材料和试剂

1.5 ml 微量离心管（Eppendorf，目录号：0030120086）
15 ml离心管（Falcon，康宁，目录号：352196）
24 - 孔板（CytoOne ，STARLAB ，目录号：CC7672-7524）
96个平底板（CytoOne ，Starlab ，目录号：CC7672-7596）
96 - 孔平/半区域的组织培养群集板（Corning，目录号：3697）
铝合金箔
疟原虫knowlesi A1-H.1 野生型（迈克·布莱克曼，弗朗西斯·克里克研究所伦敦）（月亮等人。，2013）
达菲阳性（Fy +）人类红细胞
RPMI -1640介质（Sigma-Aldrich，目录号：R5886）
L-谷氨酰胺（Sigma，目录号：G7513-100ML），- 20 °C
碳酸氢钠（Sigma -Aldrich ，目录号：S5761）
葡萄糖（Sigma，目录号：G7021）
次黄嘌呤（Sigma -Aldrich ，目录号：H9636）
Albumax II（Gibco，目录号：115603 76）
马血清（PAN BIOTECH，目录号P30-0711），-20 °C
Nycodenz （Progen ，目录号：1002424），室温
室温下的多聚甲醛（皮尔斯16％甲醛[ w / v ] ）（Thermo Fisher，目录号：28906）
PBS片剂（MP 生物体检TM ，目录号：MP2810305），室温下
I 级Glutara 乙醛溶液，在水中25％（Sigma -Aldrich ，目录号：G5882-10X1ML）
Triton X-100（Roche，Sigma，目录号：11332481001）
核糖核酸酶A（MP Biomedicals TM ，目录号：0219398050）
SYBR ® 绿色我核酸凝胶染色（Life Technologies公司，Sigma-Aldrich公司，目录号：S9430-5ML）
三HC 升，氨基丁三醇® 盐酸盐溶液的1M ，pH 8.0中，（Sigma-Aldrich公司，目录号T3038-1L）
L-乳酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：71718）
3-乙酰基吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD）（Sigma-Aldrich，目录号：A5251）
吩嗪乙硫酸盐（西格玛奥德里奇，目录号：P4544）
硝基四唑鎓片（Sigma-Aldrich，目录号N5514）
4- [7-[（二甲基氨基）甲基] -2-（4-氟苯基）咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基]嘧啶-2-胺；大院2（Michael Blackman，英国伦敦弗朗西斯·克里克学院（Francis Crick Institute）
心肌黄酶从梭菌klyveri （Sigma-Aldrich公司，CATAL OG号：D5540-1.5KU）
不含谷氨酰胺的定制改性RPMI介质（生命技术品牌，请参见食谱），4 °C
固定剂：4％低聚甲醛和0.4％戊二醛（请参阅食谱）
LDH底物缓冲液，pH 7.5（请参见配方）
硝基蓝四唑（NBT）解决方案（请参阅食谱）
3-乙酰基吡啶腺嘌呤D 核苷酸（APAD）储备溶液（10 mg / ml）（请参阅食谱）
心肌黄酶储备溶液50单位/毫升（请参阅食谱）

设备

Becton Dickenson LSR-II 流式细胞仪或同等功能
具有100x油镜的立式双目复合光学显微镜
多道移液器（8通道移液器，30-300 μ 升）（ErgoOne ® ，目录号：S7108-3300）
平板离心机（Eppendorf ，型号：5810R，货号：5811000660）
Titramax 100平板振动筛（Heidolph Instruments，目录号：544-11200-00 ）
微孔板分光光度计Spectra Max 340P
二级微生物安全柜
-20 °C冷冻室
-7 0 °C冷冻室

软件

FACSDiva 6.1.3软件
FlowJo ，https: //www.flowjo.com/
流动软件，http：//flowingsoftware.btk.fi/
程序

