材料和试剂

1. 5毫升聚丙烯管

2. 50毫升管

3. 1毫升注射器（SoftJect ，Henke-Sass Wolf，目录号：5010-200V0）

4. 针23 G×1''（BD，目录号：300800 ）

5. 针头过滤器0.2 μ米（Filtropur 小号0.2，Sarstedt的，目录号：83.1826.001 ）

6. 酒精湿巾（Cutisoft 湿巾，BSN Medical，目录号：204364 ）

7. 的BALB / c TG （NF κ 乙-RE-LUC）-Xen记者小鼠（Taconic Biosciences公司，目录号：10499）（8-12周龄;男性或女性）

注意：只BALB / c TG （NF κ 乙-R E-LUC）-Xen报告小鼠用于炎症的成像。如果目的仅是对药物沉积进行成像，则可以使用其他实验室小鼠品系。

8. 来自大肠杆菌O111：B4的LPS （Sigma-Aldrich ，目录号：L3024）

9. TCP-25（GKYGFYTHVFRLKKWIQKVIDQFGE）

作为药物，我们使用了凝血酶衍生肽TCP-25。对于体内成像，将TCP-25与2％（w / w）Cy5标记的TCP-25（Biopeptide，圣地亚哥，加利福尼亚，美国）混合。

10. 羟乙基纤维素（HEC，的Natrosol 250 HX，MW 1 ，000 ，000;阿什兰工业欧洲有限公司，目录号：431292 ）

11. XenoLight D-荧光素，钾盐（PerkinElmer，目录号：122799 ）

12. DPBS，不含钙和镁（Thermo Fischer Scientific，目录号：14190250）

13. 不含内毒素的水（西格玛，目录号：TMS-011-A）

14. 异氟烷（Forane ，Baxter，目录号：CA2L9100 ）

15. 1.5％的HEC水凝胶（请参阅食谱）

16. D-荧光素溶液（请参阅食谱）

17. LPS解决方案（请参阅食谱）

设备

电磁搅拌机
IVIS光谱（Perkin Elmer，型号：目录号：124262 ）
超声波浴（Elma Schmidbauer GmbH，型号：Elmasonic S30H）
无绳理发器（Aesculap ，目录号：GT416 ）
电磁搅拌器（Fisher Scientific，目录号：11715704 ）

软件

Living Ima ge 4.5.5软件（PerkinElmer）
Prism版本8.3.0（GraphPad Software，LLC。）

程序

水凝胶-LPS混合物的制备
为了使水凝胶含有LPS，添加5 微克LPS（1mg / ml的溶液）至95 微升1.5％HEC凝胶。将混合物剧烈涡旋5分钟，然后离心3分钟（2,575 x g ，室温）以除去气泡。的5-50甲范围微克LPS可被用于获得不同等级的炎症。
注意：应在剃除小鼠背部之前（即，在步骤C 之前）准备凝胶LPS混合物。

慢慢地，取200 微升LPS凝胶混合物在1ml注射器。避免吸入气泡。将23号针头连接到注射器上，并通过缓慢地从注射器上移走多余的凝胶将凝胶量调节至100μl 。移至过程C。
注意：水凝胶非常厚，请勿使用针头抽吸，因为这将很困难并会产生气泡。

水凝胶-Cy5标记的药物混合物的制备
在5毫升聚丙烯试管中，将所需量的荧光标记药物添加到凝胶中，并剧烈涡旋5-10分钟。离心3分钟（室温2575 xg ）以除去气泡。在我们的研究中，为了进行体内成像，将TCP- 25与2％（w / w）Cy5标记的TCP-25混合加入了凝胶。我们在凝胶中使用的最终浓度为0.1％TCP-25。Ť ø研究联合作用，药物/药物可以用LPS在相同的水凝胶一起加入。
注意：水凝胶混合物应在刮除鼠背之前（即在步骤C之前）制备。

慢慢地，将200μl 药物凝胶混合物放入1 ml注射器中。避免吸入气泡。将23号针头连接到注射器上，并通过缓慢地从注射器上移走多余的凝胶将凝胶量调节至100μl 。移至过程C。
注意：水凝胶非常厚，请勿使用针头抽吸，因为这将很困难并会产生气泡。

皮下注射肛门注射的小鼠的制备
接收后的BALB / c TG （NF κ 乙-RE-LUC）-Xen报告小鼠从供应商，让他们在检疫用于至少一个凌晨K（或取决于动物设施的规则）。图1简要说明了用于皮下凝胶沉积和成像的小鼠制备方法。

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图1. 皮下凝胶沉积和IVIS成像的准备。A. 用无线剪刀将小鼠的背部剃毛。B.水凝胶的皮下沉积。C.腹膜内注射底物D-荧光素。D. IVIS成像。

