[背景 ] 蛋白的Googleplex的配体结合的可能性，最好减少到聚焦组药物的命中，也可以询问在体外和体内以产生候选药物用于临床研究，使用计算化学方法。因此，正确使用准确的计算方法来估计潜在药物分子与蛋白质之间的结合能对于药物发现过程至关重要（Cournia 等人，2017）。想法是配体应优先结合蛋白质并抑制其功能。在这个协议中，您将学习浩W¯¯计算相对蛋白配体结合使用开源的自由能的工具和生物分子反应或相互作用动力学全球环境（BRIDGE）平台自由能（Senapathi 等，2019），这是建立在银河平台（Afgan et al。，2018）。两个配位体之间的自由能差异通过计算在硅片扰动从ë配体到另一个，因为它们是我）结合到蛋白质（例如，T4溶菌酶）和ii）的水溶剂化。设置自由能量分子模拟以在高性能计算（HPC）硬件资源上运行（通常使用脚本和Linux命令行来完成）是一项挑战，并且是获得可靠结果的障碍。除了计算上的挑战外，并非所有步骤都是可重复的，就像使用不同实验室，大学，公共设施和云平台上可用的各种软件和硬件资源运行时一样。但是，BRIDGE开发的目的是提供一个基于Web的平台，其中包括用于仿真，分析和分析的可靠方法。BioExcel Building Blocks软件采用了类似于BRIDGE的方法（Andrio 等，2019）。BRIDGE-Galaxy平台使从遗传学到蛋白质组学到化学的无缝过渡成为可能，并且可以使用精心设计的工作流程进行可重复的计算机模拟和分析。

我们研究T4溶菌酶作为计算配体相对结合的方案的例证，并以苯与对二甲苯结合到T4溶菌酶为例。以下工具被使用：ProtoCaller 进行设置（Suruzhon 。等人，2020），用于分子动力学（MD）模拟GROMACS （亚伯拉罕。等人，2015），以及用于模拟分析炼金分析（克里莫维奇等人，2015）。至少需要两次模拟才能计算结合的相对自由能。首先是水中配体之间的转化，然后是与溶剂化蛋白质结合的配体之间的转化。可以将配体2转换为配体1，反之亦然；方向的选择对于理解计算出的自由能的含义很重要。不需要在两个方向上进行计算，但可以用作确认自由能结果的计算收敛性的附加度量。

可以通过基因表达的基因组实验和生物信息学分析来鉴定蛋白质靶标，或者可以通过文献检索找到蛋白质靶标，该文献可以指向一个或多个蛋白质靶标。蛋白质结构来自RCSB蛋白质数据库。配体命中的鉴定通常是由与PDB中发现的已知底物或抑制剂具有相似性或使用相似性度量和对接计算衍生自现有预筛选分子库的分子所指导。公共分子数据库是寻找可能的配体的良好资源，例如ChEMBL （Gaulton 等，2012），ZINC （Irwin和Shoichet，2005）和PubChem （Kim 等，2016）。

将蛋白质从PDB文件准备成可以进行模拟的状态，将配体置于结合位点，以及选择合适的参数进行精确模拟，这是MD模拟的一些直接障碍，对于自由能模拟则更为如此。有许多可供选择的方法制备的蛋白质，例如，PDBFixer （伊士曼等人，2013年）。但是，该准备工作通常需要经过专门培训以应对挑战，例如正确地丢失PDB的环，修复或安装突变的残基，创建二硫键并指定实验上一致的质子化状态。对于配体，精确的电荷需要参数化和分配。在此处介绍的协议中，蛋白质和配体的自动设置是使用Alchemical Setup工具完成的，该工具链接了几个专用工具来执行蛋白质设置和参数设置。

BRIDGE界面（图1）非常简单，遵循Galaxy设计。工具位于左侧面板中，进度历史记录位于右侧面板中，有关当前工具或所选数据集的信息位于中央面板中。数据可以使用在顶部的绿色载图标上传牛逼ools菜单（左图），而顶部的菜单栏包括用户帐户等信息。要搜索工具，请在搜索栏中输入关键字，然后会显示带有匹配单词的工具。对工具的更改进行了版本控制，可以通过中央面板界面选择可用的版本。通过浏览共享数据并单击已发布的历史记录（https://galaxy-compchem.ilifu.ac.za/histories/list_published），可以找到包含输出的此过程的示例历史记录。选择示例历史记录，然后单击“ +”图标以添加到您的历史记录中。使用眼睛图标浏览示例输出。图2中所示的自由能工作流也是可用的（参考文献15 ）。