解冻的协议疟原虫knowlesi A1-H.1寄生虫取决于寄生虫和需要的源极到与该冻结了样品的人来检查上。寄生虫维持在具有90％N的混合物除气的烧瓶中2 ，5％氧气2 和5％CO 2 在37 ℃下，监测通过使用吉姆萨染色的薄膜显微镜和寄生虫血症保持在0.5和10％之间。所有程序都需要使用无菌设备，材料和试剂以及无菌技术进行。所有涉及人类传染源的工作都必须遵守当地的安全政策。

寄生虫增殖测定
同步P. knowlesi 经由与纯化寄生虫Nycodenz
将5 ml的55％Nycodenz 工作溶液转移到15 ml的锥形管中，并加热到室温（注意1）。
离心机向下高寄生虫血症（4-10％）P. knowlesi 50ml培养用2％的血细胞比容，在900 ×g下在4分钟高制动/加速在室温下。
在RPMI中以50％的血细胞比容重悬寄生物沉淀。
小心放置2ml该文化性的ë到5毫升Nycodenz 在一个15毫升管。
在低制动/加速度下以900 xg离心12分钟（请注意注2）。
转移带褐色的共lored顶层裂殖到一个新的锥形管中并用RPMI洗涤，REM OVE Nycodenz （参见图2）。
将裂殖体与1μM 化合物2 在培养基中孵育2-3小时（请注意注释3）。
用RPMI （在室温高制动/加速下于900 xg离心4分钟）冲洗化合物2，然后将schi zonts 转移回培养物中（含2％的红细胞比容红细胞）。收获的裂殖体的数量取决于开始的寄生虫病和寄生虫的年龄（请参阅注4）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902764--1483 Robert Moon 837224 \ Figs jpg \ Figure2.jpg

图2 。SC hizont富集Nycodenz

在下面的CYCL E，当寄生虫再次到达裂殖体阶段，设置在乘法测定96 - 孔平板（参见图3的板布局）。
在96填写所有外井- 与100孔板微升RPMI或无菌水。这确保了内部井不受蒸发的影响。
75积垢微升单独的完全生长培养基（或载体对照）或用2x浓度的药物或抗体进行测试。如板布局所示，每孔接种75 µl寄生虫培养物。可以根据各个实验定制板布局（板布局见图1）。
用大约1 ％的寄生虫血症和4％的血细胞比容准备带有年轻裂殖体的培养物。
如步骤A1 所述，用Nycodenz纯化同步片段。
用1个沉淀体积的完全培养基重悬寄生虫沉淀至50％的血细胞比容。
准备含有4％红细胞的完整培养基（例如5 ml培养基+ 200μl 红细胞）。
将1 ％的schizonts 转移至培养基+ 4％的红细胞中（大约4-6 µl 的50％schizonts转移至5 ml ，这取决于浓缩的schizonts的寄生虫病，通常介于80％到90％之间）并充分混合。
通过计数至少400个细胞涂片检查来确认寄生虫病。
加入75 微升的文化为包含75个每孔微升媒体和混合用移液。
镀出150 微升未感染红血细胞（2％血细胞比容）作为对照的。
移液器向上和Dow混合n和转移50 微升的每个孔中，以一个新的96 - 孔平板。执行步骤A3。是否可以在接下来的30分钟内通过FACS或步骤A4测量寄生虫。如果寄生虫已固定并在1周后进行了测量（请参见注释5、6、7）。
孵育96 - 与孔板100 微升寄生虫培养物用于一个生长周期（24小时）标准寄生虫培养条件下（37 ℃，3％氧气2 和3％CO 2 和94％氮气）。
孵育24小时后，以及混合每50传送微升剩余100的μ 升培养到一个新的96 - 孔平板中。这是板2（最终寄生虫血症）。与继续小号TEP 甲3.如果寄生虫可以用FACS在接下来的30分钟内或与被测量小号TEP 甲4.如果p arasites是固定的，后测量长达1周（检查注释5，6，7 ）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902764--1483 Robert Moon 837224 \ Figs jpg \ Figure3.jpg

