材料和试剂

带冰块的冰桶
蒸馏水
小画笔，圆形，2 号（普林斯顿）或用于收集幼虫的抹刀
PYREX 9腔点板（Fisher Scientific，目录号：13-748B）
移液器和吸头（P200、P1000）
玻璃珠，未洗涤，425-600 μm（Sigma，目录号：G9268-100G ），储存在 RT
2 - ml Safe-Lock Eppendorf 管（VWR Scientific，Eppendorf，目录号：20901-540）
100 - μ米细胞过滤器（VWR科学，目录号：21008-950）
Eppendorf LoBind 管（Fisher Scientific，Eppendorf，目录号：13-698-794）
的Eppendorf米icrocentrifuge吨ubes（VWR，目录号：62111-752）
0.22 - μ m 50 - ml 管顶过滤器（VWR Scientific，目录号：28680-120）
培养皿，60 mm（VWR Scientific，目录号：25384-060）
15 - ml Falcon 管（Corning，目录号：430052）
台盼乙略溶液（Sigma，目录号：T8154），保存于室温
Neubauer计数室（血细胞计数器）（VWR Scientific，目录号：15170-172）
OptiPrep （Axis-Shield ，目录号：AXS-1114542 ），储存在 RT 的暗处
1 ×磷酸盐-缓冲盐水（ThermoFisher，目录号：10010049），储存在室温下
施耐德昆虫培养基（Sigma-Aldrich，目录号：S9895 ），储存于4 °C
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G7757），储存在 RT
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A3912），储存在4 °C
Optiprep 梯度溶液（见配方）
1× PBS 中的 0.5% BSA（见配方）
20% 甘油溶液（见配方）

设备

#5 镊子（两对）（World Precision Instruments，Dumont，目录号：501985）
冷离心机以吊桶式转头设定为4 ℃以上的冷台式离心机
立体显微镜（用于解剖幼虫）
光学显微镜（用于手动计数细胞）
（可选）Countess 3 自动细胞计数器（Thermo Fisher Scientific）

程序

时间线
在您到达细胞封装步骤之前，预计以下时间（以分钟 [min] 为单位）。
1.幼虫收集和清理：~30 分钟
2.转移到E ppendorf 管并涡旋：~3 分钟
3.解剖/出血：~15 分钟
4. Optiprep 旋转，包括“无刹车”：~30 分钟
5.细胞恢复和计数：~10-15 分钟
对于每个基因型或条件下 100 只幼虫的两个样品，总时间为 ~90 分钟- 2小时。

准备 Optiprep 溶液
要达到 1.09 g/ml 的浓度，只需将 Optiprep 和 PBS 以 0.27 (Optiprep): 0.73 (PBS) 的比例混合。即，2毫升，混合540 μ升optiprep与1460 μ升PBS。在 15 - ml Falcon 管中彻底混合并置于冰上。

逐步协议获得高-从血细胞质量第三龄幼虫
收集〜100 - 200精确定时（96 ħ或120 ħ蛋后铺设荷兰国际集团）幼虫在PBS中每一个条件。使用 20% 甘油溶液可以很容易地从苍蝇瓶中取出幼虫。将大量 20% 的甘油加入含有食物中幼虫的苍蝇小瓶中；用抹刀搅拌混合食物。允许幼虫浮起并保留ř ieve他们使用漆刷或小抹刀（图1A）。
洗用幼虫简要〜300 μ升水或PBS在9孔腔玻璃板，并使用画笔，加载它们都在以2 -含有毫升Eppendorf管〜500 μ升玻璃珠和〜200 μ升PBS或水（图 1B）。
涡流含有管的幼虫和玻璃珠1.5 -在高速2分钟。
倒出幼虫和珠（您可能需要使用额外的水以迫使从管中的幼虫和珠）在以一个小的P ETRI盘（图1C）。收集幼虫，并使用画笔，转移到含有200 9以及腔玻璃板μ升PBS或施耐德的媒体中的孔（图1D）中的一个。分室玻璃板可以放在冰上。

图 1.果蝇三龄幼虫出血的实验装置。一个。检索的使用20％的甘油飞食品幼虫。乙。洗涤幼虫简要地，转移到含玻璃珠的Eppendorf管中，并涡旋。Ç 。倒出涡旋幼虫成P ETRI菜。d 。转移的幼虫到含有PBS或Schneider的媒体在冰上短暂洗涤9以及腔玻璃板。乙。转移洗涤幼虫到另一个孔含有冰-冷施耐德的培养基或PBS含有0.5％BSA和流血使用立体显微镜下＃5镊子幼虫。有关更多详细信息，请参见图 2。

接下来，在转移幼虫到另一个孔含有200 μ升“冰冷”施耐德的培养基或PBS含有0.5％BSA（图1E）。在带有光源的立体显微镜下移动板以可视化幼虫。
同时观察的立体显微镜下幼虫，保持的后端一个幼虫与一对镊子的并且使用另一对轻轻切口打开的后端，并继续向着前撕裂端（图2）。对所有幼虫重复该过程。让幼虫流血至少一分钟。

