材料和试剂

蒸压皮棉-免费纸巾
60 -毫米的组织培养板小号仪（Eppendorf，目录号：0030701119）
26 G 针（BD PrecisionGlide，BD Medical（S）Pvt Ltd，目录号：302806）
1 - ml注射器（BD Medical（S）Pvt Ltd，目录号：303060）
40 - μm尼龙过滤器（F爱尔康，Ç atalog号：352340）
小鼠骨髓细胞
FACS 管（F alcon ，目录号：352054）
彗星滑梯（CometSlides TM 20 well，Trevigen，目录号：4252-02K-01）
MACS设备
MS 柱（MACS，Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
MACS multistand（MACS，Miltenyi Biotec，目录号：002139）
应用MiniMACS TM小号eparator（MACS，美天旎，目录号：130-042-102）
抗体
APC -共轭升ineage抗体混合物[2：100浓度（BD Pharmingen公司TM ，BD Biosciences公司，目录号：51-9003632）
抗小鼠 c-kit PE [1:100 浓度]（Biolegend，目录号：105807）
抗小鼠 Sca-1 PerCP-Cy5.5 [1:100 浓度]（Biolegend，目录号：122524）
1％一garose（S IGMA -A ldrich ，目录号：A9539）
0.75％升流-熔化琼脂糖（LM琼脂糖）（Sigma-Aldrich公司，目录号：A9414）
70％ë THANOL（常熟宏盛精细化工有限公司，目录号：1170）
SYBR ®金染色溶液（赛默飞世科学，Invitrogen公司，目录编号：S33102）
10 × RBC升ysis b uffer（Biolegend公司，目录号：420301）
裂解缓冲液（见配方）
1× n中性电泳缓冲液（见配方）
DNA沉淀溶液（见配方）
1 × p磷酸盐-缓冲盐水（PBS）（见食谱）

设备

电泳单元（迷你子®细胞GT，Bio-Rad公司，目录号：329BR014542）
落射荧光显微镜（Olympus IX2-ILL100，OLYMPUS CORPORATION，目录号：0M04213）
明场显微镜（Primovert，Ziess，目录号：3842010199）

软件

图像J – Open Comet（Benjamin M. Gyori 和 Gireedhar Venkatachalam，www.cometbio.org）
Excel 2016（微软公司）
GraphPad Prism（GraphPad Software, Inc.，www.graphpad.com）

程序

A.细胞的制备
安乐死一个C57BL6 / J小鼠，解剖出后肢和去除多余的组织从骨头分离的股骨和胫骨。
冲洗骨髓细胞置于50 -毫升聚丙烯管中，使用高压灭菌的1 × PBS和26用1号针-毫升注射器，直到骨骼被清除内部。
混合细胞通过使单细胞悬浮液和应变一个40 - μm尼龙过滤器。在 4°C 下以 600 × g离心5 分钟。
通过加入500裂解红细胞μ升1 × RBC裂解缓冲液（稀释在1 × PBS）以沉淀，并通过加入2毫升1- 2分钟后中和反应× PBS。在 4°C 下以 600 × g离心5 分钟。
重悬在1ml 1细胞沉淀× PBS和计数细胞使用一个ħ emocytometer。
孵育所述细胞与所需的抗体（2 μ升/ 5百万个细胞用于林APC和1 μ升/ 5百万个细胞为的c-Kit PE和的Sca-1 PerCP-Cy5.5的）染色ħ ematopoietic祖细胞（APC林鸡尾酒、c-Kit PE、Sca-1 PerCP-Cy5.5) 30 分钟。
在 4°C 下以 600 × g离心5 分钟。洗用1细胞× PBS，并转移到一个5 -毫升FACS管中用于分选。
排序的纯LSK（谱系-的Sca- 1 +的ckit + ）群体成1 × PBS中，并存储在4℃直至进一步使用。
注意：或者，MACS 排序可用于分离纯度较低的 HSC 祖细胞群。