图3.板布局示例

准备用于流式细胞术的样品进行活细胞流式细胞术
准备过滤的PBS和PBS中SYBR Green I的1：5,000稀释液。
加入50 微升的SYBR Green稀释我的于50 微升寄生虫培养和孵化的在室温下恰好30分钟。
通过将40μl 染色的细胞添加到160μlPBS中，在过滤的PBS中稀释染色的培养物1：5，并在FACS机器上运行。
准备用于固定细胞流式细胞术的样品
在过滤的PBS中准备所有缓冲液[ 0.3％（v / v）Triton X-100，0.5 mg / ml核糖核酸酶A，SYBR Green I的1：10,000稀释液 ] 。
将50μl 的固定剂添加到50μl 的寄生虫培养物中，并在4 °C 孵育至少1 h或过夜。
在4 °C和763 xg 的台式离心机中对具有中等制动/加速设置的板将板向下离心4分钟。
除去上清液，并用100重悬细胞沉淀微升PBS中，并再次离心。
除去上清液，并用100μl 含0.3％（v / v）Triton X-100的PBS重悬细胞沉淀，并在室温下孵育10分钟。
用100洗两次微升PBS。
去除上清，重悬沉淀与100 μ 升 0.5毫克/毫升核糖核酸酶A在PBS中孵育在37 1个小时℃。
用100μlPBS洗涤。
除去尽可能多的PBS，然后用100μl1 ：10,000 SYBR Green重悬沉淀，并在室温下温育30分钟（始终保持SYBR Green管和染色细胞避光，并保持SYBR GREEN I的温育始终如一样本）。
再次将细胞重悬并稀释1：PBS中的5（转印40 μ l至新的96 - 160孔板μ 。升PBS 无需洗掉的SYBR Green I）。
将板保持在4 °C 并避光。在同一天通过FACS测量寄生虫病。
通过流式细胞仪记录排放
对于Becton Dickenson LSR-II，使用以下电压：
FSC 170 日志

SSC 209 日志

绿色激光530/30 488 F 360 日志

记录50,000-100,000个细胞/处理组。
将数据导出为fsc 文件格式。
分析流式细胞仪数据
将fsc 文件上传到FlowJo ，Flowing或类似的流式细胞仪软件。
打开点图对于每个孔96的- 孔板中。
在仅RBC的点图内，为RBC（R1）生成一个门，该门排除其他血细胞或破碎的红细胞。X轴为FSC-A，y轴为SSC-A（见图2）。
打开R1的直方图并生成寄生虫（H-2）的门。X轴是SYBR-Green信号530/30 488F-A，y轴是单元数。将纯红细胞对照与含有寄生虫的孔进行比较，以在x轴上找到需要分离红细胞和寄生虫的正确区域（图4）。对所有孔使用相同的浇口。
将数据另存为xls 文件，然后使用excel将其打开。
计算比率（H-2 / R1 * 100），然后减去仅RBC控制的比率。计算End（24 h孵育，板2 ）和Start（0 h孵育，板1 ）的比率，以确定繁殖率（图5中的示例）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902764--1483 Robert Moon 837224 \ Figs jpg \ Figure4--word.jpg

图4.流式细胞仪数据门控。在点图中，区域（R1，绿色）定义了红细胞。在直方图中分析该区域内的所有单元格。在直方图中，将区域（H-2）定义为将寄生虫与未感染的红细胞（RBC）分开。计算寄生虫/总红细胞的比例（（H-2 / R 1）* 100）以得出寄生虫血症。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902764--1483 Robert Moon 837224 \ Figs jpg \ Figure5--word.jpg

图5.乘法率的计算

寄生虫生长抑制活性（GIA）分析
同步P. knowlesi 的寄生虫经由Nycodenz 纯化（见步骤A1）或通过磁分离（Ribaut 等人，2008）。
设立GIA检测在96 - 孔板
板块应包括：
每个测试IgG浓度一式三份

