材料和试剂

注：除列出的质粒外，以下试剂可与适当的替代品互换。

1. 吸管头（USA Scientific，目录号：1180-3810、1180-1810、1180-8810、1126-7810）

2. 一次性塑料血清学吸管（康宁，目录号：4487、4488、4489、4490）

3. 6孔透明TC处理多孔板（康宁，CostarTM，目录号：3506）

4. 12孔透明TC处理多孔板（康宁，CostarTM，目录号：3513）

5. 24孔透明TC处理多孔板（康宁，CostarTM，目录号：3526）

6. 96井深井区块（Fisher Scientific，目录号：12566611）

7. Axygen PCR 8条透明管（Fisher Scientific，产品编号：14222251）

8. 封面纸（费希尔科学公司，目录号：NC9455457）

9. 显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：22034486）

10. Econo-Pac色谱柱（Bio-Rad，目录号：7321010）

11. 蛇皮3.5K MWCO透析管（Thermo Scientific，fisher Scientific，目录号：PI88242）TM公司

12. HiTrap SP HP列（Sigma Aldrich，GE Healthcare，目录号：GE17-1151-01）

13. 接种回路（Fisher Scientific，BD DifcoTM，目录号：22-031-22）

14. 带透明盖的培养皿（FisherbrandTM，Fisher Scientific，目录号：FB0875712）

15. 内螺纹低温瓶（科宁TM，费希尔科学，目录号：03-374-059）

16. Seal Rite®1.5 ml微型离心管（USA Scientific，目录号：1615-5510）

17. 15毫升离心管（康宁®，产品编号：430052）

18. 50毫升离心管（康宁®，目录号：430897）

19. BD Luer LokTM 5 ml通用注射器（Becton Dickinson，McKesson，目录号：309646）

20. Millex高压注射器过滤装置，45μm，PVDF，33 mm，伽玛灭菌（微孔，微孔西格玛，目录号：SLHV033RS）

21. FalconTM圆底聚苯乙烯管（康宁，费希尔科学，目录号：352008）

22. BrandTM塑料试管（BrandTechTM，Fisher Scientific，目录号：759075D）

23. SamcoTM转移移液管（Thermo-ScientificTM，目录号20220S）

24. 细胞培养处理瓶（CorningTM，目录号：430639）

25. FalconTM试管，带细胞过滤器扣盖（CorningTM，Fisher Scientific，目录号：08-771-23）

26. Milli-Q水

27. CTB-pET28a（Addgene，质粒ID:141166）

28. mNG211-CTA2-pGEXTEV SUMO（Addgene，质粒ID:141167）

29. ER-HA-mNG21-10 EF1a噬菌体IRES blasticidin（Addgene，质粒ID:141165）

30. Sec61β-HA-mNG21-10 Ef1a噬菌体IRES blasticin（Addgene，质粒ID:141213）

31. GM1-C12:0（见Chinnapen等人，2012年）

32. 霍乱毒素B亚单位（重组），Alexa FluorTM 488共轭物（Thermo Fisher，目录号：C34775）

33. Shuffle®T7 Express合格大肠杆菌（新英格兰生物实验室，目录号：C3029J）

34. SOC介质（科宁公司，费希尔科学公司，目录号：46003CR）

35. 米勒鲁里亚琼脂粉（国际研究产品，目录号：L24022）

36. Miller's LB肉汤颗粒（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP9723）TM公司

37. 氨苄西林钠（目录号：A301）

38. 卡那霉素（GoldBio，目录号：K12050）

39. BD-Difco脱水培养基2x酵母抽提物胰蛋白酶（2x YT）培养基（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：DF0440）TM公司TM公司

40. 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）（GoldBio，目录号：I2481）

41. Trizma®基底（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：T1503）

42. 氯化钠≥99.0%（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：S9888）

43. Triton X-100（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：T8787）TM公司

44. 苯基甲烷磺酰氟，PMSF（Thermo-ScientificTM，目录号：36978）

45. 谷胱甘肽琼脂糖树脂（GoldBio，目录号：G-250）

46. 还原型L-谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：G4251）

47. ULP1蛋白酶（内部生产，Addgene，质粒ID 64697）

48. 磷酸二钠，Na2HPO4（Sigma，目录号：S9763）

49. 4-20%Mini-Protean®TGX预制凝胶，10孔，50μl（Bio-Rad，目录号：4561094）TM公司

50. 精密加未染色蛋白质标准品（Bio-Rad，目录编号：161-0363)

