材料和试剂

A、材料

1. 0.22μm过滤器

2. 移液管尖端：0.5-10μl，10-200μl（Greiner Bio-One，目录号：771291739290）

3. 过滤针尖架0.5-10μl、5-100μl、5-200μl和0.5-20μl、2-200μl、50-1000μl（品牌，目录号：732624、732630、732632、732124、732128、732132）

4. 硅化管1.7 ml（Sigma-Aldrich，目录号：T3406）

5. 5 mm不锈钢珠（Qiagen，目录号：69989）

6. 1.5 ml聚丙烯管，附带平盖（Greiner Bio One，目录号：616201）

7. 15ml聚丙烯管，螺帽（Greiner Bio One，目录号：188271）

8. 50ml聚丙烯管，螺帽（Greiner Bio One，产品编号：227261）

9. 玻璃纤维垫（Millipore，目录号：GFCP000800），储存于RT

B、试剂

1. 琼脂糖（HT生物技术，目录号：SB11a），储存于RT

2. β-巯基乙醇（β-ME）（Sigma-Aldrich，目录号：444203），储存于RT

3. 纤维素纤维垫（Millipore，目录号：CFSPO1700），储存于RT

4. 右旋糖酐交联G-25（Sigma-Aldrich，目录号：92639），储存于RT

5. dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP（HT生物技术，目录号：SB23），储存在-20摄氏度