图 2.果蝇三龄幼虫出血示意图。镊子 #1 用于固定每个幼虫的后端，而镊子 #2 用于在前部方向撕裂幼虫。出血将含有血细胞的血淋巴释放到含有PBS/施耐德培养基的孔中。

使用 P200 移液器轻轻去除含有血细胞的 PBS/BSA 或施耐德培养基。˚F ILTER细胞悬浮液直接进入在冰上一个干净的Eppendorf低吸附微量离心管ü唱100 - μ米细胞过滤器以去除任何大块或碎屑。
接着，轻轻覆盖200 μ升过滤细胞悬浮液到2毫升1.09克/ ml的Optiprep克radient预先在15制备-在冰上毫升Falcon管中。
进行到幼虫的下一个条件（如果适用的话），得到细胞悬浮液（小号TEPS乙1-乙8），和覆盖到另一个Optiprep梯度在第二15 -毫升猎鹰在冰上管。
注意：理想情况下，两种条件或基因型的幼虫同时涡旋并依次放血以分离玻璃板的孔；然后将细胞悬液加载到两个不同的 Optiprep 梯度管中，这样可以节省时间。
旋与细胞过度Optiprep的Falcon管在1 ，000 ×克在swingling桶转子组至4 ℃下20-30分钟，在“无制动”设置。
小心地从梯度中收集细胞。一、收集前100名μ l 您加载并转移到干净的 Eppendorf LoBind 管中。建议收集额外的100 μ从顶部和转移到另一个干净的Eppendorf管低吸附升。计数两个管中的细胞，看看哪个含有更多的细胞。有时，细胞积聚在第二100 μ梯度的升区域。
使用 Neubauer 计数室（血细胞计数器）或 Countess 自动细胞计数器对细胞进行计数。
的10 ×基因组学平台建议1 ，000个细胞/ μ升。但你可以瞄准700 - 1 ，每000个细胞μ湖如果S其中将细胞悬浮液稀释过，执行在一个额外的自旋冷台式离心机和重悬细胞在人奥尔PBS的体积含0.5％BSA。
遵循细胞封装，cDNA扩增的协议，并且由10个提供文库制备×基因组学。

替代协议：
如果样品制备过程干净且大组织团块或碎屑可忽略不计，则可以避免 Optiprep 步骤，这些大组织团块或碎屑可能在出血过程中积聚。下面是一个没有 Optiprep 步骤的快速替代方案。重要的是，这种方法可以帮助以获得更高的血细胞数的作为比较用的Optiprep梯度法。
后续小号TEPS乙1-乙8 。
出血后，通过过滤该细胞悬浮液转移到干净的无RNase的微量离心管（未低吸附）一个100 - μ米细胞滤网。
注意：在离心步骤中不要使用 LoBind 管。
在 4 °C 下以 1 , 000 × g离心细胞悬浮液5 分钟。
小心地取出从细胞沉淀上清并将细胞重新悬浮在100 μ在PBS升0.5％BSA。
重复步骤 3-4，总共洗涤两次，并将最终的细胞悬液转移到新的 Eppendorf LoBind 管中。
注：低吸附管在这最后一步推荐使用，因为它们可以帮助到红眼Ë细胞的损失。
使用 Neubauer 计数室（血细胞计数器）或 Countess 自动细胞计数器对细胞进行计数。用于计数，混合10 μ升0.4％台盼蓝溶液与10 μ升细胞悬浮液（1：1倍稀释）和负载到所述计数室。确定活细胞的百分比，必须大于 90%。
目标为细胞数目推荐10 ×染色体组，这通常是700 - 1 ，000每细胞μ升。这是封装后实现 10,000 个细胞恢复的“最佳点” 。

食谱

Optiprep 梯度溶液浓度
1.09 g/ml PBS（Optiprep 与 PBS 的比例 - 0.27:0.73）。制备至少4毫升Optiprep溶液和除法在到2 15 -毫升Falcon管（即，对于两个样品）。有关 Optiprep 的更多详细信息，请访问https://www.optiprep.com/C14.pdf。
0.5% BSA 合 1× PBS
将 0.5 g 超纯 BSA 添加到 100 ml 1 × PBS 中。调匀和过滤器使用0.22 - μ米无菌过滤器单元。根据样本大小缩小体积。
20%甘油溶液
将 200 毫升纯甘油加入 800 毫升蒸馏水中。根据需要缩小音量。

致谢

我们感谢 Stephanie E. Mohr 博士和 Ram Viswanatha 博士对协议的建议和投入。NP 是霍华德休斯医学研究所的研究员。该协议已被证明适用于果蝇幼虫血液的scRNA-seq （Tattikota等，2020）。图 2是在 Biorender ( https://app.biorender.com/ )的帮助下生成的。

利益争夺

作者声明没有竞争利益。

参考

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