材料和试剂

1.核酸酶-无1.5毫升微量离心管中小号（Tarson，目录号：500010）
2.核酸酶-无2-ml离心管小号（Tarson，目录号：500020）
3.加入10μl，20微升，200微升，和1ml的提示（Tarson，目录号小号：524053，528101，528104，528106）
4. 96 -孔PCR板（赛默飞世尔科技，产品目录号：4483485 ）
5.无核酸酶水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977023）
6. 0.25% 胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，目录号：25200056）
7.磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma，目录号：P4417-50TAB）
8. 1 M Tris-HCl，pH 7.5（Thermo Fisher Scientific，目录号：15567027）
9. 1 M Tris-HCl ，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：15568025）
10. 2 M氯化钾（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9640G）
11. 1 M氯化镁（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9530G）
12. 5 M氯化钠（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9759）
13. Nonidet P-40（Amresco，目录号：M158-100ML）
14. 0.5 M EDTA ，pH 8.0（Amresco，目录号：E177-100ML）
15. Triton X-100（SRL，目录号：64518）
16.鼠RNase抑制剂（NEB，目录号：M0314S，40 U/μl）
17. 20 ×蛋白酶抑制剂（Sigma，目录号：S8830）

18.链霉亲和素 Dynabeads（NEB，目录号：S1420S）
19. TRIzol（Thermo Fisher Scientific，目录号：15596018）
20.乙醇（HiMedia，目录号：MB228）
21.氯仿（SRL，目录号：96764）
22.异丙醇（SRL，目录号：38445）
23. GlycoBlue TM共沉淀剂（15 mg/ ml ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9515）
24.最大值逆转录酶（赛默飞世尔科技，产品目录号：EP0743）
25. dNT P set ，1 0 0 mM溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0181）

26.随机引物（Thermo Fisher Scientific，目录号：48190011）
27. PowerUp SYBR G reen master mix（Thermo Fisher Scientific，目录号：A25778）
28. MicroAmp光学胶膜（Thermo Fisher Scientific ，目录号：4311971）
29. SIGMA合成的用于 circHipk2 PCR 扩增的Divergent DNA oligo 引物（circHipk2-F: 5'- TCCAGACAACCGTACCGAGT-3'和circHipk2-R: 5'- GGCACTTGATTGAAGGGTGT-3'）
30.用SIGMA合成的生物素-TEG标记的定制反义寡核苷酸用于控制 (Ctrl-ASO: 5'-TGCGTAACGAACGACGAATCGTCGCAGATC-3'[BtnTg]) 和 circHipk2 (circHipk2-ASO: 5'-CATGTGAGGCCATACCGGTAGTATCTGGBtnTg')
31. 3 × SDS 加载染料（NEB，目录号：B7703S）
32.多聚体提取缓冲液 (PEB)（参见食谱）
33. 2 × Tris、EDTA、NaCl、Triton (TENT) 缓冲液（见配方）
34. 1 ×帐篷（见食谱）

设备

1.手动p ipette组，2微升，20微升，200微升，和1ml（各个厂商）
2.涡流混合器（Tarson，目录号：3001）
3.磁性支架（Tarson，目录号：S1509S）
4.管旋转器（Tarson，目录号：3071）
5.冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810R）
6.台式微量离心机（Tarson，目录号：1010）
7. Thermomixer（Eppendorf，目录号：5384000012）
8. PCR机（各厂家）
9. QuantStudio 3 实时 PCR 系统（Thermo Fisher Scientific ，目录号：A28567 ）

软件

1. UCSC 基因组浏览器（https://genome.ucsc.edu/）
2. Primer3 网络工具 ( https://bioinfo.ut.ee/primer3/ )
3. GeneRunner ( http://www.generunner.net/ )
4. QuantStudio 3 和 5 系统软件
5. Circinteractome 网站（https://circinteractome.nia.nih.gov/）