6. 无水乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：32205-M），储存于RT

7. 溴化乙锭（Sigma-Aldrich，目录号：E1510），储存于RT

8. 甘油（Applichem，目录号：A29261000），储存于RT

9. 金纳米粒子40 nm（Sigma-Aldrich，目录号：741981），储存于4°C

10. GoTaq Flexi DNA聚合酶（Promega，目录号：M8301），储存于-20°C

11. 盐酸（HCl）溶液，1 M（Sigma-Aldrich，目录号：150696），储存于RT

12. 甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415），储存于RT

13. 硝化纤维膜（Millipore，目录号：HF180MC100），储存于RT

14. N-甲基马来酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：389412），储存于RT

15. 寡核苷酸（表1）：dA20，SH-dT30，UpNdv_B上游引物，DpNdv下游引物，探针，重组后储存在-20°C

表1。本方案中使用的寡核苷酸

寡核苷酸

顺序（5¢3¢）

修改

dA20型

啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊

-

SH-dT30型

SH-tttttttttttttttttttttttttttttttttttt

5′硫醇基

上游底漆

B-AAGAAATTGGCAAACCCG公司

5'生物素

DpNdv下游底漆

TATCGTCTGTTCCTCC

-

探测器

ccttagacaggtgcgtca公司

-

16. PCR级水（Jena Bioscience，目录号：PCR-258-500），储存于4°C

17. 吡啶（Sigma-Aldrich，目录号：270970），储存于RT

18. RNaseOUTTM重组核糖核酸酶抑制剂（Invitrogen，目录号：10777019），储存于-20°C

19. RNeasy Mini kit（Qiagen，目录号：74104），储存于RT

20. 氯化钠（NaCl）（Applichem，目录号：381659），储存于RT

21. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4509），储存于RT

22. 氢氧化钠（NaOH）溶液，1 M（Sigma-Aldrich，目录号：79724），储存于RT

23. 来自阿维迪尼链霉菌的链霉亲和素（Sigma-Aldrich，目录号：S4762），储存于-20°C

24. 蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389），储存于RT

25. 上标II（Invitrogen，目录号：18064014），储存于-20°C

26. 末端脱氧核苷酸转移酶（新英格兰生物实验室，目录号：M0315S），储存于-20°C

27. 吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416），储存于RT

28. φX174 DNA HaeIII digest DNA（新英格兰生物实验室，目录号：N3026 S），储存于-20°C

29. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：746336），储存于RT

30. 磷酸二钠（Na2HPO4）（Sigma-Aldrich，目录号：795410），储存于RT

31. 磷酸二氢钾（KH2PO4）（Sigma-Aldrich，目录号：795488），储存于RT

32. 磷酸盐缓冲盐水，10×（PBS，pH 7.4）（见配方）

33. LFB显影液（见配方）

设备

1. -20°C冷冻机

2. -80°C冷冻机

3. 台式扫描仪（HP、HP Scanjet G4050）

4. 用于Linomat的100µl剂量注射器（Camag，目录号：695.0014）

5. 微型离心机（Heraeus，Sepatech）

6. 切纸机（Plaisio办公用品，目录号：800882）

7. 声波浴Bransonic（Sigma-Aldrich，目录号：Z305359EU）

8. PCR工作站（Euroclone Bioair，Aura）

9. pH计（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-644-928）

10. 移液管：

Nichipet EXII 0.5-10μl和20-200μl（Nichiryo，目录号：NPX-10，NPX-200）

Transferpete S 0.5-10μl、10-100μl、20-200μl和100-1000μl（品牌，目录号：705870、705874、705878、705880）

11. 剪刀和镊子，用70%乙醇保持无菌

12. 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDropTM 1000，目录号：ND-1000）

13. 热循环器（应用生物系统公司，GeneAmp PCR系统9700）

14. 组织匀浆机（TissueLyser LT）（Qiagen，目录号：85600）

15. 组织匀浆器适配器（TissueLyser LT适配器12管）（Qiagen，目录号：69980）

16. TLC涂抹器（Camag，Linomat，目录号：022.7808）

17. 漩涡（Velp Scientifica，mdoel:Vortex ZX3）

18. 水浴（LabTech，型号：LSB-015S）

19. 蒸馏水器（Sartorius，型号：Arium®Comfort I，目录号：H2O-I-1-UV-T）

软件

1. Adobe PhotoShop（Adobe系统）

2. CAMAG®HPTLC软件visionCATS基本版（CAMAG，目录号：028.0000）

3. NanoDrop 1000软件（Thermo Fisher Scientific，NanoDrop ND-1000）

4. ImageJ软件（美国国立卫生研究院）https://imagej.net/Welcome

5. Microsoft®Office Excel 2010（Microsoft）

程序

A、 dA20寡核苷酸探针与dap的拖尾研究

1. 根据制造商说明，用一定量的PCR级水溶解冻干寡核苷酸dA20，该水要求寡核苷酸储备液为100 pmol/µl。

2. 在pH 7.9、2µl CoCl2（0.25 mM）、0.7µl dATP（3.5 mM）、0.5µl末端脱氧核苷酸转移酶（TdT，10个单位）和7µl dA20中混合2µl末端转移酶反应缓冲液（50 mM）、三醋酸三酯（20 mM）和醋酸镁（10 mM）的2µl末端转移酶反应缓冲液，建立拖尾反应（20µl）。

3. 在37°C下培养1h。

4. 在70℃孵育10分钟，停止反应。

5. 将聚（dA）尾寡核苷酸储存在-20°C。

B、干试剂侧流生物传感器的研制

1. 清洗TLC涂抹器注射器：

a、用蒸馏去离子水（ddH2O）清洗10次。

b、用50%乙醇（EtOH）洗涤10次。

c、使用前请保持填充状态。

d、用蒸馏去离子水（ddH2O）清洗20次。

2. 制备聚（dA）寡核苷酸工作溶液，方法是在1×PBS缓冲液中用适当体积的含有50 ml/l甲醇和20 g/l蔗糖的溶液将35 pmol/µl聚（dA）尾储备液稀释至最终浓度4 pmol/µl。

3. 制备链霉亲和素（SA）工作溶液，方法是在1×PBS缓冲液中用适当体积的含有150 ml/l甲醇和20 g/l蔗糖的溶液将10µg/µl SA储备溶液稀释至4µg/µl的最终浓度。