51. 10x Tris-Glycine SDS-PAGE缓冲液（国家诊断，目录号：EC-870）

52. Ez-Run蛋白质凝胶染色液（Fisher BioReagents，Fisher Scientific，目录号：BP36201）TM公司TM公司

53. 液氮

54. 无水乙醇（Pharmco，目录号：111000200CSPP）

55. RPMI介质1640，谷氨酰胺-I（赛默飞世尔科学公司，目录号：61870）TM公司

56. 胎牛血清，合格，One ShotTM格式，热灭活（赛默飞世尔科学公司，目录号：A3160602）

57. 胎牛血清，无脂肪酸（Sigma-Aldrich，目录号：A6003-10G）

58. 3000MtFISHER（链霉素，科学编号：链霉素溶液）TM公司

59. 胰蛋白酶EDTA（0.25%），酚红（Gibco，Fisher Scientific，目录号：25-200-072）TM公司

60. 细胞培养磷酸盐缓冲盐水1x（康宁，费希尔科学，目录号：MT21040CV）TM公司

61. 含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM（康宁，费希尔科学，目录号：MT10013CV）TM公司

62. 慢病毒包装质粒psPAX2（Addgene，质粒ID:12260）

63. 慢病毒包装质粒pVSVG（Addgene，质粒ID:8454）

64. 聚乙烯亚胺，PEI（费希尔科学目录号：NC1014320）

65. 聚布伦（圣克鲁斯生物技术公司，目录号：sc134220）

66. 杀螨素（GoldBio，目录号：B800）

67. ER-mCherry质粒（可根据要求提供）

68. 抗HA抗体（Sigma-Aldrich，Millipore-Sigma，目录号：11867423001）

69. Anti-Golgin97（赛默飞世尔，产品目录号：A21270）

70. 适当的二级抗体（Invitrogen，目录号：A21247和A11001）

71. 20%多聚甲醛水溶液（电子显微镜科学，费希尔科学，目录号：15713S）

72. 皂甙（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：47036）

73. 正常山羊血清（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：G902310）

74. 库马西蓝（Fisher BioAgentsTM，EZ-runTM，目录号：BP36201）

75. 胶原蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：C7661）

76. FluorSave贴片（Millipore，目录号：345789）

77. 100毫克/毫升（1000倍）氨苄西林原料药（见配方）

78. 50毫克/毫升（1000倍）卡那霉素原料（见配方）

79. LB琼脂平板（见配方）

80. LB介质（见配方）

81. 2x YT介质（见配方）

82. 1M IPTG储备溶液（见配方）

83. 50%甘油（见配方）

84. Triton X-100裂解缓冲液（见配方）

85. 绑定缓冲区（见配方）

86. 洗脱缓冲液（见配方）

87. 透析缓冲液（见配方）

88. 缓冲液A（见配方）

89. 缓冲液B（见配方）

90. K562细胞培养基（见配方）

91. HEK 293T和COS7细胞培养基（见配方）

92. 杀螨素原药（见配方）

93. 4%多聚甲醛（PFA）（见配方）

94. 0.2%皂甙（见配方）

95. FACS缓冲区（见配方）

设备

注意:以下设备品牌和制造商是建议，可与适当的替代选项互换。

1. 微量移液管（Gilson，目录号：F167360）

2. 吸管辅助（Drummond Scientific，目录号：4-000-102）

3. 适当的个人防护装备

4. 250毫升锥形瓶（Sigma，目录号：CLS5100250）

5. 2 L锥形瓶（Sigma，目录号：CLS51002L）

6. 磁力搅拌棒（Fisher Scientific，FisherbrandTM，目录号：14-513-52）

7. 磁力搅拌器（Thermolyne Nuova，产品编号：Z110930）

