read.delim('table.txt',sep='\t',header=TRUE,row.names='sample_name')

5.写的RNA - SEQ表达和p v使用DESeq2 alues到文件中。该摹enerated 。TXT文件（wt_mutant_p-values.txt ）包含š所述的log 2倍为制表符分隔的格式的各突变体表达和p值，现在可以用于进一步的分析或可视化。对于数据检查，一个Ñ生成MA-图（图URE 5）。在DESeq2生成的 MA 图中，显着的命中用红色表示；因此，第一个质量检查是有多少数据点用黑色着色（即，由于大多数基因没有差异表达，大多数数据点应该用黑色着色）。

dds <- DESeqDataSetFromMatrix（countData = count_table，colData = sample_table，design = ~ 条件）
dds <- DESeq(dds)
res <- 结果（dds）
resOrdered <- res[order(res$padj),]
plot <- plotMA(res, main = 'mutant', ylim = c(-2,2), xlab = 'mean count')
write.table(as.data.frame(resOrdered),sep='\t',quote=FALSE,file='wt_mutant_p-values.txt')

图 5. DESeq2 生成的 MA 曲线分析示例。统计上显着上调或下调的基因分别在 x 轴上方和下方标记为红色。

食谱

1.酵母提取物蛋白胨葡萄糖 (YEPD) 培养基
对于每升YEPD的，高压灭菌20克细菌蛋白胨，10g的混合物ÿ东提取物，和950毫升水2 O.加入50mL 40％（W / V）葡萄糖，混合并在使用前冷却。
对于YEPD平板，添加24克一个GAR高压灭菌前的溶液中。放置在磁力搅拌板上的高压灭菌的溶液中，添加一个搅拌棒和50毫升40％（W / V）葡萄糖，并冷却所述溶液，同时搅拌。倾温暖媒体中，以P ETRI菜，允许冷却，直到固体，并在4℃直至使用存储。
2. 1 M Tris -H Cl 溶液，pH 7.5
将 121.14 g Tris 溶解在 800 ml H 2 O 中。
调整的pH值至7.5，用HCl。
带来的终体积为1升的去离子与ħ 2 ö 。
高压灭菌并在室温下储存。
3. 0.5 M EDTA 溶液，pH 8.0
将 18.6 g EDTA 添加到 80 ml H 2 O（使用 DEPC -处理过的 H 2 O）。
在磁力搅拌器上混合直至溶解。
用 NaOH（~2 克 NaOH 颗粒）将 pH 值调节到 8.0。
分装成等分试样并高压灭菌。
4. 20% SDS 溶液
将 20 g SDS溶解在 90 ml H 2 O 中（使用 DEPC -处理过的 H 2 O）。
加热至 68°C 并用磁力搅拌器混合直至溶解。
5. Tris-EDTA-SDS (TES) 溶液
10 mM Tris -H C l pH 7.5
10 mM EDTA pH 8.0
0.5% SDS
6. 3 M NaAc 溶液，pH 5.2
将 24.6 克醋酸钠添加到 80 毫升 H 2 O 中。
在磁力搅拌器上混合直至溶解。
用冰醋酸将 pH 值调节到 5.2。
带来的体积为100毫升ħ 2 O.

致谢

我想感谢帕维尔Sinitcyn博士，博士阿萨Yeroslaviz ，从下一代测序核心设施和凛镐博士在MPI生物化学的手稿的批判性阅读。
该协议基于 Braberg等人进行的 RNA-seq 表达分析。(2020)。

参考
请确认以黄色突出显示的参考文献。

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