程序

寡核苷酸设计
1.利用反向剪接位点的基因组坐标，从RNA测序数据或UCSC基因组浏览器中获取感兴趣的circRNA的成熟序列。在这里，我们从小鼠 mm10 UCSC 基因组浏览器中检索了小鼠 circHipk2 (chr6|38818229|38819313|-) 的序列（图 1）。
注：多外显子circRNA的成熟剪接序列可以通过反向剪接位点的基因组坐标之间的所有外显子序列组合得到。

图标描述已自动生成

图1 。设计的发散引物和生物素标记的反义寡核苷酸靶向circHipk2 。

2.如图1所示，加入circRNA序列的最后15个核苷酸至第15个核苷酸，以获得30的上游-跨越circRNA backsplice结核苷酸序列。
3.为了设计ASO，生成30的反向互补序列-核苷酸连接序列使用GeneRunner。与合成该序列b iotin-TEG添加到3'末端通过优选的供应商。
4.设计引物的使用目标看家基因的mRNA或rRNA的的底漆3网络工具。
5.如前所述（Panda 和 Gorospe，2018）或使用人类 circRNA 的 circinteractome 网站（Dudekula等，2016 ）设计目标 circRNA 的不同引物。

细胞裂解
取一个 100 - mm 约 70% 融合的 βTC6 细胞的培养皿并丢弃培养基。
注意：最少应使用500 万个细胞进行下拉测定。细胞的较高量可能有助于以获得稀有或低拷贝数circRNAs更好的下拉。
用 5-10 ml 冰冷的 1 × PBS清洗细胞3 次。
通过胰蛋白酶消化或用细胞刮刀刮取细胞。
通过在 4°C 下以 1,000 × g离心2 分钟来沉淀细胞并丢弃上清液。
在 1 ml 冰冷的多聚体提取缓冲液 (PEB) 中重悬细胞沉淀。
注意：用 PEB 裂解释放细胞质部分，而不是核部分。
立即加入 5 µl RNase 抑制剂和 50 µl 20 ×蛋白酶抑制剂。
吹打十倍拌匀，并保持在冰上15分钟，移液或涡旋为几秒钟，每4 - 5分钟，直到细胞被裂解。
将裂解物在4°C 下以 12,000 × g离心10 分钟。
收集 900 µl 上清液并进行杂交步骤（图 2）。

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图 2. 使用生物素化-ASO靶向circHipk2的 circRNA 下拉示意图。

反义寡核苷酸杂交
1.添加一个冰冷2米的等体积（900微升）×的Tris，EDTA，氯化钠，曲拉通（TENT）缓冲液把在2以上步骤收集上清液- ml离心管。
2.鸿沟将混合物分成两管（一个用于所述控制ASO下拉和另一个用于所述circRNA-ASO下拉）。
3.分别向对照管和 circRNA pulldown 管中加入 1 µl 100 µM (100 pmol) ctrl-ASO 和 circRNA-ASO。注意：制造商的数据表给出了链霉亲和素珠结合能力。ASO 量应小于下一步下拉的链霉亲和素珠结合能力。较高的 ASO 量可能会降低下拉效率。
4.在转子上以30 rpm 的速度在 4°C 下孵育反应物90 分钟。注：ASO杂交反应可以在室温下或进行在37℃下，以促进ASO双向Ñ丁靶向circRNA ; ħ H但是，这个米AY影响在具有高水平的内源性核糖核酸酶的RNA样品的完整性。

链霉亲和素珠制备
1.在 ASO 杂交步骤完成前 15 分钟开始制备链霉亲和素珠。
2.混合均匀，将100 µl磁性链霉亲和素珠（每个反应 50 µl ）放入新管中。
3. P花边上磁性支架30秒磁珠并弃去上清液。
4. 将磁珠重悬在 500 µl 冰冷的 1 × TENT 缓冲液中，并将管子放在磁力架上 30 秒。
5.在磁力架上将试管旋转 180º两次以清洗珠子（视频 1）。