8. 涡流混合器（Fisher Scientific，Vortex GenieTM 2，目录号：15557335）

9. 加热块（Benchmark Scientific，目录号：BSW1500）

10. 高压灭菌器

11. 台式培养箱（Barnstead Lab Line 100）

12. 能够旋转500毫升瓶子的离心机（Thermo Scientific，Sorvall Lynx 4000，目录号：75006580）

13. 500毫升离心瓶（Fisher Scientific，目录号：05-564-2）

14. 乳化C5均质机（Avestin，目录号：EF-C5）

15. 台式微型离心机（Eppendorf，目录号：12843222）

16. 4°C下的平台振动筛（轨道振动筛）

17. Stericup GP真空过滤系统（Millipore，Millipore Sigma，目录号：SCGPU05RE）

18. NanoDrop 2000（Thermo ScientificTM，目录号：ND-2000）

19NGC QuestTM 10 Plus色谱系统19NGC QuestTM 10 Plus色谱系统（Bio-Rad，目录号：7880003）

20. Azure C300凝胶成像系统（Azure生物系统）

21. 细胞培养箱（Thermo Fisher Scientific，Forma Series II，目录号：3110）TM公司

22. 生物安全柜（Labcult）

23. 水浴

24. 分光光度计

25. pH计

26. 电泳室（Bio-Rad，Mini-PROTEAN-tetra）

27. 电源组（Bio-Rad，PowerpacTM通用电源，目录号：1645070）

28. -20 °C冷冻机

29. -80 °C冷冻机

30. BD-LSRFortessaTM流式细胞仪系统（BD biosciences）

31. 旋转圆盘共焦头与蔡司Axiovert 200M倒置显微镜耦合

软件

注意:可以使用等效软件。

1. ChromlabTM软件6.0（Bio-Rad，https://www.bio-rad.com/en-us/product/chromlab-software？ID=MFCVPXIVK）

2. GraphPad Prism软件版本8.0(https://www.graphpad.com)

3. BD FACSDivaTM软件（BD，https://www.bdbiosciences.com/en-us/instruments/research-instruments/research-software/flow-cytometry-acquisition/facsdiva-software)

4. FlowJoTM软件v10.6.2（BD，https://www.flowjo.com)

5. Excel（微软公司，https://www.microsoft.com/microsoft/Excel)

6蔡司Axiovert 200M显微镜，旋转圆盘共焦头6蔡司Axiovert 200M显微镜，旋转圆盘共焦头

程序

A、蛋白质纯化

1. 霍乱毒素B亚单位（CTB）被克隆到pET28a载体（Clontech）中。mNG211融合霍乱毒素A2链，克隆到pGEXTEV-SUMO载体中。该结构包含一个N端GST标签，以促进CTB-mNG211的纯化，以及一个相扑蛋白酶裂解位点，以允许GST-SUMO标签的去除。

2. 根据制造商的高效转化协议，将CTB pET28a和mNG211-CTA2 pGEXTEV SUMO质粒共转化为Shuffle T7表达大肠杆菌。在SOC中稀释转化菌（通常为1:10），并在预热的LB琼脂平板上（含100μg/ml氨苄西林、50μg/ml卡那霉素）上扩散50-100μl。

3. 在30°C培养箱中的LB琼脂上培养转化的Shuffle T7表达细胞16-24小时。

4. 第二天，将转化细胞重新破碎到一个新的an-LB琼脂平板上（含100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素），在30°C下重新生长过夜。

5. 接种100 ml 2x-YT（补充100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素），在35°C下培养3-5小时，以225 rpm振荡。