阳性对照一式三份

仅含感染的红细胞和培养基的6个孔（0％GIA对照）

6孔未感染的红细胞，血细胞比容为2％（100％GIA对照/背景）

以非疟疾人抗体作为阴性对照的3个孔

镀出20 微升培养物用4％的血细胞比容和1.5％的寄生虫血症滋养体或只未感染RBC诠释ö96 - 孔平/半区域的组织培养群集板。
用Nycodenz 或磁铁纯化同步滋养体。
用1个沉淀体积的完全培养基重悬寄生虫沉淀至50％的血细胞比容。
在完全培养基（例如5 ml培养基+ 200μl 红细胞）中准备4％的红细胞悬液。
将纯化的裂殖体转移至含有4％红细胞的培养基（6μl 的50％裂殖体至5 ml）中，获得1.5％的寄生虫血症并充分混合。6 μ 升的50％裂殖对应于〜3×10个8 细胞。
通过计数血液涂片确认寄生虫血症。
加入20 微升的完全培养基中纯化的IgG的在2x浓度的孔中。根据EC 50 值（例如10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.15和0.075 mg / mL），使用大约8种最终浓度的连续1：2稀释的免疫血清或免疫前血清。在一式三份的测试孔中设置每种处理。
在标准培养条件下与跟踪培养一起温育一个周期（在P. Knowlesi 26-27 h中），并检查跟踪寄生虫和生命周期阶段。
收获前检查追踪培养的寄生虫血症（〜4％）和生命周期阶段（滋养体是理想的，幼虫没有足够的LDH水平）。
收获细胞。
通过向每个孔中吸取100μl 冷PBS 重悬每个培养物。
以1300 xg 的速度旋转培养物4分钟，并设置中等加速/破坏速度。
从所有孔中吸取100μl 上清液。不要抽吸任何RBC。将板从RBC沉淀物上倾斜会有所帮助。
重复小号TEPS BFI 到BFIII 一次。
如果不立即进行测定，请在-7 0 °C 冷冻- 否则就不需要这样做。
用乳酸脱氢酶（LDH）活性测定法测量寄生虫病
准备LDH缓冲液中的NBT溶液，并加热至室温。
如果板已经冷冻，则在室温下解冻至少30分钟。板需要均匀加热至室温。如果未冷冻培养板，则在测定前将RBC均匀悬浮是很重要的。
通过加入50准备完整的LDH底微升的3-乙酰基吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD）库存和200 微升黄递酶股票每10毫升NBT溶液。合并所有试剂后，请立即使用准备好的LDH底物。
启动定时器，并添加120 微升完全LDH基板的所有孔中。避免气泡（在拾取第一等分试样的底物之前完全压下多通道移液器的柱塞，移液器应吸出多余的底物，并且不会喷射出空气。移液器在孔口向下）并完全重悬RBC（摇板）在Titramax 在1分钟，并检查RBC丸粒完全消失）（最大值设置ç 赫克注8）。
在黑暗中孵育，以使颜色在室温下在平板振荡器上显影30至60分钟。
测量在650nm处的吸光度与96 - 孔微孔板分光光度计直到OD达到0.4 - 0.6 体-iRBC 和ICM控制（0％GIA）。
计算抑制百分比：100 - [（A 650 免疫样品的-阿650 仅RBC的）/（甲650 预免疫控制-甲650 仅红细胞）×100]。

