材料和试剂
所有试剂，消耗品和设备均应视为可能的选择。除非另有说明，否则化学品和消耗品应在室温下存储。
A.溶剂和试剂

MeOH中≥99％的PA （CARL ROTH，目录号：8388）
的EtOH ROTIPURAN ® ≥99.8％，PA （CARL ROTH，目录号：9065）
氯仿3 ≥99％，PA （CARL ROTH，目录号：3313）
罗地® -苯酚（TE-缓冲液平衡，pH值7.5〜8.0）（CARL ROTH，目录号：0038，在4℃存储）
异戊醇（3-甲基-1-丁醇），pa （Merck，目录号：100979）
甘油≥99.7％，pa （CARL ROTH，目录号：6962，储存于4°C）
Bradford分析试剂–与洗涤剂兼容（ThermoFisher Scientific，目录号：23246S，在4°C下储存）
苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）（小号EE ř ecipes，保存于4℃）

B.酸和碱

KOH≥85％，pa （CARL ROTH，目录号：6751）
HOAC 100％，pa （卡尔·罗斯（CARL ROTH），目录号：3738）
盐酸≥25％，PA （CARL ROTH，目录号：6331）
B（OH）3 ≥99.8％，PA （PANREAC APPLICHEM，目录号：131015）

C.缓冲化合物和盐

三- （羟甲基） -氨基甲烷（TRIS）PUFFERAN ® （CARL ROTH，目录号：4855）
N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙烷磺酸磺酸（HEPES）PUFFERAN ® ≥99.5％，PA （CARL ROTH，目录号：9105）
咪唑PUFFERAN ® ≥99％，PA （CARL ROTH，目录号：X998）
氯化钾（卡尔·罗斯，目录号：6781）
氯化镁2· 6H 2 O（CARL ROTH，目录号：2189）
NaCl （CARL ROTH，货号：3957）

D.还原和螯合剂

1,4-二硫苏糖醇（DTT）≥99％，pa （CARL ROTH，目录号：6908 ，在4°C下储存）
三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）≥98％（Sigma-Aldrich，目录号：C4706，储存在4°C）
Na 2-乙二胺四乙酸钠（Na 2 EDTA）· 2H 2 O（CARL ROTH，目录号：8043）
乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）≥99％，pa （CARL ROTH，目录号：3054）

E.核糖核苷酸

5'-三磷酸腺苷（ATP），100 mM ，pH 8 .0 （CARL ROTH，目录号：K045 ，储存在-20°C）
尿苷5'-三磷酸（UTP），100 mM ，pH 8 .0 （CARL ROTH，目录号：K046，储存在-20°C）

F.凝胶电泳耗材

丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19：1）Rotiphorese ®凝胶40（CARL ROTH，目录号：3030，保存于4℃）
尿素（CARL ROTH，货号：2317）
过二硫酸铵（CARL ROTH，目录号：9592）
N，N，N 'N' - Tetramethylethylendiamine （CARL ROTH，目录号：2367）
溴酚蓝，Na +-盐（默克，目录号：108122）
二甲苯氰FF，Na +-盐（Sigma-Aldrich，目录号：X4126）
甲苯胺蓝O（Sigma-Aldrich，目录号：T3260）
6 ×天然PAGE凝胶加载缓冲液（请参见配方）
2 ×变性PAGE凝胶加载缓冲液（请参见配方）
TBE缓冲液，pH 8.3 （请参阅配方）
凝胶染色液（请参阅配方）
凝胶脱色溶液（请参见配方）

G.毛细管电泳耗材（见注1）

玻璃毛细管（Polymicro Technologies，目录号1068150017）
性能优化的聚合物6（POP-6 TM ）（赛默飞世科学，目录号：402837，小号在4℃撕）
10 × CE / LIF缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：B4930，在4°C下存储）
ħ 2 ö LiChrosolv ® （默克，目录号：115333）
高度去离子的甲酰胺（Hi- Di TM Formamide ）（ThermoFisher Scientific，目录号：4311320，储存在-20°C）

