材料和试剂

用于芯片上的3D微结构制造

1.胶带（3M，目录号：1183 ）
2. Ç hromium图案化的底板（长沙韶光铬版公司，中国）
3. ITO顶板（中国珠海凯沃光电技术有限公司）
4. I异丙醇，缩写为IPA（Fisher Chemical，目录号：182060）
5.丙酮（Fisher化学公司，Ç atalog数：183005R）
6. Milli-Q水（18.2MΩ）
7. SU-8 3010（MicroChem ，目录号：17120963）
8. SU-8 2050（MicroChem ，目录号：17070500）
9. SU-8显影剂（MicroChem ，目录号：18090763）
10. Amorhpous氟塑料溶液（6％Ť EFLON溶液）（Chemours，目录号：1706ES0014）
11. N 2 （中国骏宇公司）
12. FC-40（3M，目录号：20051）
用于细胞悬浮液的制备

1.细胞培养6孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：172931）
2.细胞培养9个6孔板（Corning，目录号：3599 ）
3. 1.5 ml离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339650）
4.乳腺癌细胞系MDA-MB-231（ATCC ，目录号：BNCC245095 ） 5. RPMI 1640x基本介质（Gibco，目录号：11875-093） 6.胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10270-106）
7.胰蛋白酶（Gibco，目录号：25200-056）
8.普朗尼克® F127 ，简称为F127 （西格玛- Aldrich公司，CAS号：9003-11-6 ）
9.顺铂（Sigma ，目录号：P4394）
10. EthD-1（Thermo Fisher Scientific，目录号：E1169 ）
11.细胞计数试剂盒8（CCK-8）（上海同仁堂）
用于芯片上的单细胞捕获

1.移液器吸头10μl （Eppendorf，目录号：0224930000）
2.移液器吸头200μl （Eppendorf，目录号：022491296）
3.硅油（Clearco ，CAS号：107-51-7）
设备

等离子清洁器（ABM，型号：MR-200S）
紫外线（ABM，型号：ABM -350J ）
热板（墙垣我nstrument，型号：BX-1 ）
激光切割机（ZKJ Laser，上海）
洁净工作台（蓝丝P urification ，型号：蓝丝-GZ-01 ）
细胞培养箱（热˚F isher ，型号：免缝-CYCLE I160 CO 2培养箱）
移液器（Eppendorf ，Research plus单通道可调范围移液器）
显微镜（奥林巴斯，型号：BX63F ）
细胞仪（Mini，达克威，中国）
酶标仪（Thermo F垫圈，ID号：IED0501003M ）
旋涂机（KW-4A ，SETCAS电子公司，中国）
软件

Auto CAD 2017 （Autodesk公司）
图片J（NIH政府）
程序

单细胞捕获方案可分为4个部分：3D微结构设计，芯片上3D微结构构建，细胞悬浮液制备以及带有表面活性剂的油膜，用于单细胞捕获。最后部分由数字微流体系统完成。每个部分的详细协议如下：

3D微结构设计
我们使用AutoCAD设计微结构。微观结构包括重复结构阵列（图1）。图1显示了黄色帧中的单一结构，其包括四个壁（矩形框或多个），每一个为7的宽度微米，20的长度微米，和2.5的小间隙微米（˚F igure 1，右）在每个墙的末端之间，在墙之间形成一个半封闭的井。设计的微结构用于生产用于以下光刻实验的掩模。

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图1.使用Auto CAD进行单细胞培养的设计结构

用于芯片上的3D微观结构制造
DMF芯片由三部分组成：底板，顶板和导电胶布，作为连接顶板和底板的垫片。我们使用autoCAD设计电极图案。然后，铬电极（Cr）由中国长沙韶光铬版公司购买，并在玻璃板上构图。ITO顶板购自中国珠海凯沃光电技术公司。图2显示了底板和顶板的制造过程以及带有垫片的底板和顶板的组装过程。

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图2 。底部（AD）和顶部板（EF）的制造过程。（G）用隔板组装底板和顶板以形成DMF芯片