笔记

5 米升NYCO denz 管需要为1μm纯化寄生虫升堆积的红血细胞在4-10％寄生虫血症（ê .G。，50米升培养维持在2％的血细胞比容和4-10％寄生虫血症将产生1米离心后收集的1 个包装的红血细胞）。将1 ml的培养基添加到1 ml的包装红细胞中，以使2 ml的培养物中含有50％的血细胞比容。
未感染的红细胞和环形阶段的寄生虫将沉入底部，裂殖体在Nycodenz的顶部形成一层。
化合物2是PKG抑制剂，可逆地阻断裂殖子的流出。该步骤是可选的，但将有助于最大程度提高后期裂殖子的产量，还为用户在后续步骤的时间安排上提供了一定的灵活性。如果孵育时间超过3小时，寄生虫的生存力将急剧下降。作为替代化合物2 化合物2高度特异性和有效的衍生物，称为ML10，也可被使用，其可购自LifeArc （Ressurrei 曹等人，2020）。
为了使寄生虫更加同步，让它们侵入红细胞30至60分钟，并再次用Nycodenz进行纯化，只有这次保持环形阶段的寄生虫沉淀并去除荆芥。您可以通过将寄生虫在室温下放置数小时来减慢寄生虫的衰老，以便在方便的时间使其进入裂殖体阶段以进行下一次纯化。
将所有实验设置为三个生物学重复（不同天数，寄生虫制备和RBC）。
一个。对于寄生虫增殖测定，设置纯化的裂殖体至关重要，因为这可以从寄生虫中去除残留的未感染的RBC，并使我们能够检查不同宿主RBC的增殖差异（例如，比较人和猕猴RBC的侵染）。

b。尽管应该为所有样品固定初始的寄生虫病，但获取寄生虫病的时间点0（即，用于增殖测定的平板1）仍然至关重要。这是因为起始寄生虫病的微小变化会对计算的增长率产生显着影响- 在样品之间使用不同的RBC也可以改变精确的起始寄生虫病。

虽然此处我们使用第二个24小时时间点，但根据实验目的，可以使用其他各种时间点。24小时的时间点效果很好，因为所有寄生虫都将受到入侵并再次发展为裂殖体，使用流式细胞仪可轻松识别。不利的一面是测量了显影环和滋养体的入侵效率和生存力。较短的时间点（例如2-6小时）可用于更具体地查看入侵和早期环形成，但是这些需要非常同步和后期的裂殖体，因为在指定的时间点尚未发展为形成新环的任何裂殖体将影响数据的解释。

固定的寄生物会聚集并更快地沉淀到板的底部，否则固定和未固定的样品之间不会产生明显的影响。
测定也可以在24设置- 以1ml终体积孔板中。
如有必要，请使用移液器重新悬浮，但这会带来气泡的风险。不要涡旋）。

菜谱

固定剂：4％低聚甲醛和0.4％戊二醛
10x PBS 5毫升

皮尔斯12.5毫升中的16％甲醛（w / v）

ģ lutaraldehyde 125 μ 升

H 2 O 32.5毫升

最终体积50毫升

LDH底物缓冲液，pH 7.5
要制备500 ml缓冲液，请混合50 ml 1 M Tris HCl（pH 8.0）和450 ml H 2 O
加入2.8克L-乳酸钠
加入1.25毫升Triton X-100
在室温下在磁力搅拌器上混合至少30分钟
制作50毫升等分试样并在-20 °C 冷冻
硝基蓝四唑（NBT）解决方案
从冰箱中取出一份50毫升的LDH缓冲液等分试样
预热至室温。
在50毫升试管中，将50毫升LDH缓冲液加入一粒NBT片剂（10 毫克）
覆盖与管铝箔，静置15分钟
不要摇动！轻轻混合
制得的溶液可以在黑暗中保持在4℃长达3周（覆盖有铝箔）
3-乙酰基吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD）储备溶液（10 mg / ml）
要准备10毫升的APAD储备溶液，请将100毫克的APAD溶于10毫升的蒸馏水中
存储在50分中的APAD原液μ 升在PCR管中的等分试样在-20℃下
心肌黄酶原液50单位/毫升
要制备Diaphorase储备溶液，请将1,500单位Diaphorase小瓶中的物质溶解在30 ml蒸馏水中。商店200 μ 升在-20℃下等份

完整的媒体
RPMI-1640（HEPES修改版，25 mM HEPES，不带L-谷氨酰胺，Merck），具有以下添加：

2.3 g / L碳酸氢钠（Sigma）

2 g / L葡萄糖（Sigma ）

0.05克/ 升次黄嘌呤（Sigma）

5克/ 升Albumax II（Gibco）

0.3 g / L L-谷氨酰胺（10 ml 200 mM溶液，1 L培养基，默克公司）

10％（vol / vol）马血清

无菌过滤器并在4°C下储存

致谢

这项工作得到了由英国医学研究理事会和国际发展部（RWM，FM）共同资助的MRC职业发展奖（MR / M021157 / 1）的支持（Basco 等，1995； Mohring 等，2019）。）。