4. 将7µl 4 pmol/µl聚（dA）尾工作液装入注射器。

5. 将聚（dA）尾工作液以60nl/s的速度喷到固定化膜上，每4mm LFB形成2.4pmol poly（dA）的控制区（CZ）。

6. 将SA工作液以250 nl/s的速度喷洒到TLC涂布器仪器中的固定化膜上，使测试区（TZ）为1.6µg SA/4 mm LFB。

7. 在80°C下干燥薄膜1小时。

8. 将薄膜在室温下储存一夜。

9. 每次使用后，按以下步骤清洗TLC涂抹器注射器：

a、用0.1 M NaOH清洗5次。

b、保持注射器充满15分钟。

c、用ddH2O清洗20次。

d、用0.1 M HCl清洗5次。

e、保持注射器充满15分钟。

f、用ddH2O清洗20次。

10. 将LFB装配在塑料粘合背衬（层压卡）上，如下所示（图1）：

a、首先将诊断膜放在层压卡的中心。

b、然后将共轭垫放在薄膜下方，重叠2 mm。

c、将浸没垫放在共轭垫下方，重叠2 mm。

d、将吸水垫放在薄膜上方，重叠2 mm。

11. 用切纸机将LFB切至4毫米。

12. 将LFB储存在室温下的黑暗中。

图1。侧流式生物传感器制备过程示意图和塑料背衬上LFB组装部件的侧视图

C、用dTTP尾随SH-dT30

1. 用PCR级水溶解冻干寡核苷酸（SH-dT30），以获得100 pmol/µl寡核苷酸储备溶液。

2. 通过混合2µl末端转移酶反应缓冲液（见A2），在pH 7.9；2µl CoCl2（0.25 mM）；0.7µl dTTP（3.5 mM）；0.5µl TdT（10个单位）和7µl SH-dT30中混合，来设置拖尾反应（20µl）。

3. 在37°C下培养1h。

4. 在70℃孵育10分钟，停止反应。

5. 在-20°C下保存SH聚（dT）尾寡核苷酸。

D、凝胶渗透色谱法（GPC）用于尾式SH-poly（dT）的纯化

1. 葡聚糖交联G-25的制备。

a、将5克葡聚糖颗粒放入玻璃瓶中。

b、添加ddH2O，直到所有颗粒被覆盖，即使是在吞咽之后。

c、在4°c下培养过夜。

2. 将预处理的右旋糖酐G-25倒入GPC柱中。

3. 以750×g离心6分钟。

4. 用移液管将尾部的SH聚（dT）寡核苷酸置于柱中心。

5. 以750×g离心2分钟。

6. 在1.5 ml试管中收集流过的液体（~50µl）。

7. 将纯化的尾部SH聚（dT）寡核苷酸储存在-20°C。

E、寡核苷酸偶联金纳米粒子的制备

1. 将1ml金纳米粒子（Au NPs:40nm，7.2×1010粒子）放入硅化管中。

2. 添加75 pmol纯化的尾部SH聚（dT）寡核苷酸（10µl）和0.8 ml绝对吡啶。

3. 在4°C下，在黑暗中培养24小时。

4. 随后，添加16.7µl 900 mM NaCl溶液，并在4℃下在黑暗中培养2 h。

5. 重复步骤E.4 6次，直到最终浓度为90 mM（“盐老化”方案）。

6. 在4°C下，在黑暗中培养24小时。

7. 以1300×g离心30分钟。

8. 小心地丢弃上清液。

9. 通过涡流和短时超声（5分钟），将金纳米粒子颗粒再悬浮在100µl含有30%蔗糖、0.25%吐温-20、0.25%十二烷基硫酸钠（SDS）和45 mM NaCl的水溶液中。