H. Editosomes和RNA-编辑反应混合物

亲和纯化的editosomes在10 mM的HEPES / KOH ，pH为7.5，1 mM的镁（OAC ）2 ，75 mM的氯化钠，0.1％（W / V）NP-40，0.1毫TCEP，1个mM的咪唑和10毫EGTA，20 ％（v / v）甘油（请参阅注释2，储存在-20°C下）
可选地，对于HTS-应用：Editosome富集的锥虫布氏线粒体蛋白提取物在20 mM的HEPES / KOH ，pH为7.5，10 mM的镁（OAC ）2 ，30毫摩尔的KCl ，0.5毫摩尔DTT，20％（V / V）甘油（见注2，储存在-20°C）

3x RNA编辑反应混合物（请参阅食谱，储存在-20°C下）

I.寡核糖核苷酸（见注释3和4）

标准FIDE分析：

U插入

5'-FAM-synCl14 ins ：FAM- （CH 2 ）6 -AAAGGAAAUAUAGU
3'-synCl16：pAGGUGAUUCCAUUGAG- （CH 2 ）6 -NH 2
SYN-gRNA INS ：CUCAAUGGAAUCACCUAAAACUAUAUUUCCUUU
删除

5'-FAM-synCl17 del ：FAM- （CH 2 ）6 -AAAGGAAAUAUAGUUUU
3'-synCl16：pAGGUGAUUCCAUUGAG- （CH 2 ）6 -NH 2
syn-gRNA del ：CUCAAUGGAAUCACCUACUAUAUUUCUCUUU

标准FIDE分析–硫代磷酸（PS）修饰（*）RNA：

U插入

5'-FAM_modCl14英寸：FAM- （CH 2 ）6 -AAAGGAAAU * A * U * A * GU
3'-modCl 16 ：pAG * G * U * GAUUCCAUUGAG-（CH 2 ）6 -NH 2
modgRNA ins ：C * U * C * AAUGGAAUCACCUAAAACUAUAUUUCC * U * U * U
删除

5'-FAM_modCl17 del ：FAM- （CH 2 ）6 -AAAGGAAAU * A * U * A * GUUUU
3'-modCl 16 ：pAG * G * U * GAUUCCAUUGAG-（CH 2 ）6 -NH 2
modgRNA del ：C * U * C * AAUGGAAUCACCUACUAUAUUUCC * U * U * U

多重（“一锅法”）U插入/ U删除测定：

U插入

5'-TAMRA_Cl18：TAMRA-（CH 2 ）6 -GGAAGUAUGAGACGUAGG
3'-Cl13：pAUUGGAGUUAUAG- （CH 2 ）6 -NH 2
gRNA INS ：CUAUAACUCCGAUAAACCUACGUCUCAUACUUCC
删除

5'-FAM_Cl22 ：FAM- （CH 2 ）6 -GGAAAGGGAAAGUUGUGAUUUU
3'-Cl15：pGCGAGUUAUAGAAUA- （CH 2 ）6 -NH 2
gRNA del ：GGUUCUAUAACUCGCUCACAACUUUCCCUUUCC

双重荧光检测：

U插入

5'-TAMRA_Cl18：TAMRA-（CH 2 ）6 -GGAAGUAUGAGACGUAGG
3'-Cl13_FAM：pAUUGGAGUUAUAG- （CH 2 ）6 -FAM
gRNA INS ：CUAUAACUCCGAUAAACCUACGUCUCAUACUUCC
删除

5'-FAM_Cl22 ：FAM- （CH 2 ）6 -GGAAAGGGAAAGUUGUGAUUUU
3'-Cl15_TAMRA ：pGCGAGUUAUAGAAUA- （CH 2 ）6 -TAMRA
gRNA del ：GGUUCUAUAACUCGCUCACAACUUUCCCUUUCC

RNA大小标准：

3'-FAM_13：AUUGGAGUUAUAG-（CH 2 ）6 -FAM
5'-FAM_22：FAM-（CH 2 ）6 - GGAAAGGGAAAGUUGUGAUUUU
5'-FAM_37：FAM-（CH 2 ）6 - GGAAAGGGAAAGUUGUGAUUUUGCGAGUUAUAGAAUA
5'-FAM_44：FAM-（CH 2 ）6 -CUAGUACUCUCAUCAACAUAAGUCUCAUACUUCCCGACAUGCA-CG
反应瓶：