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图1. Galaxy界面概述。工具在左侧面板中。工具信息息或数据显示在中央面板和历史显示在右侧面板中。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902723--1498 Kevin Naidoo 746178 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.相对束缚自由能工作流程的概述。PDB格式的受体和SMILES中的配体是“炼金术”设置的输入。使用炼金术运行运行多个模拟，并且使用炼金术分析工具检查收敛性。

作为以下过程的一部分，提供了一个简短的分析，用于确认自由能模拟已收敛。可以对铅抑制剂的分子轨迹进行分析，以确定负责配体结合的分子相互作用，并考虑配体和蛋白质的构象。进一步分析的目的是理解约束的理由。例如，进一步的分析可能包括氢键分析和Ramachandran分析，均方根偏差（RMSD）和主成分分析（PCA）。一个示例工作流是provid Ë d （参考14 ）。PC A将揭示催化域的灵活性以及影响抑制剂结合的主要蛋白质运动，而氢键分析将表明配体与蛋白质结合位点之间的关键氢键相互作用。

软件

本地电脑
要在本地计算资源上运行此代码，请获取BRIDGE Docker（https://github.com/scientificomputing/bridge-docker）并将Dock er映像安装在本地计算机上。所有库，编译器和链接都打包在Docker映像中，因此安装是无缝的。四核处理器，8G 乙RAM和80G 乙硬盘空间足够用于任何操作系统上具有泊坞测试。

公共服务器
可通过Web浏览器获得访问权限，而无需安装软件。可以从https://galaxy-compchem.ilifu.ac.za/访问BRIDGE平台。这些工具可在Galaxy Europe（http://cheminformatics.usegalaxy.eu）上获得。

程序

使用炼金术设置进行系统准备
登录到BRIDGE服务器。
要开始准备溶菌酶（蛋白质或受体）和苯配体的模拟，请单击Alchemical Setup工具以设置模拟（图3）。将产生九个输出-一个报告，四个结构和四个拓扑。为配体1创建了结构和拓扑，使其在水中和蛋白质中化学转化为配体2，反之亦然。

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图3.炼金术设置工具。指定了一种蛋白质和两个配体，将生成与GROMACS兼容的输出。

输入T4溶菌酶的PDB ID：“ 181L”（https://www.rcsb.org/structure/181L）。
选择“上传文件”，然后更改为“否”。
选择“配体参考”为“ 400”。这是活性位点中的苯分子（残基ID为400）。我们将两个配体（苯和对二甲苯）映射到该苯上。因此，配体参考应为“ 400”。
ProtoCaller 可以使用分子的SMILES符号构建配体。樱雪室温一个SMILES字符串配体1- 使用苯“C1 = CC = CC = C1”。可以使用分子软件或在线数据库生成该字符串。
为配体2用对二甲苯插入SMILES字符串“ CC1 = CC = C（C = C 1）C 。
选择“ PDB链ID”作为链“ A”。
选择“蛋白质力场”作为“ ff14SB ”。这是针对蛋白质开发的AMBER力场，可以选择其他力场。
将所有突变的硒代蛋氨酸更改回蛋氨酸将此选项设置为“是”。
将“删除任何具有备用位置的原子（altLoc B）”设置为“是”。仅使用主要坐标。
在“配体力场”中选择“ gaff2”，即一般琥珀色力场2。
蛋白质-配体复合物需要在一盒水分子中溶解。选择蛋白质-配体系统的盒子尺寸为“ 7” nm。溶菌酶的最长边大约为5 nm，我们使用1.2 nm的无键截止值。我们需要为蛋白质在水箱中自由移动保留一个缓冲区，并确保有足够的空间，使其不与周期图像相互作用。根据所考虑的系统调整此值。
配体还将在水箱中溶剂化。选择模拟框的大小。“ 4” nm对于大多数配体就足够了，但是如果配体长于2.5 nm，则可以增加。大型水箱的仿真将花费更多时间来完成。
最后一个选项是定义放置在水箱内的离子浓度。默认情况下，“0.154”钠M（钠+ ）和氯化物（氯- ）离子都包括在内，这是生理浓度。
单击“执行”按钮运行此工具。
模拟将开始，并将显示在“历史记录”面板中。创建的文件是GROMACS拓扑（.TOP）和结构（GRO ）的炼金运行工具所需的文件。这将生成文件，将蛋白2中的配体2以及水箱中的配体1向前和向后扰动。
单击报告中的眼睛图标，检查仿真的进度。这将需要一些时间。花费的时间将取决于可用的计算资源，也可能是由于工具依赖性检查和安装所致。该工具正在参数化配体力场，该过程将少于20分钟。如果历史记录项目保持灰色超过1天，请联系Galaxy Admin。例如，通过Gitter （https://gitter.im/galaxycomputationalchemistry/Lobby）。
历史记录项目变为绿色时，模拟结束。