视频 1. 磁珠洗涤

6.弃去上清液。
7.重复洗涤步骤（小号TEPS d 4- d 6）的两倍。
8.在 100 µl 冰冷的 1 × TENT 缓冲液中重悬磁性链霉亲和素珠。

循环RNA p ulldown
1.加入50μl洗涤链亲和素磁性小珠到每个杂交反应管（在提及的小号TEP完成90分钟后C4）UTE杂交步骤。
2. 向管中加入 1 µl RNase 抑制剂和 5 µl 20 ×蛋白酶抑制剂，并通过移液充分混合。
3.在试管旋转器上以 30 rpm 的速度在室温下旋转对照管和 circRNA ASO 管 30 分钟。
4.短暂离心管子，将所有液体样品带到管子底部，而不会使珠粒形成颗粒。
注意：高速离心可能会使珠粒沉淀，这可能会影响洗涤步骤。

5.将试管置于磁力架上 30 秒，弃去上清液。
6. 将磁珠重悬在 500 µl 冰冷的 1 × TENT 缓冲液中，并将管子放在磁力架上 30 秒。
7.在磁力架上旋转试管两次以清洗磁珠（视频 1）。
8.允许珠以朝向磁铁沉降，弃去缓冲液。
9.重复洗涤步骤（步骤 6-8）两次。注意：洗涤次数可能取决于目标 circRNA 的富集倍数。我们发现在我们的下拉分析中，两到三次洗涤适合富集 circHipk2。
10.最后一次洗涤后，离心管几秒钟，使珠子沉淀在底部。
11.将试管置于磁力架上 30 s，弃去剩余的上清液。
12.在 30 µl 冰冷的 PEB 中重悬珠子。
13.取 15 µl 磁珠到新管中进行 RNA 分离和 RT-qPCR，使用 ASO 分析 circRNA 的 pulldown 效率并检测 circRNA 相关的 miRNA。
14.将 7 µl 3 × SDS 上样染料添加到剩余的 15 µl 珠子中并通过移液混合，然后在 95°C 下加热 5 分钟。该样品可立即用于蛋白质印迹以识别相互作用的 RBP 或储存在 -20°C。

从RNA和cDNA制备的下拉样
1.将 250 µl TRIzol 试剂加入 15 µl 磁珠中以进行 RNA 分离，并通过移液充分混合。
不Ë ：任何相似的RNA分离试剂如TriSure，RNAzol，TRI试剂，或TriPure可用于制备RNA。应避免使用基于柱的 RNA 分离试剂盒，因为使用标准 RNA 分离试剂盒不能很好地纯化 miRNA 。否则，请使用可以同时分离长RNA和 miRNA的试剂盒。

2.加入 50 µl 氯仿，涡旋 15 秒。
3.在 4°C 下以 12,000 × g离心15 分钟，然后收集 100 µl 水层到一个新管中。
4.添加100μl的异丙醇和0.5微升glycoblue作为一个共-沉淀剂。
5.混合均匀，并保持在室温下10分钟，然后离心机È以12,000 ×克于4℃10分钟。
6.弃去上清液，向 RNA 沉淀中加入 500 µl 75% 乙醇，涡旋离心管几秒钟。
7.在室温下以 12,000 × g离心5 分钟。
8.弃上清，空气干燥RNA沉淀3-5分钟用的盖子打开。
注：过度干燥的RNA沉淀或残余的乙醇可能抑制颗粒的溶解度。

9.将沉淀溶解在 20 µl 无核酸酶水中。的RNA可以储存在-20℃以备将来使用或用于立即进行cDNA合成。
10.准备一个20 -微升含13微升cDNA合成反应制备的RNA，0.5μl的最大值逆转录酶，0.5μl的RNase抑制剂，1微升10毫摩尔dNTP混合物，1μl的随机引物，和4微升5 × RT缓冲液。
注意：可以使用任何标准逆转录试剂盒和随机引物制备 cDNA 。