薄壁聚丙烯反应管0.2 ml（VWR peqlab ，目录号：732- 3215）
薄壁聚丙烯反应管0.5 ml（VWR peqlab ，目录号732-3207 ）
1.5毫升聚丙烯反应管（Sarstedt ，目录号：72.706）

设备

分光光度计（Thermo Scientific，型号：NanoDrop 2000C）
热循环仪（Biometra ，T3）
基于CE / LIF的DNA测序仪（Applied Biosystems，型号：ABI PRISM 310遗传分析仪）
台式离心机（Eppendorf，型号：5417 R）
SpeedVac真空浓缩器（Savant Instruments，型号：SVC-100）
干式加热系统（授权，型号：QBD2）
涡旋混合器（科学仪器，型号：Vortex Genie 2）
直流高压电源（Biometra ，型号：P30）
凝胶电泳槽（BIO-RAD，型号：迷你PROTEAN ®四小区）
微量移液器（Gilson，型号：Pipetman P10，P20，P200，P1000）
凝胶文件系统（INTAS，型号：Gel iX20 Imager）

软件

R（用于统计计算的R项目，https：//www.r-project.org/）
程序员类型的文本编辑器（例如Vim，https：//www.vim.org或Atom，https：//atom.io）

程序

gRNA / pre-mRNA底物形成
使用两个0.5 ml的薄壁聚丙烯反应管分别组装三聚体U插入和U缺失gRNA / pre-mRNA底物RNA。最终的gRNA / pre-mRNA浓度为10 nM 。

将3'-pre-mRNA Cl-片段，荧光标记的5'-pre-mRNA Cl-片段和相应的gRNA寡核糖核苷酸在TE缓冲液（pH 7.5 ）中分别以30nM的最终浓度混合。您需要10 µl gRNA / pre-mRNA底物才能进行30 µl编辑反应。
涡旋混合（5 s），并通过短暂离心（10 s快速旋转）收集试管中的内容物。
在75°C下热解寡核糖核苷酸2分钟，然后通过以0.08°C / s的速度冷却至27°C来退火3个RNA。
注意：必须在单独的分析中验证gRNA / pre-mRNA杂合物的形成（请参见注释5）。三聚体RNA杂交的产率应≥90％。

RNA编辑反应和样品净化
将等体积的3 ×编辑反应混合物添加到步骤1c中的退火gRNA / pre-mRNA底物中。
分装20微升这种预混物到0.2毫升薄壁聚丙烯反应管中。
用ddH 2 O调节体积，以使最终体积（包括编辑小体的体积（稍后添加））为30 µl。
涡旋混合（5 s），并通过短暂离心（10 s快速旋转）收集试管中的内容物。
添加Editosomes，并通过轻轻上下吹打进行混合（请参见注释6）。
在27°C下孵育30分钟至3小时（请参见注释6）。
将样品转移到1.5 ml反应管中，并加入17 µl ddH 2 O，3 µl 125 mM Na 2 EDTA和50 µl PCI终止反应。剧烈混合。
在4°C下以> 15,000 × g旋转5分钟。
将H 2 O相转移到新的1.5 ml反应管中。加入5 µl 3 M NaOAc / HOAc （pH 4.8 ）和121 µl 100％（v / v）冷（-20°C）乙醇。混合并立即在> 15,000 × g的溶液中于4°C旋转30分钟以沉淀RNA。
吸出上清液，然后加入0.75 ml 70％（v / v）的冷（-20°C）EtOH 。
涡旋洗涤RNA颗粒，并在> 15,000 × g的温度下于4° C旋转5分钟。
重复步骤2j-2k。
抽吸除去任何液体，并在真空中干燥RNA沉淀2分钟。
将RNA颗粒溶于15 µl Hi- Di TM甲酰胺中。通过短暂离心（10 s快速旋转）收集试管中的内容物。
通过在95°C下孵育2分钟使RNA样品变性。在冰上快速冷却。