详细协议如下：

涂层10微米SU-8层上的底板作为介电层。
对设计的铬制图案底板进行等离子处理1分钟（将板放置在等离子清洁器设备的腔室中。首先，先对板进行真空处理，然后再进行氧气处理，然后将板表面电离。此过程是称为等离子体处理。该等离子体处理的板将促进SU-8和板。之间的键合等离子处理是一种非常常见的微细加工领域中使用的技术。）。
倾SU-8 3010 （4米升）在所述底板上以覆盖约1/3面积的芯片。
用旋涂机以500 rpm，5 s和依次3,000 rpm，30 s的速度旋涂（步骤如下：将过量的SU-8溶液倒入玻璃基板，然后高速旋转以分散SU-8溶液通过离心力直到溶液旋转掉玻璃基板和SU-8膜的所需厚度的边缘实现）。
在65 °C下将芯片烘烤3分钟，在热板上在95 °C下烘烤5分钟。
通过紫外线照射18.5 s，用掩模对准器对介电层进行精确的图案化。
在热板上将芯片在65 °C下烘烤3分钟，然后在95 °C下烘烤3分钟。
用SU-8显影剂将芯片显影1分钟（将板浸入SU-8显影剂溶液中。UV曝光后，掩模上的透明部分将有助于UV光直接照射板，并增强SU-8与显影剂之间的结合力该板。显影后，将透明部件的掩模上的图案将被打印为在板SU-8膜，而掩模上的不透明部分的图案将不被打印并洗涤掉。）。
涂层60微米厚度SU-8的芯片作为围栏以防止液滴从漂流。
底板的等离子体处理1分钟。
倾SU-8 2050 （4米升）在所述底板上以覆盖约1/3面积的芯片。
使用旋涂机以500 rpm，5 s的速度旋涂，随后以2500 rpm，30 s的速度旋涂。
在65 °C下将芯片烘烤3分钟，在95 °C下在热板上烘烤10分钟。
通过紫外线曝光13.5 s，使用掩模对准器进行精确图案化。
在热板上将芯片在65 °C下后烤3分钟，然后在95 °C下后烤5分钟。
用SU-8开发人员将芯片开发5分钟。
将10μm厚的SU-8层涂覆为微结构阵列，以进行单细胞培养。
底板的等离子体处理1分钟。
倾SU-8 3010 （4米升）在所述底板上以覆盖约1/3面积的芯片。
使用旋涂机以500 rpm，5 s的速度旋涂，然后以3,000 rpm，30 s的速度依次旋涂。
在65 °C下将芯片烘烤3分钟，在热板上在95 °C下烘烤5分钟。
通过掩模对准器通过UV曝光18.5 s进行精确图案化。
在热板上将芯片在65 °C下烘烤3分钟，然后在95 °C下烘烤3分钟。
用SU-8开发人员将芯片开发1分钟。
在底板和顶板上都涂上聚四氟乙烯。
制备0.5％的碲氟里昂溶液百米升（使用FC-40稀释6％特氟隆溶液至0.5％）。
W¯¯灰底板和顶板用5米升IPA和5米升的MilliQ -水。
B用N 2将底板和顶板低干。
d RY切断顶板和底板用H OT板在100 ℃下。
Ç OOL向下吨他顶板和底板，在室温下。
使用移液管转移的足够量的0.5％吨EFLON溶液（约1米升），以覆盖所述底板和顶板。
小号针外套吨他底板和顶板为500rpm下，10秒，并依次以1000rpm，60秒用旋涂机。
在185 °C的热板上烘烤底板和顶板10分钟。
3D微观结构的SEM图像结果如图3所示。

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图3 。设计的3D微结构的SEM图像结果

芯片组装
Ť他DMF芯片由底板，间隔的（制成胶带），以连接两块板，以及顶板，如图的插入实像˚F igure 4.底板是的主要部分DMF芯片。一系列的铬电极的设计和在玻璃板上，其用于液滴操作制成由充电电极或没有吨。我们也称其为底板。1.5毫米直径的孔被钻出在顶板通过激光切割机对样品加载（图插入的图像4 ）。芯片图案的示意图如图4所示，包括样品的装载位置，具有用于细胞培养的微结构的电极和其他电极，以帮助样品移至细胞培养点。图4中的所有细胞培养点均包含图3 SEM图像所示的半封闭孔系统。图4中的灰色液滴表示药物或细胞培养悬液从移液器吸头到细胞培养隔室之一的行程。
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图4 。芯片图案方案与组装芯片图像