10. 将聚（dT）共轭金纳米粒子储存在4°C的黑暗中。

F、鱼脑解剖

1. 把鱼放在解剖垫上，用剪刀和镊子小心地把头骨打开。

2. 解剖整个大脑，用镊子小心地取出。

3. 将样品转移到无菌聚丙烯管中，并在-80°C下储存，直到使用。

注：自然感染的欧洲黑鲈（Dicentrarchus（D.）labrax）有或无VNN临床症状，均从海笼养鱼场收集并安乐死。

G、总RNA提取

1. 把切下的鱼组织从仓库中取出，放在冰里解冻。

2. 称取1.5毫升空的无菌试管，并加入纸巾。测定重量，用无菌剪刀切取30毫克组织。如果分离出的大脑大于30mg，剩余的组织可以在-80°C下储存以备将来使用。

3. 使用前，将6µlβ-巯基乙醇（β-ME）添加到600µl缓冲液RLT中。

注意：将β-ME分配到通风柜中，并穿上适当的防护服。

4. 将组织置于无菌1.5 ml试管中，并添加约600µl的含有β-ME的缓冲液RLT。

5. 在管上添加一个不锈钢珠（5 mm），并将其放入TissueLyser适配器中。

6. 破坏组织，在组织分析仪LT上以50 Hz的频率使裂解物均匀化5分钟。

笔记：

a。不要超过这个时间，因为它可能会导致核酸剪切。

b。TissueLyser适配器存储在-20 °C，组织破裂在室温下进行。因此，由于中断时间短，接合器温度在整个过程中保持较低。

7. 将匀浆后的样品全速离心5分钟，以确保所有组织碎片都在试管底部。

8. 用移液管小心地移走上清液，并转移到新的1.5毫升试管中。

9. 将1体积的70%乙醇（储存在室温下）添加到已清除的裂解液中，并通过移液管混合。不要离心。

注：添加乙醇后，可能会出现沉淀。

10. 将700μl样品（包括可能形成的任何沉淀物）转移到置于2 ml收集管中的RNeasy spin柱中。

11. 在10000×g下离心30 s。丢弃流过的液体。

12. 对剩余样品重复步骤G10和G11。

13. 向RNeasy旋转柱中加入700μl缓冲液RW1，清洗旋转柱膜。

14. 在10000×g下离心30 s。丢弃流过的液体。

15. 向RNeasy旋转柱中加入500μl缓冲RPE，清洗旋转柱膜。

16. 在10000×g下离心2分钟。丢弃流过的液体。

17. 将RNeasy spin柱放入新的2 ml收集管中。

18. 离心机全速运转1.min。

19. 将RNeasy旋转柱放置在新的1.5 ml收集管中，并直接向旋转柱膜中添加30μl无RNase的水。

20. 以10000×g离心1min洗脱RNA。

21. 使用另一个30μl无核糖核酸酶的水重复步骤G19和G20。

22. 将洗脱后的RNA保存在-20°C。

H、纳米滴分光光度法测定RNA含量及质量

1. 打开NanoDrop 1000软件。在相应的选项卡中选择核酸分析，然后选择RNA。

2. 将1µl洗脱的RNA样品置于样品装载位置。

3. 测量吸光度。

注：A260/A280纯化后的等分试样比值大于1.9-2.1，表明分离出的总RNA得到有效纯化以备进一步使用。

一、鱼类标本NNV-RNA的反转录研究

1. 通过混合5µl寡核苷酸dT20（2.5 mM）、1µl dNTPs（dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP；每个0.5 mM）、100 ng纯化总RNA和适当体积的不含RNase的H2O混合至13µl，建立反转录反应（20µl）。

2. 将混合物加热至65°C 5分钟，然后在冰上快速冷却（0°C，1分钟）。

3. 离心收集试管内容物，加入4µl第一链缓冲液（1×）、1µl二硫苏糖醇（0.1 M）、1µl RNase OUT RNase抑制剂（40 U）和1µl上标II逆转录酶（200 U）。