注：制作-80°C甘油储备，以备将来使用。加500微升的过夜培养物500 μl 50%甘油，置于2 ml低温小瓶中，并在-80下储存°C。

6. 测量起子培养物的OD600nm，接种更大的500 ml 2x YT（补充100μg/ml氨苄西林、50μg/ml卡那霉素）以获得约0.05-0.1的初始OD600nm。

7. 在35°C下培养，以225 rpm振荡，每30-60分钟测量OD600nm，直到获得1.0-1.2。这大约需要3-5小时。

8. 通过添加0.4 mM IPTG的最终浓度诱导细胞，并在18°C下培养16-20小时，在225 rpm下振荡。

9. 通过将培养物转移到500 ml离心瓶中，在4°C下以5000 x g离心10分钟来收获细胞。丢弃上清液并尽快处理颗粒，以尽量减少不溶性产物。将样品放在冰上以防止蛋白质降解。

10. 用移液管和短暂的涡流法将小球再悬浮在30ml的溶解缓冲液中。确保没有颗粒残留。

11. 同时制备谷胱甘肽琼脂糖树脂：

a、旋转容器，将谷胱甘肽琼脂糖树脂（8mg GST标记蛋白为1mL）转移到50mL试管中。

b、在冰冷的Milli-Q水中再悬浮30 ml，在4°C下以300 x g的速度旋转1分钟。吸入Milli-Q水。

c、在冰冷粘合缓冲液中再悬浮30毫升，在4°c下以300 x g的速度旋转1分钟。吸入粘合缓冲液。

d、将洗涤过的谷胱甘肽琼脂糖树脂储存在4℃的5ml结合缓冲液中或冰上，直到使用。

12. 用乳化剂使细胞均匀化：

a、把冷却盘管放在冰上。

b、将溶解缓冲液中再悬浮的样品加入Avestin乳化剂中。

c、在压力波动约5000 psi的情况下连续均匀化样品。

13. 将裂解产物转移到50 ml试管中，并在15000 x g的温度下在4°C下离心10分钟至颗粒碎片。

14. 将上清液转移到一个新的50毫升试管中，并丢弃颗粒。将洗涤过的谷胱甘肽树脂加入已清除的裂解液中，并在4℃下培养1h，轻轻地端对端旋转。

15. 将浆液转移到Econo-Pac柱中，使样品沉淀。

16. 用5柱体积的粘合剂缓冲液清洗珠子三次。

17. 将5柱体积的洗脱缓冲液直接加入谷胱甘肽琼脂糖树脂中，洗脱蛋白质。

18. 通过使用纳米滴2000分光光度计测量A280nm来测定蛋白质浓度。对于CTB-mNG211，1.0单位的吸光度等于1.0 mg/ml的蛋白质浓度（消光系数：58955 M-1 cm-1）。

19. 加入ULP1蛋白酶，得到ULP1:CTB-mNG211重量比为1:10w/w。

20. 按照制造商的指示，将含有ULP1蛋白酶的洗脱蛋白转移到蛇皮透析管中。在1L透析缓冲液中于4℃下透析过夜，连续搅拌。

21. 第二天，丢弃外部缓冲液，在1L缓冲液A中4℃透析3小时，连续搅拌。

22. 收集透析后的蛋白质，通过0.45μm的过滤装置过滤到一个新的50 ml试管中。

23. 根据制造商的纯化方案，使用Hi-Trap-SP-HP柱进行阳离子交换，使用连续离子强度梯度洗脱纯化的蛋白质。

a、 Bio-Rad NGC Quest10 Plus色谱系统。

b、使用样品泵，以1ml/min的流速，在4°C下将蛋白质装载到与缓冲液A预平衡的柱上。

c、用5个柱体积的缓冲液A在4°c下以1 ml/min的流速冲洗色谱柱。

d、用15个柱体积的缓冲液B（0-80%）在4°C下以1 ml/min的流速洗脱柱。在5 ml圆底聚苯乙烯管中收集单个0.5-1 ml部分。

24负载2024负载20用三甘氨酸SDS-PAGE分析（见注释），并用考马斯蓝试剂染色凝胶。CTB单体分子量=11.6 kDa。mNG211-CTA2的分子量=7.8 kDa。重组GST-SUMO和ULP1在流过部分洗脱。