使用Alchem Run 对蛋白质（配体2至配体1）的相对自由能进行模拟
一旦设置完成，就开始对每个配体的炼金术自由能模拟，这是计算水和活性位点中配体扰动所必需的。炼金仿真在四个步骤对于每个自由能窗口中进行，能量最小化，MD SIMU 在办法第十四正则系综（NVT ）合奏接着等温等压系综（NPT ）ENS emble。这种预平衡对于消除任何汉密尔顿滞后至关重要。最后，在NpT 集成中进行生产模拟。这些步骤全部由Galaxy中的Alchem Run工具执行（请参见图4）。从这些模拟中，可以计算出相对的结合自由能。在这里，对二甲苯（配体2）对苯（配体1）的简单扰动将被执行，并且为了说明该协议，我们选择了较短的模拟长度。实际上，需要更长的模拟时间。对于自由能运行，生产模拟通常至少为1 ns。对于我们的融合溶菌酶模拟，我们使用以下参数：最小化步骤：10000 ，NVT 步骤：500000（500 ps ），NpT st eps：500000（50 ps ），MD（生产）步骤：1000000（1000 ps ），时间步骤： 0.001 ps。无论选择哪个参数，都必须使用分析工具来检查收敛性。

选择“炼金术运行”工具。该工具需要炼金术设置工具提供的拓扑和结构输出。
选择“结构文件”为“蛋白质结构中的配体2到配体1”。
选择“拓扑文件”作为“蛋白质拓扑中的配体2到配体1”。
将“最小化步骤” 的数量设置为“ 10000”。
将“ NVT 平衡步骤” 的数量设置为“ 500”（1 ps ）。
将“ NpT 平衡步骤” 的数量设置为“ 500”（1 ps ）。
将“ MD（生产）步数”设置为“ 1000”（2 ps ）。
默认情况下，“种子”设置为19880924，必须进行更改。这是启动用于分子动力学的随机数生成器，将其更改为当前日期或任何随机数（例如“ 20200130”）的种子。
将“时间步长”设置为“ 0.002” ps。
创建氢键约束。选择“是”将约束应用于配体，然后选择“ H键约束”。选择“ LINCS顺序”“ 4”，“ LINCS迭代”“ 1”，“ LINCS最大角度”“ 30”。
选择吨他˚F REE Ë NERGY p erturbation（FEP ）路径，并选择从较大的配位体（对二甲苯），以去到一个较小的配体（苯）。
输入“ 39”作为“自由能窗口数”。窗口越多，模拟重叠和收敛的可能性就越大。窗口数为零索引，键入39表示有40个窗口。首先，对电荷进行扰动，然后对Van der Waals和Bonding术语进行扰动。在这里，我们从0到1的比例从配体2（0.00）到配体1（1.00）进行化学扰动。0到1之间的任何数字表示电荷，范德华力，键合相互作用如何缩放以形成混合系统。
在模拟的前10个窗口中，将分子的电荷从0.00缩放到1.00，以0.11为增量。其余的自由能窗口不会受到干扰。必须通过输入以下40个数字来描述确切的Lambda值：“ 0.00 0.11 0.22 0.33 0.44 0.56 0.67 0.78 0.89 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00”。
扰动电荷后，在仿真中为最后29个窗口缩放Van der Waals交互作用。这些值从0.00缩放到1.00，以0.04为增量，然后在端点逐渐减小到0.02和0.01，以防止端点灾难。必须描述确切的lambda值，并键入以下40个数字：“ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.04 0.08 0.11 0.15 0.19 0.23 0.27 0.30 0.34 0.38 0.42 0.46 0.49 0.53 0.57 0.61 0.65 0.68 0.62 0.76 0.80 0.84 0.87 0.91 0.95 0.97 0.98 0.99 0.99 1.00”。