用异氟烷混合氧气麻醉小鼠（4％异氟烷用于诱导，1.5-2％用于维持）。这可以在IVIS感应室或任何其他异氟烷-氧气输送系统中实现。用无绳电推剪将小鼠的背部（略低于肩region间区域）的头发剃掉。用脱毛膏也可以脱毛。如果使用脱毛膏，则应在皮下注射前至少2天进行。
注意：剃须或脱毛是必要的，因为鼠标毛会干扰发光和荧光成像。

用酒精擦拭并清洁背部。立即移至下一步。

水凝胶的皮下沉积
用拇指和食指手动约束麻醉的小鼠，从肩inter间区域提起并折叠皮肤。将针头插入皮肤下方，并向前移动至少1厘米。慢慢地，注入100 微升LPS凝胶混合物的，撤回针和把你的手指在插入的位点，以防止沉积的位点的任何泄漏。
注意：由于鼠标的皮肤非常松弛，请确保在中线注入凝胶，否则凝胶可能会放在一侧。对于标准的皮下注射程序，请参见Shimizu （2004 ）。

皮下注射后，立即将小鼠转移到各自的笼子里。

IVIS成像为NF- κ 乙交流tivity（发光成像模式）
在IVIS成像前15分钟，将D-荧光素溶液腹膜内注入小鼠体内（150 mg / kg体重）。将小鼠放回笼子里。
注意：我们为LPS凝胶皮下沉积后3、6和24小时给小鼠成像。

用4％异氟烷混合氧气在诱导室中麻醉小鼠。完全麻醉大约需要3-5分钟。
注意：在使用IVIS之前，请阅读IVIS频谱用户手册。

麻醉小鼠后，开始为IVIS成像室供应异氟烷（2％）。立即，将小鼠转移到成像室。
注意：至少在成像前15分钟打开IVIS并启动Living Image软件并进行初始化。初始化过程将相机冷却至-90°C。还要确保阶段加热（37°C）在工作。

将小鼠俯卧在台上（倒置）。将鼻子放在鼻锥中进行麻醉。
注意：一次最多可对五只小鼠进行成像。如果一次成像多只鼠标，请确保两次D-荧光素注射之间的延迟时间最短。还有其他一些很好的来源可用于学习发光成像模式下的标准IVIS成像（Cosette等，2016）。

对于成像，请在IVIS采集控制面板中设置参数。选择发光（成像模式），自动（曝光）和D（5只小鼠的视野）或C（3只小鼠的视野）。
通过单击IVIS采集控制面板中的“采集”开始成像。
在信号微弱的情况下，可以将自动曝光更改为所需的时间，最长曝光时间为5分钟。可以根据一次成像的小鼠数量或感兴趣区域的大小来更改视场。

用于药物沉积的IVIS成像（荧光成像模式）
注意：在发光成像后立即对药物进行荧光成像。如果实验的目的仅在于可视化荧光成像模式下的药物沉积，则无需注入D-荧光素底物。

在IVIS采集控制面板中，将Cy5的成像模式设置为荧光，自动曝光时间，激发（650 nm）和发射（670 nm）。
通过单击IVIS采集控制面板中的“采集”开始成像。
注意：对于荧光成像，IVIS光谱能够使用415-850 nm的波长范围。对于体内和深部组织成像，重要的是要注意，大于600 nm的波长是优选的。动物组织吸收波长低于600 nm的大量光。我们已经成功使用了荧光标记，例如Cy5，Alexa Fluor 660，Alexa Fluor 680，Alexa Fluor 750和Cy7。

数据分析

IVIS采集的生物发光信号或荧光信号可以通过Living Image Software进行量化。在NF-LPS诱导的局部炎症的图2显示了生物发光成像κ 乙报告小鼠皮下注射水凝胶-LPS混合物的后。图3显示了皮下沉积在水凝胶中的Cy5标记药物的荧光成像。图4示出NF-的同时成像κ 乙活化法制Ñ 和药物定位。

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图2. IVIS在NF- κB 报告基因小鼠体内进行的体内炎症成像。HEC水凝胶中的LPS皮下沉积在转基因BALB / c Tg （NF- κB - RE - luc ）-Xen报告基因小鼠中。使用IVIS Spectrum 对NF- κB 报告基因的表达进行成像。图像显示了皮下沉积凝胶后3小时的生物发光。条形图显示在凝胶沉积部位周围局部测量的辐射度。由于LPS从凝胶中的低系统释放，还观察到最小的外围发光信号。