CE / LIF分离
将3 µl样品转移到0.5 ml反应管中（请参见注释13）。
在4个大小标准的RNA寡核苷酸中各添加4 fmol 。
加入Hi- Di TM甲酰胺至终体积为20 µl。混合并旋转。
切掉盖子，将试管放入CE / LIF仪器的自动进样器中。
运行毛细管电泳
上的CE / LIF-ABI PRISM ® 310 DNA-测序用50厘米的玻璃毛细管使用以下设置：模块SEQ POP6（1毫升）; 激光功率：7毫瓦; 注入电压：2.5 kV; 运行电压：12.2 kV; 样品注入时间：10 s（见注7）；运行时间：25分钟。

完成CE / LIF运行后，检查原始电泳图。由于只能定量分析非饱和CE / LIF迹线，因此可能有必要以更高的稀释度重新运行样品。

数据分析

CE / LIF分离的输出是未处理的电泳图，它作为二进制数据文件检索。为了提取电泳图数据点并进行下游处理，我们使用编程语言R。R是用于统计计算和图形的免费软件，它可以在UNIX，macOS和Windows操作系统上编译并运行。

打开R。
可以直接在R-console中键入命令。通过按ENTER / RETURN，将执行该命令。然而，对于更复杂的程序，更方便所有键入命令到一个文本编辑器或R的内置编辑器（见注8），其次是复制的代码到R-控制台。

OS X：文件新建文档

Windows：文件新脚本

安装Bioconductor和R软件包“ pracma ”和“ sangerseqR ”。
Bioconductor提供了软件包“ sangerseqR ”，该软件包用于从二进制测序文件中提取相对荧光单位（RFU）中的荧光信号强度（FI）。所述包“ pracma ”提供了函数“ peakfind ”。基本的R- package集合中不包含“ pracma ” 。

if （！requireNamespace （“ BiocManager ”，静默= TRUE））

install.packages（“ BiocManager”）

BiocManager :: install（version =“ 3.11”）

install.packages（“实用”）

install.packages（“ sangerseqR”）

为您的FIDE实验创建一个文件夹作为工作目录。
将CE / LIF二进制数据文件移动到此文件夹。
将实验文件夹设置为当前R会话的工作目录。活动会话期间生成的所有文件将保存在该位置。

setwd （“ / folder1 / folder2 /…/ myExperimentFolder ”）

上载下游分析所需的所有软件包。

图书馆（“实践”）

库（“ sangerseqR ”）

二进制CE / LIF-文件使用功能“上传到R-工作区read.abif从” “ sangerseqR内Bioconductor的提供”包。它们被转换为abif类对象，从该对象中提取CE / LIF原始数据（即，相对荧光单位（RFU））。

数据文件< -read.abif （“ myAbiFile ”）

ceData < -data.frame （datafile @data$DATA.1 ，datafile @data$DATA.2 ，

datafile @ data $ DATA.3，datafile @ data $ DATA.4）

分析和处理CE / LIF原始数据。
可视化电泳图。

plot（ceData [，1]，类型=“ l”，col =“蓝色”，xlab = “ EM”，ylab =“ FI / RFU”，main =“原始数据”）

行（ceData [，2]，col =“绿色”）

lines（ceData [，3]，col =“ orange”）

线（ceData [，4]，COL = “暗红色”）

图例（“ topleft ”，c（“ 1”，“ 2”，“ 3”，“ 4”），fill = c（“ blue”，“ green”，“ orange”，“ darkred ”））

选择适当的轨迹并将通道号传递到R环境。

trace < -traceNumberForAnalysis （注意：参数是一个真实的整数）

执行基线校正（请参见注释9）。

dataBg < -ceData [，trace]-中位数（ceData [500：2000，trace]）

识别峰（请参见注释10）。

峰值< -data.frame （findpeaks （dataBg ，阈值= 50，minpeakheight = 100，零=“-”））

colnames （peaks）<-c（“ height”，“ max”，“ start”，“ end”）

积分峰面积。

面积<-c（）

for（i in 1：nrow （peaks））{

开始<-峰[i，3]