利益争夺

作者宣称没有相互竞争的经济利益。

伦理

该项目，同意书和协议经LSHTM观察研究伦理委员会批准，项目编号为5520-1。

参考文献

Basco，LK，Marquet，F.，Makler，MM和Le Bras，J.（1995）。恶性疟原虫和间日疟原虫：乳酸脱氢酶活性及其在体外药物敏感性试验中的应用。Exp Parasitol 80（2）：260-271。
Bei，AK，Desimone，TM，Badiane，AS，Ahouidi ，AD，Dieye ，T.，Ndiaye，D.，Sarr ，O.，Ndir ，O.，Mboup ，S.和Duraisingh ，MT（2010）。一种基于流式细胞仪的方法，用于测量恶性疟原虫对红细胞的侵袭。美国血液学杂志85（4）：234-237。
Bhakdi ，SC，Sratongno ，P.，Chimma ，P.，Rungruang ，T.，Chuncharunee ，A.，诺伊曼，HP，Malasit ，P。和Pattanapanyasat ，K。（2007）。重新评估a啶橙用于疟疾感染啮齿动物中寄生虫血症的快速流式细胞计数。细胞计数法A 71（9）：662-667。
Genton先生，B.，AL- 压蔓，F.，Betuela ，I.，安德斯，RF，索尔，A.，Baea ，K.，Mellombo ，M.，Taraika ，J.，棕色，GV，派伊，D.，欧文（Irving），DO，费尔格（I. 在巴布亚新几内亚儿童中针对恶性疟原虫的三组分血液阶段疟疾疫苗（MSP1，MSP2，RESA）的安全性和免疫原性。疫苗22（1）：30-41。
S.Izumiyama，S.，Omura，M.，Takasaki，T.，Ohmae，H.和Asahi，H.（2009）。恶性疟原虫：使用SYBR Green I在流式细胞仪中开发和验证红细胞内生长的措施。Exp Parasitol 121（2）：144-150。
Kennedy，MC，Wang，J.，Zhang，Y.，Miles，AP，Chitsaz，F.，Saul，A.，Long，CA，Miller，LH and Stowers，AW（2002）。重组恶性疟原虫顶端膜抗原1（AMA1）的体外研究：AMA1疫苗的产生和活性以及多等位基因应答的产生。感染免疫70（12）：6948-6960。
卡拉姆（Karam），阿杜（Adu），B。，奥克兰（Ocran），J。，卡里卡里（Karikari），YS，阿杜阿曼夸（Adu-Amankwah），S。，恩蒂里（Ntiri），M。，阿布库克（Abuaku），B。，F.（2016）。肌内注射EBA-175 RII-NG疟疾疫苗在半免疫成年人中的安全性和免疫原性：一项1期，双盲安慰剂对照剂量递增研究。PLoS One 11（9）：e0163066。
MT的Makler和DJ的Hinrichs（1993）。测量恶性疟原虫的乳酸脱氢酶活性，以评估寄生虫病。美国临床医学杂志48（2）：205-210。
Mohring，F.，Hart，MN，Rawlinson，TA，Henrici，R.，Charleston，JA，Diez Benavente，E.，Patel，A.，Hall，J.，Almond，N.，Campino，S.，Clark， TG，Sutherland，CJ，Baker，DA，Draper，SJ和Moon，RW（2019）。疟原虫诺氏疟原虫的快速和迭代的基因组编辑为间日疟原虫的研究提供了新的工具。Elife 8：45829 。
Moon，RW，Hall，J.，Rangkuti，F.，Ho，YS，Almond，N.，Mitchell，GH，Pain，A.，Holder，AA and Blackman，MJ（2013）。遗传易感性疟疾病原体疟原虫对人类红细胞连续培养的适应性。美国国家科学院院刊110（2）：531-536。