11.轻轻混合反应液并在室温下孵育 10 分钟，然后在 50°C 下孵育 1 小时。
12.将反应在 85°C 下孵育 5 分钟以灭活逆转录酶。
13.用 250 µl 无核酸酶的水稀释 cDNA 。这可以被储存在-20℃或用于立即用于PCR分析。

RT-qPCR的circRNA富集分析
1.将 10 μl 100 μM 正向和反向引物储备液与 980 μl 无核酸酶水混合，以获得 1 μM 引物混合物的终浓度。
2.准备20 -在微升反应的96-孔板含有5微升的cDNA，5μl的引物混合，并加入10μl2 × SYBR绿色混合。应准备三个技术重复。
3.用光学胶盖密封板并涡旋几秒钟。
4.将板离心几秒钟，使反应物到达孔底。
5.在QuantStudio 3实时PCR系统中进行定量PCR以在下列反应设置：2分钟，在95初始循环℃，然后4个0 5秒周期在95℃在60℃和20秒℃。
6.获取的技术重复的平均值Ct值在每个目标的控制和circRNA下拉样品。
7.计算下拉样品中靶circRNA的百分比（％）浓缩为相比与使用Δ-CT方法（图3），控制下拉样品（Livak和Schmittgen，2001）。

图表，条形图描述已自动生成

图3.实施例一MPL Ë数据表示的百分比富集circHipk2在所述circRNA-ASO相对于下拉样品的控制ASO p ulldown样品。

检测相互作用的 miRNA 和 RBP
1.确认circRNA ASO pulldown样本中目标circRNA富集后，可以分析相关的miRNA和RBP 。
2.可以通过RT-qPCR分析与目标circRNA相关的miRNA。上述步骤制备的 RNA 可用于产生miRNA cDNA，然后进行 qPCR 分析，以研究它们在 circRNA pulldown 样本中的特异性富集。
3.执行标准的蛋白质印迹以检测 circRNA 相关的 RBP。简言之，题目输入，控制ASO ，和circRNA ASO用SDS染料混合下拉样到SDS-PAGE，和蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。用针对预测的 RBP 的一抗孵育膜，然后用适当的二抗孵育，并检测化学发光信号。

数据分析

该方法描述下拉使用环状RNA的反义寡核苷酸特异性靶向的backsplice接合序列的目标circRNA。然而，日的这个电子成功拉下试验d epends上circRNA接合序列的可用性，其中m AY是不可访问的，由于二级结构或结-相互作用限制性商业惯例，防止从ASO结合。此外，用于细胞裂解的 PEB 有利于释放细胞质部分，而用于下拉核定位 circRNA 的细胞核裂解仍有待标准化。由于大多数 circRNA 本质上是细胞质的（Jeck等人，2013），我们使用 PEB 进行细胞裂解和下拉测定。使用 delta-Ct 方法分析 circRNA ASO pulldown 样本中目标 circRNA 的富集，与使用加载控制（如18S rRNA 或Gapdh mRNA）的对照 pulldown相比（Livak 和 Schmittgen，2001）。如图3所示，circHipk2水平超过2 -在circHipk2 ASO下拉倍比控制ASO下拉。或者，可以通过比较 pulldown 样本与流过或输入来测量 circRNA pulldown 的效率。检查circRNA的下拉样品中富集后，剩余的RNA可进行miRNA的RT-qPCR分析，以检查对于miRNA的特异性富集预测为与感兴趣的circRNA交互。此外，其他的可以使用下拉样品的一半用于免疫印迹婷分析以evalu一个TE的限制性商业惯例associat ED与目标circRNA。这是一种下拉感兴趣的环状 RNA 并研究环状 RNA 相关 miRNA 和 RBP 的有前途的方法，它们是环状 RNA 介导的基因调控的关键因素。