B.玻片准备
称取 1 g 琼脂糖并使用微波炉溶解在 100 ml 1 × PBS 中。
PLA Ç E中的塑料容器内的彗星载玻片在倾斜ED位置（图1A）。移出 1 ml 琼脂糖并均匀涂抹并在室温下固化 10-15 分钟（图 1B）。
新鲜制备0.75％的低-熔化（LM）琼脂糖使用1 ×在100 PBS -毫升烧杯中。用微波炉溶解。
注意：将熔化的 0.75% LM 琼脂糖转移到储存瓶中以供进一步使用。使用前，在盛有热水的烧杯中重新熔化。
允许热LM琼脂糖到在37℃下冷却至少20分钟。
以 1:10 (v/v) 的比例将 1 × 10 5 个细胞/ml添加到熔化的 LM 琼脂糖中。
注意：如果您取 500 µl 熔融 LM 琼脂糖，则以1 × 10 5细胞/ml 的浓度加入 50 µl 细胞在 1 × PBS（不含Ca 2+和 Mg 2+ ）中。
立即将 50 µl 悬浮液移至彗星载玻片上。使用移液器的尖端将混合物均匀地涂抹在表面区域上并使其凝固（图 1C）。
注意：如果样品混合物在载玻片上分散不均匀，在悬浮细胞前将LM琼脂糖加热至 37°C ，然后重新制备样品混合物。
保持载玻片在4℃下在黑暗中10分钟（例如，发生在一个冰箱）。
注意：井的边缘出现一个清晰的 0.5 毫米环（图 1D）。为了提高样品的粘附于滑动，所述胶凝时间和湿度应该增加。

图1的制备交流OMET滑动。A. 将干净的Trevigen ® CometSlide TM HT 放入塑料容器内。B. 彗星滑梯预先涂有 1%的琼脂糖。这可确保细胞有效地粘附在载玻片上。用琼脂糖预涂后，让凝胶凝固。C. 0.75％琼脂糖LM含有的细胞中加入逐渐的幻灯片。使凝胶在 4°CD 凝固。凝胶凝固后的彗星滑动。

C.裂解和电泳
制备溶胞溶液（见配方）和PLAC Ë在冰上在使用前至少20分钟。
将所需量的预冷裂解液倒入托盘中并浸入载玻片。将托盘放在冰上或 4°C下 1 小时。
从裂解溶液中取出载玻片并排出多余的。
将载玻片放入 50 ml 预冷的 1 ×中性电泳缓冲液（参见配方）中，在 4°C 下洗涤30 分钟。
倾950ml的预冷的1 ×在中性电泳缓冲液，以将彗星试验® ES罐。放置在电泳滑动托盘和盖与所述幻灯片的滑动托盘重叠（图2A）。
设置的电源至21伏，并且执行electrophores是在4℃下1个小时。
对于其它电泳单元，对齐的载玻片从等距离的电极，加1 ×中性电泳缓冲液不超过荷兰国际集团的滑动（图2B）在0.5以上厘米，施加电压30分钟，在1伏每厘米，测量之间的距离的2电泳槽的相对电极（例如，如果距离为 21 cm，则施加 21 V）。
在冷藏室或冰盘上运行电泳装置，冰盘上有足够的冰来部分覆盖装置（图 2C）。

图 2. 中性条件下的电泳。A. 裂解后，将彗星载玻片置于电泳装置中，并在缓冲罐中加入中性电泳缓冲液。B. 中性电泳缓冲液不应超过载玻片上方 0.5 cm。C.在 4°C 下以21 伏电压进行电泳1 小时。

D.载玻片的染色和可视化
排出多余的中性电泳缓冲液，并在室温下将载玻片浸入DNA 沉淀溶液中 30 分钟（参见食谱）。
取出载玻片，在室温下将它们浸入 70% 乙醇中 5 分钟。
允许样品至干燥10-1 5分钟在室温下。
注：干燥样品将允许细胞沉降在单个平面内，MAK荷兰国际集团的可视化，记录，和孔定量吨通货膨胀更容易。样品可以在评分前与干燥剂一起在室温下储存。
将 100 µl 稀释的 SYBR ® Gold添加到每个样品中并孵育30 分钟。
注意：Trevigen 提供专为彗星染色而设计的 CometAssay ® Silver Staining Kit。银染色可以帮助在所述彗星上的任何传输光显微镜可视化和永久染色的样本的长期存储。建议样品的前银染色干燥。
轻轻敲击载玻片以去除多余的 SYBR ® Gold 溶液。允许滑动到在黑暗中在室温下完全干燥。
查看使用荧光显微镜的幻灯片，并获得公正的图片的每一个细胞，可能是visuali ž版。
注意：该方法的效率可以通过细胞与基因毒性应激作为待测试一个阳性对照。这里，从年轻的成年人（8周造血干细胞和祖细胞小号旧）（图3A）用来自老年小鼠细胞相比，（2年小号旧）（图3B）。老年小鼠细胞中彗尾的形成清晰可见。两个小区之间的比较类型的基因组DNA中的头部相对于比例的尾可以用作为一个可靠的孔定量吨的通货膨胀的DNA损伤的程度。

图 3.细胞的染色和可视化。A. 来自幼鼠的 HSC –细胞内的细胞核是完整的，表明没有 DNA 损伤。B.从大的小鼠HSC -在细胞细胞核是不完整的，并且形成头部和彗尾，指示存在DNA损伤。