停止<-峰[i，4] -1

sum < -sum （dataBg [ start：stop ]）

面积<-舍入（c（area，sum ），0）

}

结果< -data.frame （峰，面积）

在R控制台中查看结果。

结果

将结果写入文件。

myOutName <-“ myNameForResults ”

write.table （data.frame （NUM = rownames （结果），结果），文件=粘贴（myOutName “.TXT”，月= “”），追加= F，九月= “\ t”的，癸=”。 “，row.names = F，col.names = T，引用= F）

可视化CE配置文件中的峰（图2）。

情节（peaks [peaks ,, 2]，peaks [，1]，type =“ h”，col =“ red”， xlim = c（1000，1700 ），

ylim = c（0，max（dataBg ）+200），xlab =“ EM”，ylab =“ FI / RFU”）

文本（峰[2]，峰值[1] 150，rownames （峰），CEX = 1）

lines（dataBg，type =“ l”，col =“ black”）

将图保存到文件。

pdf（file = paste（myOutName ，“ .pdf”，sep =“”）））

情节（peaks [peaks ,, 2]，peaks [，1]，type =“ h”，col =“ red”， xlim = c（1000，1700 ），

ylim = c（0，max（dataBg ）+200），xlab =“ EM”，ylab =“ FI / RFU”）

文本（峰[2]，峰值[1] 150，rownames （峰），CEX = 1）

lines（dataBg，type =“ l”，col =“ black”）

dev.off （）

图2 。基于R的数据分析输出。A.处理后数据的所有峰的表格表示，指定高度，最大（最大），起始，终止和峰面积。B.所述的剧情电泳（FI = F（EM））。FI =荧光强度；RFU ＝相对荧光单位；EM =电泳迁移（请参见注释11）。

峰分配。
在分配的不同峰的电泳用荧光团修饰的尺寸标准的帮助下执行的寡核糖核苷酸（见材料和试剂，分项I.寡核糖核苷酸）。我们建议使用四个FAM衍生的RNA寡核苷酸，其核苷酸长度分别为13 nt ，22 nt ，37 nt和44 nt。可以将少量的四个RNA （每个4 fmol ）掺入样品中，并用于推断每个RNA物种的nt长度。如图3A所示，标记寡核糖核苷酸的电泳迁移在宽的分离范围内是线性的。图3B显示了“掺入” FIDE U缺失检测的典型示例，图3C显示了U插入和U缺失检测的代表性FIDE结果，其中每个RNA的同一性和nt长度-species已指定。

计算编辑活动。
为了比较不同的样品，存在几种定义和计算RNA编辑活性的可能性（请参见注释12）：

完全编辑的RNA产物的峰面积与所有指定峰的总和之比。
所有连接的RNA产物在所有指定峰上的峰面积比。
与所有指定峰相比，所有已加工RNA物种的峰面积比。
所有处理过的RNA种类的峰面积比与RNA输入峰的面积之比。

图3.代表性的FIDE结果。一。上图：CE / LIF分离10个大小标准的寡核糖核苷酸（从13 nt至44 nt）的电泳图。下图：标记RNA寡核苷酸相对于其电泳迁移率（EM）的分子量（MW）的图。数据点的线性拟合得出R平方（r 2 ）为0.995。B.代表电泳用FIDE U形缺失分析（绿色迹线）的“掺入入”标记的RNA寡核苷酸13个核苷酸，22个核苷酸，37个核苷酸和44个核苷酸的长度（黑色迹线）。C. FIDE U插入（左）和U删除（右）测定的典型电泳图。各个峰的分配方式为：RNA输入，反应中间体，部分编辑的RNA，完全编辑的RNA产物和副产物。数字指定了不同RNA种类的nt长度。FI ＝荧光强度。RFU =相对荧光单位。