4. 在50°C下培养60分钟。

5. 在70°C下失活15分钟。

6. 将产生的cDNA保存在-20°C。

J、 NNV基因的PCR扩增

1. 通过混合4µl DNA聚合酶反应缓冲液（1×）、1.6µl MgCl2（2 mM）、0.4µl dNTPs池（每个200µM）、1µl上游和下游引物（0.5 mM）、0.1µl GoTaq Flexi DNA聚合酶（0.5 U）和ddH2O，建立PCR主混合物（18µl）。

2. 向PCR母料中添加2µl cDNA。

3. 将样品放入热循环器中，循环条件如下：95°C，5 min，然后在95°C下循环35次，持续30 s，60°C，循环60 s，72°C循环60 s。

4. 在72°C下培养样品反应7分钟，并冷却至4°C。

5. 将产生的扩增产物储存在-20°C。

注：在每个系列的PCR中包括阴性对照（含有PCR级水而不是DNA），以确认没有污染。

6. 用2%琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物。

7. 以φX174 DNA HaeIII消化DNA分子量标记为基础，用ImageJ软件对PCR产物进行定量分析。

注：所有浓度均为1中的最终浓度×反应。该程序应在配备紫外可见光灯的DNA工作站上进行，以净化试剂和设备。

K、用dATP追踪nodavirus特异性寡核苷酸探针

1. 用适当量的pMONDL/100寡核苷酸溶液溶解PCR探针。

2. 通过混合2µl末端转移酶反应缓冲液（见步骤A2），在pH 7.9；2µl CoCl2（0.25 mM）；4µl dATP（2 mM）；0.5µl TdT（10单位）和4µl探针_Ndv（400 pmol）来设置尾流反应（20µl）。

3. 在37°C下培养1h。

4. 在70℃孵育10分钟，停止反应。

5. 将探针_Ndv与1.5µl N-甲基马来酰亚胺（40 nmol/µl）混合。

6. 将探针尾寡核苷酸储存在-20°C。

五十、侧流式生物传感器检测NNV扩增产物

1. 将5µl PCR产物等分溶液与1µl 0.9 M NaCl、0.5 pmol dATP尾探针_Ndv和ddH2O混合，最终体积为10µl。

2. 将混合物在95°C下加热3分钟，并放在冰上30秒。

3. 将混合物培养至37°C 10分钟，以便继续杂交。

4. 将杂交混合物应用于聚（dT）官能化金纳米粒子旁边的接合垫上。

5. 将生物传感器的浸入垫浸入250µl LFB显影液中。

6. 等待信号形成。视觉检测在20分钟内完成。

7. 用桌面扫描仪扫描LFB，并用ImageJ软件量化频带密度。

数据分析

A、侧向流生物传感器的视觉信号检测

1. 信号形成完成后（约20分钟），从显影缓冲液中取出LFB，并用普通纸巾小心地擦拭使其干燥。

2. 在桌面扫描仪中用更高的分析设置扫描LFB，并将其另存为.tiff文件。

3. 用任何图像处理软件（如PhotoShop）打开图像，并以只看到薄膜的方式裁剪LFB焊盘。结果如图2所示，图中描绘了试验完成后阳性和阴性结节病毒样本的代表性图像。

图2。具有代表性的侧流生物传感器图像，用于视觉检测阳性和阴性nodavirus样本，以及侧流生物传感器的侧视图，展示其工作原理。 IP:浸没垫；CP:结合垫；M:诊断膜；AP:吸收垫。（CZ：控制区；TZ：试验区）。分析成分没有标度。