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图3. 皮下沉积在小鼠中的荧光标记药物的体内成像。为了成像体内沉积，将HEC水凝胶与Cy5标记的TCP-25 混合，然后皮下沉积在小鼠背部。使用IVIS光谱进行体内荧光成像。图像显示了凝胶沉积3小时后TCP-25 Cy5的分布。条形图显示在凝胶沉积位点附近局部测量的荧光。

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图4.NF- κB 报告基因小鼠体内炎症和皮下沉积药物的同时体内成像。HEC水凝胶与LPS和Cy5标记的TCP-25 混合，并皮下沉积在小鼠背部。同时发光和荧光成像被使用IVIS光谱进行。图像显示凝胶沉积后3小时的发光（发炎），荧光（药物）和覆盖。

从工具选项板中，选择要观察/期望观察生物发光信号的区域的感兴趣区域（ROI）。在一幅图像中可以选择多个ROI。为了获得相同的大小，可以将一只鼠标的ROI复制并应用于其他鼠标。
要测量生物发光，请在主图像视图上选择辐射（光子）作为单位。单击测量ROI，将出现一个ROI测量窗口，其中显示数据。确保在ROI测量窗口中将测量类型也选择为辐射度（光子）。要测量荧光，请选择辐射效率。
将数据复制到GraphPad Prism或Excel工作表以进行进一步分析。根据实验问题，数据可以表示为总通量或平均辐射率。
为了分析两组之间均值的差异，可以使用Mann-Whitney检验。为了比较两个以上组之间的均值，可以使用事后检验（Dunn's）的Kruskal-Wallis检验。

菜谱

1.5％水凝胶
将10 mM Tris缓冲液（pH 7.4）预热至56 ℃下在50ml试管中。在50毫升试管中制成的凝胶不要超过10毫升，否则将很难搅拌
在用磁力搅拌器搅拌的同时，缓慢添加所需量的HEC（1.5％w / v）
搅拌混合物直至形成均匀的凝胶。通过离心凝胶制剂3分钟（3.5×1,000 rpm，室温）除去气泡。混合均匀的凝胶不应有结块
D- LUC iferin解决方案
在DPBS中制备15 mg / ml D-萤光素溶液
消毒用0.2 μ 米注射器过滤器。P rotect溶液从光
注意：准备好的溶液的小等分试样可以储存在-20°C的无菌试管中。解冻溶液后，请立即使用，请勿重新冻结。

LPS解决方案
在无内毒素的水中制备1 mg / ml LPS 溶液
在超声波浴中于最高设置下超声处理1分钟（例如Elmasonic S30H）

致谢

这项工作是由阿尔弗雷德资金支持Österlunds 基金会，爱德华Welanders Stiftelse 和Finsenstiftelsen ，该克努特和爱丽丝瓦伦贝里基金会，塞尔玛Zoégas 基金会，英国皇家自然地理学会，瑞典战略研究基金会，VINNOVA ，为临床瑞典政府资金的iCal研究（ ALF），Crafoord 基金会，Novo Nordisk基金会（Novo Seeds NNF17OC0030158）和瑞典研究委员会（2012-1883，2017-02341，2018-05916 ）。该协议源自原始研究论文（Puthia 等，2020）

利益争夺

AS是in2cure AB的股东和董事会成员，该公司开发用于治疗应用的抗炎肽。MP已从in2cure AB获得咨询费。

伦理

所有动物实验均根据瑞典动物福利法SFS 1988：534进行，并得到瑞典马尔默/隆德动物伦理委员会的批准（许可号M252-11，M88-91 / 14，M5934-19、8871-19）。

参考文献

Carlsen，H.，Moskaug ，JO，Fromm，SH和Blomhoff ，R。（2002）。NF-κB活性的体内成像。免疫学杂志168（3）：1441-1446。
Lewis，AJ，Seymour，CW和Rosengart ，MR（2016）。当前的败血症鼠模型。外科感染（Larchmt ）17（4）：385-393。
Liu，T.，Zhang，L.，Joo D.和Sun，SC（2017）。NF- κ 乙炎症信号传导。信号Transduct 目标疗法2。
Puthia ，M.，Butrym ，M.，Petrlov ，J.，Stromdahl ，AC，Andersson，MA，Kjellstrom ，S。和Schmidtchen ，A。（2020）。含有双作用肽的水凝胶靶向伤口感染和炎症。Sci Transl Med 12（524）。
Shimizu ，S。（2004）。管理途径。于：实验老鼠。Elsevier ISBN 978-0-12-336425-8。527-542页。
Cosette，J.，Ben Abdelwahed ，R.，Donnou-Triffault ，S.，Sautes-Fridman ，C.，Flaud ，P.和Fisson ，S.（2016）。基于生物发光的肿瘤定量方法，用于监测小鼠淋巴瘤模型的肿瘤进展和治疗效果。Ĵ显示精通（113）：e53609。