对标准FIDE协议的修改

A.高通量国际棋联

对于高通量筛选（HTS）应用，可以缩小FIDE的比例，以使该测定法适合多孔板。两种编辑反应的下限均约为5-10 fmol ，每个编辑体和荧光团修饰的pre-mRNA / gRNA杂交体的反应量均≤5µl。由于样品中蛋白质和RNA的含量很少，可以通过直接添加Hi- Di TM甲酰胺来终止反应。这可以方便地消除CE / LIF分离之前的苯酚萃取和EtOH沉淀步骤。此外，FIDE只能使用部分纯化的线粒体提取物作为编辑体来源进行。由于存在RNase，这就需要使用“硫代磷酸酯” （PS）修饰的材料，因此需要使用“材料和试剂”部分中指定的耐RNase的底物寡核糖核苷酸。

B. “一锅法” U插入和U删除编辑- “矩阵化”

FIDE的显着优势是可以同时监视U插入和U删除反应。可以简单地通过对两个底物RNA使用不同的荧光团来完成此操作（请参见材料和试剂，I。寡核糖核苷酸）。但是，由于荧光染料的发射光谱通常会扩散到CE / LIF检测器的多个通道中，因此需要额外的数据处理步骤。此过程称为“矩阵化”（Gidddings等，1993； Gidddings等，1998）。对于这两个荧光标记的寡核糖核苷酸，必须在被分析分开，即，单重CE / LIF-运行（见注13）。在对原始数据进行基线校正之后，每个检测器通道（i -n ）中两个荧光团的荧光强度（FI）计算为：FI通道（i ）/ ΣFI通道（i- n）。使用补充材料部分中提供的R脚本“ matrix.fun ”，可以方便地从二进制CE / LIF文件创建矩阵。使用以下命令将该函数加载到工作空间中：

源（“ pathToScript / matrix.fun.R ” ）

必选参数是一个字符向量，其中包含单工CE / LIF文件的名称：

myMatrix的< - matrix.fun （C（ “ myFileDye1 ” ，“ myFileDye2 ” ））

该矩阵被存储为制表符分隔的文本，并且可以用于相同的CE / LIF-设备上运行的所有多路复用FIDE的测定法。

多重FIDE分析的数据分析

矩阵化
读取二进制CE / LIF文件以读取R并提取原始数据，如：数据分析1-7中所述。
如果已在另一个R环境中创建矩阵，则将矩阵文件上载到工作区。

myMatrix < -data.matrix （read.delim （“ pathAndNameOfMatrixFile ” ，header = FALSE））

执行基线校正。

对于（i in 1：ncol （ceData ））{

ceData [，i ] < -ceData [，i ]-中位数（ceData [500：2000，i]）

}

负值的矩阵化和校正。
对于（i in 1：nrow（ceData ））{

ceData [ i ，] = data.matrix （ceData ）[ i ，]％*％t（solve（myMatrix ））

}

ceData < -replace （ceData ，ceData <0，0）

峰检测和定量
在将迹线编号传递给R之后，按照单重FIDE / CE测定法（请参阅数据分析8，d- i ）中的描述，将U删除和U插入测定与相应的迹线分开进行分析。

trace < -traceNumberForAnalysis分别用于U缺失或U插入测定的染料通道号。（注意：该参数是一个真实的整数）。

dataBg < -ceData [，trace]

按照以下内容继续操作：数据分析，8，d- i 。

C.双荧光FIDE

通过使用5'-荧光团衍生的5'-mRNA寡核苷酸和同时使用3'-荧光团标记的3'-mRNA寡核苷酸，可以在一个实验中监测两个mRNA前片段的反应途径。可以对U插入和U缺失反应进行同样的操作，相应的寡核糖核苷酸列在“材料和试剂”部分。在这种情况下，不同的RNA-寡核苷酸的序列衍生自布鲁氏锥虫的线粒体ATP合酶（A6）的编码mRNA的前mRNA 。类似地，可以通过使用5'-荧光团修饰的gRNA-寡核糖核苷酸来追踪gRNA的反应途径。