注：CTA2-mNG211的可视化很难用三甘氨酸SDS-PAGE观察。Tris-Tricine SDS-PAGE能更好地分离小分子量蛋白质。然而，这一步并不重要，因为CTA2-NG211与CTB共洗脱，如果纯化正确的话。

25. 识别并合并含有纯化CTB-mNG211的部分。用纳米滴2000分光光度计测量A280nm，测定CTB-mNG211的浓度。

26. 使用液氮对等分试样进行快速冷冻，并在-80°C下储存以备将来使用。应尽量减少CTB-mNG211的冻融，并将小份（建议体积为20-50μl）分配到PCR 8条管中。

B、慢病毒产生与细胞系转导

注：慢病毒属于生物安全2级（BSL-2）生物体，因此需要采取适当的措施和设施来进行实验. 在生物安全柜中执行以下步骤。

1. ER-HA-mNG21-10和Sec61β-HA-mNG21-10结构包括一个用于使用抗HA初级抗体进行免疫荧光检测的blasticin选择标记和HA标签。

2. 将hek293t细胞置于6孔板中，在转染前24小时获得80%的融合率。

3. 用慢病毒转移质粒（ER-HA-mNG21-10或Sec61β-HA-mNG21-10）、包装质粒（psPAX2和pVSVG）转染hek293t细胞。

a、将1.5μg/孔ER-HA-mNG21-10（或Sec61β-HA-mNG21-10）、1μg/孔psPAX2、0.5μg/孔pVSVG置于50μl Opti MEM中。

b、按3:1的比例制备PEI裴：DNA在里面50μl光学内存。

c、将含Opti-MEM的质粒与PEI混合，在室温下孵育5-15分钟。

d、将PEI/质粒混合物逐滴添加到孔中，使混合物均匀分布在孔上。

4. 在37°C 5%CO2下培养4-6小时。抽吸培养基并更换为2毫升新鲜培养基（DMEM，10%FBS）。37°C 5%CO2培养48小时，使HEK 293T细胞分泌慢病毒到培养基中。

5. 收获含有分泌慢病毒的培养基并在4°C下保存。添加新鲜培养基并在转染后72小时再次收获。

6. 将收集的培养基合并，用0.45μm的过滤器过滤。慢病毒可在-80°C下进行鉴定和储存，以备将来使用。

7. 培养你感兴趣的细胞系。

a、并非所有细胞系都能结合霍乱毒素。此外，每个细胞系都有不同程度的逆行活动。hek293t、COS7和K562是经验证的逆向贩运线路。

b、确定你感兴趣的细胞系是否至少能结合霍乱：

i、用荧光2 nm CTB Alexa Fluor 488在37°C 5%CO2下培养细胞至少30分钟。

二。清洗细胞，再悬浮，并通过流式细胞仪测定CTB Alexa Fluor 488结合情况，如下所述。

注：如果细胞系不能表达足够的GM1，可以用2微米GM1-C12:0在不含脂肪酸的BSA中稀释10分钟，37°C。GM1-C12:0的合成概述见Chinnapen等人，2012年。