细胞悬液制备
1. d iscard的介质瓦特母鸡的MDA-MB-231细胞生长至90％的密度在6孔板。
2.添加0.5毫升胰蛋白酶到孔板振摇润湿全井，吨母鸡丢弃胰蛋白酶孵育37 ℃下在细胞培养箱1分钟。
3.向孔板中加入0.5 ml RPMI 1640培养基（补充10％FBS）。
4.使用一个p ipette到细胞悬浮液转移到1.5毫升无菌的离心管中。
5. Ç指望。2-15细胞浓度与Cellometer并调节细胞浓度至8×10 5个细胞/ ml用RPMI 1640培养基。
6.将F127以0.01％的百分比添加到MDA-MB-231细胞悬液中。
具有表面活性剂的油膜，可将单细胞捕获在芯片上
1. ˚F生病了空间B切口白内障手术挽下部，并用石油芯片顶部板通过移液管。
2. P ipette 0.6微升液滴（8×10 5含0.01％的Pluronic F127到孔MDA-MB-231细胞/ ml）和移动细胞的液滴通过顺序充电相邻电极到虚拟室（图5显示了DMF系统：使用电子控制系统控制DMF芯片的电荷，每个电极通过在芯片上构图的铬线连接到在DMF芯片边缘构图的接触电极焊盘，并进一步连接到控制电子面板通过跨接线连接器。将电源连接到控制电子设备。控制板上的物理继电器用作打开或关闭每个电极充电的开关。命令从计算机软件通过蓝牙发送到电子控制装置）。所有操作均在洁净台上进行。
3. P花边吨他芯片在加湿培养箱（37℃，5％CO 2 ）长期-t IME立方米lture （24小时）。
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图5 。系统设置。DMF系统由四部分组成：DMF芯片，电子控制系统（电源，信号发生器，PCB板和连接器），自写控制软件和荧光显微镜。

图6是图4中“细胞培养点”的隔室的示例图像。每个圆圈是此图像中的一个单元。每个界面下方的3D微结构的限制会由于界面张力而迫使该界面曲面形成弯曲界面，从而促进了单细胞捕获。单元格位于半封闭井中，如图6所示。

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图6 。具有设计的3D微结构的单细胞培养的图像结果

例如在b reast抗癌药毒性试验
DMF芯片的药物毒性测试

用移液器在机油的底部和顶板之间充满油。
吸管0.6微升液滴（8×10 5 MDA-MB-231细胞/ ml）含有0.01％的Pluronic F127和2 μM EthD-1和氯氨铂溶液（0.6微升）在一系列浓度的插入孔中并移动到虚拟室通过顺序充电相邻电极并在DMF芯片上混合。所有操作均在干净的工作台上进行。
将芯片放在潮湿的培养箱中（37°C，5％CO 2 ）进行长期培养（24 h）。
在显微镜下测量细胞的红色荧光。

药物毒性试验片外

种子MDA-MB-231细胞（1.0 X 10 4细胞/孔，100微升RPMI 1640培养基中增刊我é d有10％FBS ）的96孔板中12小时。
丢弃培养基，移液管的一系列顺铂浓度（的100微升）以一式三份各浓度小号到96孔板并培养24小时。
添加10 μ升CCK-8溶液以每孔并孵育0.5小时。
测量450nm处吸光度每孔的用一个微板读数器。
在被示出的MDA-MB-231细胞顺铂药物毒性结果˚F igure 7。

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图7.对MDA-MB-231乳腺癌细胞的顺铂（Cis）药物毒性测试。A.在芯片上的荧光为0的图像效果μM ，10个μM顺式处理的MDA-MB-231细胞24小时。B.芯片上/芯片外（96孔板）的经Cis处理的MDA-MB-231细胞的药物毒性测试结果。

致谢

这项工作得到了澳门科技发展基金（FDCT）[FDCT110 / 2016 / A3，FDCT 0053/2019 / A1，AMSV SKL基金]的支持；澳门大学[MYRG2017-00022-AMSV，MYRG2018-00114-AMSV]。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

参考文献

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翟，J.，李，H.，黄，AH H.，侗，C.，彝，S.，贾，Y.，麦，P一，邓C. X.和马丁斯，RP（2020 ）。具有3D微结构的数字微流体系统，用于单细胞培养。微系统纳米工程6（1）：6。