笔记

对于CE / LIF仪器，我们仅使用化学等级最高的试剂。举例来说，我们使用LiChrosolv ® -H 2 O代表清洁的目的和用于稀释CE / LIF缓冲区。高度去离子的甲酰胺（Hi- Di TM甲酰胺）用于样品制备。
Editosomes不能商业购买。他们需要从昆虫阶段的非洲纯化锥虫（锥虫布氏在无菌细胞培养（培养）布伦和Schönenberger ，1979）。将复合物或者通过串联亲和纯化（TAP）使用转基因纯化T.布氏细胞有条件地表达的TAP标记的变体线editosomal蛋白（戈拉斯等人，2009;杰拉切和Moazed ，2015）或从线粒体去污剂提取物野生型锥虫（Böhmet al。，2012）。典型地，5升数中期的T.布氏细胞培养物（5×10 10 -8×10 10个细胞）产率约50微克TAP纯化的editosomes 。相同数量的细胞可产生约0.5 mg的具有编辑活性的线粒体蛋白质提取物。通过考马斯亮蓝G-250结合（Bradford测定法[Bradford，1976]）测定蛋白质浓度。
使用2'-O-（叔丁基）二甲基甲硅烷基（TBDMS）保护的亚磷酰胺，在固孔玻璃（CPG）-珠上通过固相化学合成法合成RNA-寡核苷酸。200 nmol的合成规模通常可产生≥200 µg的纯寡核糖核苷酸。RNA寡核苷酸应该是高效液相色谱法（HPLC）通过反相或阴离子-纯化任一交换HPLC和通过质谱证实。我们还建议仔细检查8 M含脲的聚丙烯酰胺凝胶中合成RNA的纯度。荧光团修饰被引入不同寡核糖核苷酸的5'-或3'-末端。这可以共存或后合完成。应避免使用内部荧光团标记策略来维持RNA分子的碱基配对能力。我们还建议在荧光基团和RNA之间引入接头序列，例如六亚甲基接头，以最大程度地减少与核碱基的空间冲突。许多荧光团可以用作取代基。具体选择取决于上的激光诱导荧光（LIF） -检测系统的波长规范。实例包括5-羧基四甲基-罗丹明（TAMRA），6-六氯-荧光素（HEX），6-羧基-荧光素（FAM），所述磺基-cyanine染料Cy5和Cy5.5的以及红外荧光染料IRDye800和WellRedD1。可以引入其他修饰，例如硫代磷酸酯骨架修饰，以增加不同RNA的RNase稳定性。通过引入3'-末端的六亚甲基-氨基接头可以抵消3'-末端的核酸外降解。代表3'-pre-mRNA片段的寡核糖核苷酸需要使用T4-多核苷酸激酶（T4-PNK）和ATP引入5'-磷酸基团。
根据在260 nm （A 260 ）波长下的紫外线吸收率测量值计算出RNA浓度。对于不同的RNA的摩尔消光系数（ε）可以从最近的邻居来导出使用计算OligoAnalyzer ® ：工具在www.idtna.com/scitools。可以借助NanoDrop型紫外分光光度计仪器进行测量。寡核糖核苷酸浓度≥0.2µg / µl和≤2.5µg / µl恰好在仪器的动态线性范围内，可产生可靠的测量结果，而无需使用更敏感的基于报告荧光团的方法。寡核糖核苷酸被存储在TE缓冲液（pH为7.5 ）（见ř ecipes）在-20℃下以100μM的浓度。
在单独的设置中，有必要确认和定量三聚体gRNA / pre-mRNA杂交RNA的形成/产量。为此，将0.4 nmol的荧光标记的5'-pre-mRNA Cl-寡核糖核苷酸，3'-pre-mRNA Cl-寡核糖核苷酸和相应的gRNA结合起来。如上所述，将样品热展开并退火（步骤1c）。加入含有2 mM MgCl 2的6 ×天然PAGE凝胶上样缓冲液，并将样品分离为18％（w / v）聚丙烯酰胺凝胶（凝胶尺寸：7.2 cm × 8.3 cm × 0.1 cm）。在4°C和8 W（恒定）的TBE （pH 8.3 ），2 mM MgCl 2中运行凝胶，直到溴酚蓝标记物到达凝胶底部为止。作为对照加载所有3个寡核糖核苷酸独立地和任选地所述RNA寡核苷酸的所有双分子组合。染色/脱色凝胶（配方2和3），并通过光密度测定法确定gRNA / pre-mRNA杂合体形成的程度。在大多数染色材料（≥90％）的应出现在频带与最低电泳迁移率，其表示三聚gRNA /前体mRNA杂交。单体寡核糖核苷酸应忽略不计。典型结果如图4所示。
所需的量editosomes和温育时间将取决于具体的编辑活动的的（EA）（EA /蛋白质量）editosome制备。在我们的手中，在FIDE U缺失检测中，通常在60分钟内，将50 ng TAP提纯的编辑小体产生完全编辑的产品的≥20％。
延长注射时间可能会导致峰值异常/伪影（Johansson等人，2003）。
使用代码/程序员类型的文本编辑器，并注意R区分大小写。
用于背景校正数据区域适于将CE / LIF-ABI PRISM ® 310 DNA-测序用50厘米的玻璃毛细管，并且可以被调整用于其它CE / LIF的仪器。
“阈值”和“最小峰值”的设置将影响峰值检测的灵敏度。
可以组合使用这些命令以批量处理多个文件。根据作者的要求提供了脚本。
对于方法I-III，如果处理的底物少于50％，则比率与编辑活性线性相关。方法IV显示较高的动态范围，但与编辑活动没有线性关系。方法III和IV不能说明连接活性，即缺乏连接酶活性的编体制备被认为是有活性的。
它的本质是，CE / LIF-的峰值电泳低于饱和。这可能需要以更高的稀释度重新运行样品。