与Van der Waals交互缩放一并缩放模拟中的键合项。必须描述确切的lambda值，并键入以下40个数字：“ 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.04 0.08 0.11 0.15 0.19 0.23 0.27 0.30 0.34 0.38 0.42 0.46 0.49 0.53 0.57 0.61 0.65 0.68 0.62 0.76 0.80 0.84 0.87 0.91 0.95 0.97 0.98 0.99 0.99 1.00”。
使用默认的自由能选项。
将温度设置为“ 300” K，压力设置为“ 1” bar。
选择“执行模拟”。如果需要，可以在Galaxy外部生成和模拟输入文件。
点击“执行”。
检查历史记录中的报告以了解模拟进度。输出还将包括FEP / TI（热力学集成）数据和轨迹的“ .tar”文件（存档）。查看这些轨迹，以确保在FEP计算期间未发生非物理事件。
可选：对蛋白质中的配体1至配体2重复此步骤。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902723--1498 Kevin Naidoo 746178 \ Figs jpg \图4.jpg

图4.炼金术运行工具。该工具用于在GROMACS中运行最小化，平衡和生产模拟，以实现特定环境中配体之间的炼金转化。

使用炼金术运行模拟水（配体2至配体1）中的相对自由能
对于B，但是将“结构文件”选择为“水结构中的配体2至配体1”，将“拓扑文件”选择为“水结构中的配体2至配体1”。
可选：在水中对配体1至配体2重复此步骤。

蛋白质分析中蛋白质中配体2到配体1的分析和收敛性测试
炼金术分析工具（图5）提供了全面的分析（尽管可以使用GROMACS 内置条形模块）。所述data.tar文件FR ö 米炼金运行工具是必需的输入。预期的工具输出如下：

报告和自由能源输出。
自由能窗口的重叠矩阵（如PNG）。
收敛图（如PNG）。
基于曲线拟合方法（CFM）的一致性检查器（如PNG）。
自由能变化分解（如PNG）。
热力学积分图（如PNG）。
有关炼金术分析的更多详细信息，请阅读文章（Klimovich 等，2015）和代码存储库y （https://github.com/MobleyLab/alchemical-analysis）。

打开炼金术分析工具。
选择蛋白质数据输出；这将是“ tar”格式。
将前缀设置为“ md”，炼金术运行默认使用前缀md保存模拟数据。
将温度设置为“ 300” K。
“平衡时间”设置为“ 0” ps。可以更改它以丢弃一些模拟数据。在发现仿真尚未收敛并且需要去除前几个ps 的情况下，这将很有用。
以“ kcal”报告能量。
如果需要，请包括要跳过的lambda状态。默认情况下，不会跳过任何内容。
点击“执行”。
可选：R 重复蛋白中的配体1至配体2。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902723--1498 Kevin Naidoo 746178 \ Figs jpg \ Figure 5-word.jpg

图5. 炼金术分析工具。该工具用于分析自由能模拟。用户以tar格式提供了来自GROMACS的仿真数据以及进一步的仿真细节，例如温度。提供的输出帮助用户评估计算是否收敛。