c、在37°c的水浴中加热培养基、1x PBS和胰蛋白酶。

在10%的Strepen/3TpEn和10%FbSe细胞中培养的Strepen/3TpEn和10%FbWe细胞中培养。

8. 当细胞约60-80%汇合时，吸出培养基，用1x PBS冲洗细胞，胰蛋白酶化，然后在培养基中重新悬浮。将细胞分成6孔板，每个孔含有1毫升培养基。

9. 用慢病毒转化你的细胞：

a、将1ml病毒/聚丁二烯添加到含有1ml含细胞培养基的6孔板中。

b、最终聚布伦浓度为5μg/ml，过滤病毒。

c、在37°c 5%CO2下培养24小时。

10. 吸出培养基，换上新的生长培养基，再孵育一天。时间可能会根据细胞系恢复和生长的速度而变化。

11. 第二天收集15毫升试管中的细胞，以1000×g离心30秒，并吸出培养基。

12. 在5 ml培养基中重新悬浮细胞，并将细胞转移到T25烧瓶（或60 mm培养皿）中。

13. 选择表达ER-HA-mNG21-10或Sec61β-HA-mNG21-10的转染细胞。最佳杀螨素浓度应通过检测亲代细胞的药物毒性来确定。

a、将亲代细胞置于6孔板中，第二天获得约50%的融合率。

b、添加2μg/ml和100μg/ml之间的最终杀螨素浓度。

c、观察筛选过程，以监测杀灭>90%细胞所需的最佳浓度，通常在3-14天内。

d、用预先确定的浓度选择转化细胞。

C、共焦成像检测验证

注意：在生物安全柜中执行以下细胞培养步骤。

1. 如有必要，可使用胶原蛋白涂层。在置于12孔板的盖玻片中加入150μl胶原蛋白（用70%乙醇稀释）。在生物安全柜中完全风干。

2. 将平板细胞（DMEM，10%FBS，pen/strep）放在盖玻片上，第二天获得约80%的融合度。在37°C 5%CO2条件下培养细胞。

3. 第二天用新鲜的生长培养基替换细胞。

4. 用20 nm CTB-mNG211处理细胞，并在37°C 5%CO2下培养6小时。

注：PFA应在化学通风柜中处理。

5. 吸取培养基，用1毫升4%多聚甲醛（PFA）固定在1x PBS中，室温下培养20-60分钟。

6. 吸取PFA，用1ml 1x PBS洗涤两次，并用1mL 0.2%皂甙1x PBS渗透。

7. 室温下用1ml 5%山羊血清和0.2%皂甙1x PBS封闭1h。

8. 吸取封闭液，加500μl稀释后的一级抗体（1x PBS，0.2%皂甙），4°C孵育过夜。

注：ER-HA-mNG21-10和Sec61β-HA-mNG21-10定位可使用抗HA抗体（稀释1:500）进行评估。

9. 用1ml 1x PBS+0.2%皂甙冲洗三次，每次3-5min。

10. 取500μl稀释的二级Alexa-Fluor抗体（1x PBS，0.2%皂甙）室温下1h。

注：山羊抗大鼠Alexa-fluor488二级抗体按1:500的比例应用。

11. 用1ml 1x PBS+0.2%皂甙冲洗两次，用1ml 1x PBS冲洗一次，持续3-5分钟。

12. 安装盖子使用安装剂将面朝下滑动到滑块上，并在室温下避光固化一夜。

注：对于长期储存，请在4°C避光保存载玻片。

13. 根据制造商的操作手册，可以通过共焦成像评估载玻片。

D、流式细胞术

注意：在生物安全柜中执行以下细胞培养步骤。

1. 通过流式细胞术评估的逆行转运可以根据您的实验条件进行调整。

注：维护不善的细胞会影响逆行贩卖。使用自上次传代后2到3天的细胞。

2. 粘附细胞：

a、板24孔板，以获得约80%的汇合度或实验条件。

b、第二天，抽吸并更换新的生长培养基。

c、添加20牛米CTB-mNG211。可使用无血清培养基或1x PBS制备100倍工作浓度的CTB-mNG211，并保存在冰上。在24小时内使用每个小份。

d、如果是第一次测试，在37°C，5%CO2下培养4-6小时。

e、清洗细胞，胰蛋白酶化细胞，加入FACS缓冲液，转移到Eppendorf或流式细胞仪试管中。把细胞放在冰上快速处理。或者，可以在缓冲液中冲洗20%的细胞，并用pfs冲洗20%细胞。固定PFA有助于维持GFP信号。