图4.指导RNA / pre-mRNA底物形成。用于U插入反应（A）和U删除反应（B）的gRNA / pre-mRNA杂合RNA形成的凝胶电泳验证。两种PAA凝胶从左到右显示了荧光团标记的5'-pre-mRNA裂解片段（5'-Cl），3'-pre-mRNA裂解片段（3'-Cl）和相应的gRNA-寡核糖核苷酸紧挨着两个双分子复合物（5'-Cl / gRNA; 3'-Cl / gRNA）和最后的三分子（5'-Cl / 3'-Cl / gRNA）编辑底物（带框的箭头）。三聚体RNA的产率应超过90％。荧光团取代基显示为化学环系统。

菜谱

TBE缓冲液，pH 8.3
89 mM Tris- （羟甲基）-氨基甲烷

89毫米B（OH）3

2 mM Na 2 EDTA

苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）
苯酚/ CHCl 3 /异戊醇（25/24/1）[v / v / v]

凝胶染色液
H 2 O中的7.5％（v / v）HOAc

0.1％（w / v）甲苯胺蓝O（C 15 H 16 ClN 3 S）

凝胶脱色液
10％（v / v）甲醇

1％（v / v）HOAc

TE缓冲液，pH为7.5
10 mM Tris / HCl ，pH 7.5

1 mM Na 2 -EDTA

3 × RNA编辑反应混合物
60 mM HEPES / KOH ，pH 7.5

30毫米MgCl 2

90毫米氯化钾

1.5毫米DTT

1.5毫米ATP

0.3 mM的UTP

2 ×变性PAGE凝胶加载缓冲液
1 × TBE缓冲液，pH 8.3

尿素800万

0.01％（w / v）溴酚蓝（C 19 H 10 Br 4 O 5 S）

0.01％（w / v）二甲苯氰FF，Na +-盐（C 25 H 27 N 2 NaO 6 S 2 ）

6 ×天然PAGE凝胶加载缓冲液
10 mM Tris / HCl ，pH 7.6

0.03％（w / v）溴酚蓝，Na +-盐（C 19 H 10 Br 4 O 5 S）

0.03％（w / v）二甲苯氰FF，Na +-盐（C 25 H 27 N 2 NaO 6 S 2 ）

60 mM Na 2 EDTA

60％（v / v）甘油

致谢

这项工作由德国研究基金会（DFG-GO 516 / 8-1）和伊灵博士-分子化学基金会资助。我们感谢克里斯蒂安·坎波，保罗Reißig ，罗伯特Knieß和Andreas沃尔克实验输入。Del Campo等。（2020 ）是该协议的原始文件。

利益争夺

作者没有竞争利益要声明。

参考

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