帕切科，M. A.，马塔，N. E.，Valkiunas ，G.，帕克，P. G.，梅洛，B.，斯坦利，C. E.，Lentino ，M.，加西亚-阿马多，M. 甲。，Cranfield ，M.，Kosakovsky Pond ，S.L .和Escalante ，A.A .（2018）。血吸虫线粒体基因组进化的模式和速率：计时禽寄生虫的辐射。Mol Biol Evol 35（2）：383-403。
佩恩，R. O. ，丝绸，S. E. ，利亚，S. C. ，三浦，K.，迪乌夫，A.，丙氨酸，D.，金，J.，拉韦，G.，布莱恩，I. ，Poulton，I.，Griffiths，O.，Edwards，N.，Berrie，E.，Siani，L.，Douglas，A.，Roberts，R.，Vekemans，J.，Nugent，F.，Hill，A.。V. ，Long，C.，Lawrie，A.M . 和Draper，S.J . （2017 a ）。安全性和新颖的免疫原性P lasmodium恶性疟原虫血液阶段疫苗chad63-MVA RH5在IA的临床试验阶段。美国医学会杂志Hyg 95（5）：313-313 。
Payne，RO，Silk，SE，Elias，SC，Milne，KH，Rawlinson，TA，Llewellyn，D.，Shakri，AR，Jin，J.Labbe，GM，Edwards，NJ，Poulton，ID，Roberts，R。，Farid，R。，Jorgensen，T.，Alanine，DG，de Cassan，SC，Higgins，MK，Otto，TD，McCarthy，JS，de Jongh，WA，尼科西亚，A.，Moyle，S.，Hill，AV ，Berrie，E.，Chitnis，CE，Lawrie，AM和Draper，SJ（201 7 b ）。人间日间疟原虫达菲结合蛋白的疫苗接种诱导了超越菌株的抗体。JCI透视2（12）：e93683。
Ressurreição，M.，Thomas JA，Nofal SD，Flueck，C.，Moon，RW，Baker，DA，van Ooij，C.（2020年）。使用高度特异性的激酶抑制剂可快速，简单和精确地同步恶性疟原虫和诺氏疟原虫无性阶段寄生虫。bioRxiv 。doi.org/10.1101/2020.04.24.059493。
Ribaut，C.，Berry，A.，Chevalley，S.，Reybier，K.，Morlais，I.，Parzy，D.，Nepveu，F.，Benoit-Vical，F.和Valentin，A.（2008）。通过磁分离所有人类疟原虫物种的红细胞阶段进行浓缩和纯化。玛拉J 7：45 。
塞拉，马萨诸塞州，杜姆博，确定，库里巴利，D。，劳伦斯，MB，瓦塔拉，A。，通力，AK，Guindo，AB，特洛雷，K。，特洛雷，I。，库里巴，B。，迪亚洛，DA，迪亚拉，I.，Daou，M.，Dolo，A.，Tolo，Y.，Sissoko，MS，Niangaly，A.，Sissoko，M.，Takala-Harrison，S.，Lyke，KE，Wu，Y.，Blackwelder ，WC，Godeaux，O.，Vekemans，J.，Dubois，MC，Ballou，WR，Cohen，J.，Thompson，D.，Dube，T.，Soisson，L.，Diggs，CL，House，B.， Lanar，DE，Dutta，S.，Heppner，DG，Jr. and Plowe，CV（2011）。评估血液阶段疟疾疫苗的现场试验。英格兰医学杂志365（11）：1004-1013。
Xie L.，Li Q.，Johnson，J.，Zhang，J.，Milhous，W.和Kyle，D.（2007年）。使用自体荧光和YOYO-1检测啮齿类疟疾中寄生虫血症的流式细胞仪的开发和验证。寄生虫学134（Pt 9）：1151-1162。