材料和试剂

1. 1 - ml 移液器和吸头（STARlabs，目录号：S1122-1830）
2. （可选）6孔板小号（蜂星，目录号：567160）
3. 离心管，15 -毫升和50 -毫升（康宁，目录号小号：430719，430829）
4. 40 - μ米Ç ELL滤器中（Falcon ，目录号：352340）
5.（可选）针头20G
6. 刀片（Swann-Morton ，目录号：0314 #27）
7. 过滤器（Millex，目录号：SLGP033RS）
8. CD1 m冰龄 8 周
9. 冰
10. 胶原酶 P（Roche，目录号：11213865001）
11. DMEM （Sigma-Aldrich ，目录号：D6429 ）
12. 胎b绵羊小号erum（FBS）（Sigma公司，目录号：F7524）

设备

解剖盘
生物安全Ç abinet
体视显微镜和光源（Zeiss Stemi 2000-C 和 Olympus KL1500 LCD）
镊子和细镊子
带摇晃功能的水浴锅（Grant，型号：OLS 200）
Heraeus 解剖罩（或任何可以确保控制污染的罩）

程序

准备解剖
在一个b iosafety柜，准备一个6 -孔板用3 ml的解剖培养基含有10％FBS，并在冰上地方（2.7的10ml DMEM与300微升FBS）。
将水浴加热至 37℃。

解剖
收集用于 PDL 细胞收集的麦克风。
通过用刀片将头部与身体分开来收获上颌骨和下颌骨，然后在舌头上方切割以分离上颌骨和下颌骨。然后分开左右上颌骨或下颌骨。
小心地取出所有附着在牙齿齿龈组织（图URE小号1A和1个B）。
使用细镊子通过握住牙冠并拉动来拔出牙齿。小心点；牙齿可以从镊子里跳出来。如果被污染，请丢弃牙齿。如果牙齿不易去除，插入一个2 0G针的冠之间的第一和第二臼齿直到它松开（图URE 1C ）。
去除任何过多的组织骨残留物。个被大多出现小号在分叉区域或附近的根尖（图URE 1D）。PDL 组织应附着在牙齿表面。确保根部完好无损。
将牙齿存放在含有冰上介质的6 孔板中。

图1 。解剖程序。一个。解剖上颌骨和下颌骨，去除牙齿周围的软组织（圆圈区域）。乙。确保有是牙齿周围留下任何软组织。Ç 。如果牙齿难以拔除，请将针放在牙齿之间并四处移动以松开牙齿，然后再次尝试拔除。d 。拔出的牙齿，在酶消化前，牙根表面应有PDL组织（蓝色箭头）；确保有在分叉区域（无骨组织米深红色三角形）。只保留完整的牙齿（绿线）。乙。拔出的牙齿显示出光滑的牙根表面，没有附着 PDL 组织。

解离
使3毫升新鲜胶原酶P（山口P）溶液（3 U / ml）中并过滤通过0.22 -微米的过滤器中，以15 -毫升˚F爱尔康管。
传送完整齿15 -毫升˚F爱尔康管和添加2毫升胶原P含有10个％FBS。
放置˚F爱尔康管在37 ℃的水浴中30-45分钟，用一个振荡速度的140和均质化3次每次10-15分钟吹打溶液上下用1 -毫升吸管。摇动步骤有助于以分手胶原蛋白和释放的细胞。如果在摇动功能不能使用，10 -分钟均化间隔被建议。
Ť ø收获单细胞，当细胞从组织释放后30-45分钟，通过40传送液体-微米Ç ELL过滤器成50 -毫升˚F爱尔康管。
离心机在1 ，200 ×克为5分钟。一个C ，如果细胞数是低ELL粒料可能看不到。
小心丢弃上清液。
将细胞储存在冰上用于后续实验。

d ATA分析

预期结果
PDL组织应该是dissociat ED如图URE 1E。乙安伏酶消化，所述PDL组织附着到牙齿表面（图2）。酶消化后，PDL 组织被分离，包括牙根表面的成牙骨质细胞。诺塔布莱，虽然纸浆单元被连接到经由根尖孔PDL细胞，它们不是在消化过程中被释放。这仅适用于牙根完全形成的牙齿；如果显影吨EE使用日，牙髓细胞将被释放，并与PDL细胞（收集在一起˚F igure S1）。

图2 。从成人牙周韧带收获的细胞。H&E 染色显示拔出的牙齿在酶消化之前有 PDL 组织附着在牙根表面（左）。然而，消化后，对细胞的牙面被释放，而没有contami从牙髓细胞（右）的国家。

从使用该协议解剖牙周组织分离的细胞已经经受单-细胞RNA测序并将该数据用于研究的细胞群的异质性，在牙周炎细胞变化，和细胞-细胞的Signa升玲相互作用（荆等人，。2021）。

确认小号

我们感谢 Lucia Zaugg 博士、Arshiya Banu博士和Jan Krivanek 博士的帮助。京兆持有的培训支持的中国国家留学基金委助学金与伦敦国王学院。承认 NIHR GSTFT/KCL 生物医学研究中心的资助。该方案首次发表在我们的原始研究论文《干细胞对健康牙周韧带和牙周炎中成牙骨质细胞分化的贡献》（Zhao等人，2021 年）中。

利益争夺

有没有利益或竞争利益冲突小号。

参考

金田，T. ，宫内，M 。，武越，T 。，北川，S 。，北川，M 。，芝，H 。，栗原，H 。和Takata , T. (2006) 。通过连续酶消化大鼠磨牙牙周膜获得的牙周膜亚群特征。骨38(3) ：420 - 426。
马修斯，B. G.，Roguljic ，ħ 。，弗朗西斯凯蒂，T 。，罗德，E 。，马蒂奇，我。，维多维奇，我。，乔希，P 。，库姆，K 。是。和Kalajzic , I. (2016) 。成牙骨质细胞和成骨细胞的基因表达分析。J 牙周病研究51(3) ：304 - 312。
朴，J.C .金，J 。米。，荣格，我。H . ，金，J 。Ç 。，崔，S 。H . ，赵，K 。小号。和金，C 。S. (2011)从发炎的 PDL 组织中分离和表征人牙周膜 (PDL) 干细胞 (PDLSCs)：体外和体内评估。J Clin Periodontol 38（8）：721 - 731。
徐，B.M. ，三浦，M 。，格隆索斯，S 。，巴托德，P 。米。，巴图利，S 。，布拉欣，J 。，年轻，M 。，罗比，P 。格。王，Ç 。是。和Shi , S. (2004) 。人牙周膜多能产后干细胞的研究。柳叶刀364(9429) ：149 - 155。
赵，J. ，Faure ，L 。，阿达梅科，我。和夏普，P 。Ť 。(202 1 ) 。干细胞对健康牙周膜和牙周炎中成牙骨质细胞分化的贡献。干细胞39(1)：92-102 。

版权所有 © 20 2 1作者；独家被许可人 Bio-protocol LLC。1