E.计分和一个细胞的nalysis：
彗星的计分进行中的开放彗星- ImageJ的插件。推出该插件我ÑImageJ的（图4A）。
通过单击“浏览”按钮（图 4B），将您的图像文件输入到“输入文件”选项。
选择将存储输出文件的输出目录，以及应保存在其中的文件的名称（图 4C 和 4D）。

图4.彗星小号CORING使用ImageJ 。A.开放的ImageJ软件并点击插件。选择 OpenComet_src_v1.3.1 并单击 OpenComet 。B.一个对话框将打开，在那里你需要浏览文件的输入和输出目录。C. 选择用于评分输入文件的图像。D. 选择输出目录。

选择默认分析选项并单击 RUN。
该ANALY ž ED输出的数据将出现在Ø本安输出目录。
的输出文件由输出图像和输出电子表格的。查看所有输出图像以进行错误分析和异常值。请注意为每个图像专门给出的数字（图 5A）。
打开电子表格并手动删除异常值数字s 。
从电子表格中获取 Olive moment 和 Tail moment 的值，并使用 GraphPad PRISM 以图形方式表示数据（图 5B）。

图5.结果小号的Ç OMET得分。A. 彗头和彗尾的鉴定。B.包含计算出的彗星参数的Excel 电子表格。

食谱

裂解缓冲液（成分/ 1 ，000毫升）
3.5 M 氯化钠– 146.1 克
100 mM EDTA – 37.2 克
100 mM Trizma 碱– 1.2 克
将成分溶解在 700 ml dH 2 O 中
加入 8 g NaOH 颗粒并使用 HCl 或 NaOH（浓缩）将 pH 值调节至 10 .0
50毫升是需要对每个测定
添加 1% Triton X-100 – 0.5 毫升
10％d imethyl亚砜（DMSO） - 5毫升
1 × Ñ eutral电泳缓冲液
准备 10× Ñ eutral Ë lectrophoresis b uffer：
三b酶（分子量= 121.14。）- 60.57克
钠一cetate（。摩尔重量= 136.08）- 204.12克
溶解在450ml d ħ 2 ö和一个djust的pH值至9.0使用冰醋酸
将体积调节至 500 毫升并过滤除菌。在室温下储存。
在 dH 2 O中将 10 ×原液稀释至 1 ×以制备 1 L工作强度缓冲液并在 4°C 下预冷
DNA沉淀溶液
制备的7.5M的10ml的储备溶液一mmonium一个cetate：NH 4 （。摩尔重量= 77.08）AC = 5.78克
d H 2 O （NH 4 Ac 溶解后）– 10 ml
对于 50 ml DNA 沉淀溶液：
7.5 M NH 4 Ac (mol. wt. = 77.08) – 6.7 ml
95% 乙醇（试剂级）– 43.3 毫升
SYBR ®金染色液
来自 SYBR ® Gold 精矿（10,000 ×在 DMSO 中）
SYBR ® Gold – 1 µl
电泳缓冲液 – 10 ml
4°C避光保存
1 × p磷酸盐-缓冲盐水 (PBS)
制备 10 × PBS 储备液：
氯化钠 – 80 克
氯化钾 – 2 克
Na 2 HPO 4 – 14.4 克
KH 2 PO 4 – 2.4 克
取 800 ml Milli-Q 水，溶解盐，调节 pH 至 7.4 ，定容至 1,000 ml
在 dH 2 O中将 10 ×股票稀释至 1 ×

致谢

这项工作是由威康信托/ DBT印度联盟奖学金支持（IA / I / 15 /502061分之2）从授予SK和校内资金的科学教育和研究特里凡得琅（IISER TVM）的印度理工学院。在我nstitutional动物设施由资金从科学技术部，印度政府的支持（下FIST方案; SR / FST / LS-II /二百一十七分之二千○十八）。IMR是通过支持一个由高级研究奖学金的大学拨款委员会（UGC），印度。该协议取自 Biswas等人的文章。（2020）“所述的骨膜素/整合素AV轴调控对造血的大小干细胞库在胎儿肝脏” ，并从被修改的协议描述中的彗星Trevigen公司测定试剂盒（比斯瓦斯等人，2020）。

利益争夺

作者没有与本研究相关的竞争性财务或非财务利益。

伦理

用于分离 HSC 以进行 DNA 损伤分析 (C57BL/6J-CD45.2) 的动物在 IISER Thiruvananthapuram 的动物设施中饲养和饲养。根据印度政府环境和森林部 (MoEF) 动物实验控制和监督委员会 (CPCSEA) 提供的指导方针饲养动物。在实验中，小鼠保持在隔离笼中，并允许进入到灭菌酸化水和辐射食物随意。所有动物实验均获得该研究所动物伦理委员会 (IAEC) 的批准。

参考

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