水中的配体2到配体1的分析与收敛性分析
至于D，但在水数据输出中选择配体2到配体1。
可选：[R 水EPEAT配体1〜2配体。

解释蛋白质中配体2到配体1的分析
用不同的估计器和方法（热力学积分[ TI ] ，缺失指数平均[ DEXP ] ，插入指数平均[ IEXP ] ，贝内特接受比[ BAR ] ，多态贝内特接受比[ MBAR ] ）检查计算的自由能值的结果。; 看到图小号S1和S2。
检查自由能变化dF （t）输出，该输出是一个文本文件，其中包含在前后方向上随时间变化的所计算出的自由能。没有运行反向仿真，但是此工具可以从正向仿真中提取该数据。
检查收敛图dG （t），看仿真是否收敛。正向和反向Δ ģ应的容限内的相同，优选在紫色阴影条带（图6）。

D：\ Reformatting \ 2020-7-1 \ 1902723--1498 Kevin Naidoo 746178 \ Figs jpg \图6--word.jpg

图6.自由能收敛图。该图用于确认正向和反向ΔG值均在公差范围内。

检查重叠矩阵，该矩阵显示模拟中每个自由能窗口的重叠。相邻的自由能窗口之间应有良好的重叠。如果是这样，则表明分层（自由能窗口的数量）足以进行模拟。
考虑自由能变化细分。这样就可以使用所使用的每个自由能估算器直观地计算出每个窗口的自由能。该图表明IEXP与其他方法相比存在很大的偏差。
考虑热力学积分图。数据的可视化对于使用TI计算自由能非常有用。
考虑基于曲线拟合方法的一致性检查器。这将指示所有模拟是否已收敛。如果不是，则模拟可以是重新运行使用较长的模拟时间（具有更长的模拟时间重复协议B）或不收敛的模拟的数据的部分可以使用炼金分析（重新运行协议d被移除，并设置平衡时间是一个适当的ps数。
我们已经完成了对蛋白质中从配体2到配体1的扰动的分析。
可选：R 重复蛋白中的配体1至配体2。

解释水中配体2到配体1的分析
至于F，但在水分析结果中选择配体2至配体1。
可选：- [R 在水中EPEAT为配体1配体2。

计算配体2与配体1的相对自由能
求出用MBAR估计的配体2到配体1中蛋白质的自由能（10.212±0.278 kcal / mol）。
求出用MBAR估算的配体2至配体1在水中的自由能（10.600±0.258 kcal / mol）。
计算结合的相对自由能（差），-0.388±0.379 kcal / mol。该值为负，这意味着配体1（苯）的结合比配体（2）对二甲苯更有利。这与实验差异为-0.52±0.17 kcal / mol很好地相比较（Morton 等，1995）。
可选：Ç ARRY了第一个和最后自由能量窗的轨迹分析。

笔记

自由能计算的注意事项应注意d（参考文献13 ）。
“ 这些规则不是最终的规则，在接受之前，您应该熟悉为什么建议每个规则”。
“更多的州胜于更少。方差随着州的数量而迅速缩小。您希望中介之间的差异在2-3 kBT 之间。
使用工作流和历史记录，这些模拟是可重复的（参考资料15 ）。
如果选择新的随机种子，则分子集合体中会存在一定的可变性，建议为每次模拟选择一个新的随机种子。

致谢

我们要感谢GitHub上的Galaxy社区，Galaxy EU 团队和Galaxy计算化学团队进行工具和代码审查。

在撰写本文时，尚未发表该协议的原始论文和研讨会。但是，在搜索i ）“ BRIDGE一个可重现的高通量自由能的开放平台” 时，可能会找到它们。Tharindu Senapathi ，Miroslav Suruzhon ，Christopher B.Barnett ，Jonathan Essex和Kevin J. Naidoo。

这项工作基于科学和技术部（DST）的南非研究主席倡议（SARChI ）和国家研究基金会（NRF）赠款449130的研究，并由南非医学研究理事会根据自发发起的研究研究补助金和医学研究理事会补助金（KJN）。即使这项工作得到了MRC的支持，但所表达的观点和意见并非MRC的，而是所制作或宣传的材料的作者。TS感谢SARChI 授予的博士学位。我们感谢开普敦大学，南非国家研究基金会（NRF）为将BRIDGE托管在ilifu 数据中心和高性能计算中心在开发BRIDGE时使用其集群所提供的支持。

利益争夺

没有利益冲突。

参考文献

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