B、用ImageJ半定量估计LFB信号

1. 用ImageJ打开图像。然后你可以用ImageJ对它们进行灰度化。

2. 转到图像→键入并单击8位将图像转换为灰度。

3. 转到“处理”→“减去背景”并将“滚动球半径”设置为50。

4. 转到“分析”→“设置测量值”，然后单击“面积”、“平均灰度值”和“积分密度”框。

5. 进入“分析”→“设置比例”，然后输入“像素”作为“长度单位”。

6. 选择矩形选择工具并围绕膜绘制一个矩形。

7. 按1，将弹出一个窗口，其中显示图像和矩形选择周围的蓝色标签。

8. 将矩形移到下一个LFB上，然后按2。对每个LFB重复上述步骤。

9. 完成后，按3键，将弹出一个新窗口，其中显示每个薄膜的剖面图。

10. 选择直线选择工具。在每个峰的底部，从峰的一侧到另一侧画一条线，将峰面积围起来。

11. 当每个山峰都被关闭时，选择魔杖工具。

12. 用魔杖，点击每个山峰的内部。

13. 数值结果将在结果窗口中弹出。

14. 将结果传输到Excel工作簿并绘制所需的图表，例如Toubanaki等人，2015年的结果部分。

笔记

1. 程序A、C、D、G、I、J、K应在配备紫外可见灯的DNA工作站上进行，以对试剂和设备进行去污。

2. 所有浓度均为1×反应的最终浓度。

食谱

1. 磷酸盐缓冲盐水，10×（PBS，pH 7.4）

a、将80 g NaCl、2 g KCl、11.5 g Na2HPO4和2 g KH2PO4溶解到800 ml蒸馏水中

b、根据获得的pH值，用1 M HCl或1 M NaOH将pH值调节至7.2，并用蒸馏水将体积调至1 L

c、用0.22μm过滤器进行过滤消毒

d、储存于4°C

e、必要时，将100μl储备液（10×）溶于1000ml去离子水中，作为PBS（1×）的工作溶液

2. LFB显影液

a、在100 ml 1×PBS中溶解4 ml甘油和1 g/L十二烷基硫酸钠

b、储存于4°C

致谢

本项目是在“教育和终身学习”业务计划“支持博士后研究人员”行动框架内实施的（行动的受益人：研究和技术总秘书处），由欧洲社会基金（ESF）LS9（448）和希腊政府共同资助。Toubanaki等人于2015年修改了这些方案。

相互竞争的利益

作者声明他们没有金融或非金融竞争利益。创始发起人在研究的设计、数据的收集、分析或解释、手稿的撰写以及结果公布的决定中没有任何作用。

伦理学

从养鱼场收集生物样本的工作由各水产养殖设施的持照人员进行。所有有资格的人员都事先被告知了研究的目的、数据的保密性以及他们的自愿参与。根据希腊（PD 56/2013）和欧盟（指令63/2010）关于保护、护理和使用用于科学目的的动物的立法，希腊巴斯德研究所动物生物伦理委员会批准了本研究，并根据伦理原则在养鱼场对所有样本实施安乐死以及其他法律要求。

工具书类

1. Bahadir，E.B.和Sezgintürk，M.K.（2016年）。侧流分析：原理，设计和标签。TrAC趋势分析化学82:286-306。

2. Cheng，N.，Yang，Z.，Wang，W.，Wang，X.，Xu，W.和Luo，Y.（2019年）。多种生物纳米金在制备侧流生物传感器中用于病原菌的检测。当代医学化学杂志19（27）：2476-2493。

3. Glynou，K.，Ioannou，P.C.，Christopoulos，T.K.和Syriopoulou，V.（2003年）。寡核苷酸功能化金纳米粒子作为探针用于杂交DNA分析的干试剂条生物传感器。《分析化学》75（16）：4155-4160。

4. Jiang，N.，Ahmed，R.，Damayantharan，M.，Ünal，B.，Butt，H.和Yetisen，A.K.（2019年）。侧流和垂直流分析用于护理点诊断。Adv健康材料8（14）：e1900244。

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7. Posthuma Trumpie，G.A.，Korf，J.和van Amerongen，A.（2009年）。侧流（免疫）分析：优势、劣势、机会和威胁。文献综述。肛门生物化学393（2）：569-582。

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