配方小号

1.多聚体提取缓冲液 (PEB)
试剂

库存

250 毫升所需的体积

20 mM Tris-HCl，pH 7.5

1 米

5毫升

100 毫米氯化钾

2米

12.5 毫升

5 毫米氯化镁2

1 米

1.25 毫升

0.5% Nonidet P-40

10%

12.5 毫升

用无核酸酶水将体积调节至 250 ml

2. 2 × Tris、EDTA、NaCl、Triton (TENT) 缓冲液
试剂

库存

100毫升所需的体积

20 mM Tris-HCl pH 8.0

1 米

2毫升

2 mM EDTA pH 8.0

0.5M

0.4 毫升

500 毫米氯化钠

5米

10毫升

1% v/v 海卫 X-100

20%

5毫升

用无核酸酶水将体积调节至 100 ml

3. 1 ×帐篷
混合等体积的 PEB/水和2 × TENT

致谢

这项研究得到了生命科学研究所和惠康信托基金/DBT 印度联盟中级奖学金 (IA/I/18/2/504017) 提供给 ACP 的校内资金支持。DD和AD是由青年研究奖学金支持小号从该大学拨款委员会，印度。该协议改编自先前发表的论文（Abdelmohsen等人，201 7和 Panda等人，2017 年）。作者感谢我们在布巴内斯瓦尔生命科学研究所的同事对文章进行了校对。

利益争夺

作者宣称没有冲突小号的兴趣。

参考

Abdelmohsen, K., Panda, AC, Munk, R., Grammatikakis, I., Dudekula, DB, De, S., Kim, J., Noh, JH, Kim, KM, Martindale, JL 和Gorospe, M. ( 2017）。HuR 目标环状 RNA 的鉴定揭示了 CircPABPN1 对 PABPN1 翻译的抑制。RNA 生物学14(3)：361-369。
Dudekula, DB, Panda, AC, Grammatikakis, I., De, S., Abdelmohsen, K. 和 Gorospe, M. (2016)。CircInteractome：一种用于探索环状 RNA 及其相互作用的蛋白质和 microRNA 的网络工具。RNA 生物学13(1)：34-42。
Guria, A.、Sharma, P.、Natesan, S. 和 Pandi, G.（2019 年）。环状RNA——少有人走的路。前分子生物学6：146。
Jeck, WR, Sorrentino, JA, Wang, K., Slevin, MK, Burd, CE, Liu, J., Marzluff, WF 和 Sharpless, NE (2013)。环状 RNA 丰富、保守且与 ALU 重复相关。RNA 19(2)：141-157。
Livak, KJ 和 Schmittgen, TD (2001)。使用实时定量 PCR 和 2 -ΔΔCT方法分析相关基因表达数据。方法25(4)：402-408。
Palazzo, AF 和 Lee, ES (2015)。非编码 RNA：什么是功能性的，什么是垃圾？前基因6：2。
Panda, AC 和 Gorospe, M.（2018 年）。通过 RT-PCR 检测和分析环状 RNA。生物协议8(6)。
Panda, AC, Grammatikakis, I., Kim, KM, De, S., Martindale, JL, Munk, R., Yang, X., Abdelmohsen, K. 和 Gorospe, M. (2017)。衰老相关环状 RNA（SAC-RNA）的鉴定揭示了衰老抑制因子 CircPVT1。核酸研究45(7)：4021-4035。
Pandey, PR, Yang, JH, Tsitsipatis, D., Panda, AC, Noh, JH, Kim, KM, Munk, R., Nicholson, T., Hanniford, D., Argibay, D., Yang, X., Martindale, JL, Chang, MW, Jones, SW, Hernando, E., Sen, P., De, S., Abdelmohsen, K. 和 Gorospe, M. (2020)。circSamd4 抑制 PUR 蛋白的生肌转录活性。核酸研究48(7)：3789-3805。
Vromman, M.、Vandesompele, J. 和 Volders, PJ (2021)。闭环：circRNA 数据库的现状和前景。简要生物信息22(1): 288-297。