注：我们还没有注意到胰蛋白酶对最终的整体荧光信号有显著影响，但建议通过冰上冷冻或固定快速处理样品。

3. 悬浮细胞：

a、将细胞计数至1 x 105-5 x 105 cells/ml，并将0.5 ml/条件转移到圆形底部96孔深孔板中。细胞密度和体积可以根据细胞系和实验兴趣进行调整。

b、添加20牛米CTB-mNG211。100倍工作浓度的CTB-mNG211可由原料等分液使用无血清培养基或1x PBS制备。蛋白质在使用前保存在冰上。解冻后24小时内使用蛋白质。

c、如果是第一次测试，在37°c，5%CO2下培养4-6小时。

d、降速单元，用1xPBS清洗，然后在FACS缓冲液中重新冷却。如有需要，按上述方法固定单元格。

4. 如果出现问题，可以通过一个40μm的过滤器进行单细胞悬浮。

5. 根据制造商的操作手册和实验需要，使用BD-LSRFortessaTM流式细胞仪系统短暂涡流并进行流式细胞术。

数据分析

1. 色谱图可以用ChromlabTM软件记录，数据可以用GraphPad Prism绘制。

2. 流式细胞术数据可通过FlowJo软件进行分析：

a、从分析中排除死细胞和细胞双倍体。

b、在所有流动实验中，相对于模拟处理细胞定位荧光阳性门。

c、使用荧光标记的CTB Alexa Fluor488，可以根据毒素的总负荷量对不同实验条件之间的标准化或对野生型细胞系与敲除系或敲除系之间的比较进行标准化。用2nM CTB Alexa Fluor488处理细胞，以检测每种独特的条件。然后使用CTB-mNG211处理的细胞，在相同的条件下，标准化为CTB Alexa Fluor 488荧光信号。

3. 显著性可采用双尾t检验进行评估，显著性<0.05。图形可以用GraphPad Prism生成。

4. 对于一个完整的实验，可以考虑一些条件。在每一个实验中都应该出现的一个条件是模拟处理过的细胞，它将提供背景荧光信号。第二种情况应该使用CTB Alexa Fluor488处理过的细胞来确定最大的阳性绿色荧光信号。小分子化合物可能具有固有的绿色荧光，因此有助于背景荧光。因此，至少最初应该使用化合物处理过的细胞来检查背景荧光。

5. 一些细胞系可能由于细胞内在的运输生物学或缺乏毒素结合而不能提供强有力的逆行信号。用CTB Alexa Fluor488处理细胞将有助于确定毒素摄取的最大程度。

6. 本检测系统首次应用于您的团队可能从报告系统稳定工作的已验证细胞系开始，包括COS7、K562和HEK293T。经验证的细胞系还可用于纯化重组分裂报告毒素的初始质量控制和分析的技术培训。

食谱

1. 100毫克/毫升（1000倍）氨苄西林储备液（10毫升）

1克氨苄西林

10ml Milli-Q水

2. 50毫克/毫升（1000倍）卡那霉素储备（10毫升）

卡那霉素0.5g

10ml Milli-Q水

3. LB琼脂平板

24克磅琼脂

650毫升毫升

高压灭菌15-20分钟

充分冷却后，添加100μg/ml（1x）氨苄青霉素、50μg/ml（1x）卡那霉素

倒入培养皿中，在室温下放置

储存于4°C

4. 磅培养基（100毫升）

2.5 g-LB介质

100毫升Milli-Q水

高压灭菌15-20分钟

在使用前，添加100μg/ml（1x）氨苄西林或50μg/ml（1x）卡那霉素

5. 2x YT培养基（100毫升）

100毫升Milli-Q水

高压灭菌15-20分钟

充分冷却后，添加100μg/ml（1x）氨苄西林

6. 1 M IPTG储备液（10毫升）

2.38克IPTG

10ml Milli-Q水

等分份并在-20°C下储存

7. 50%甘油（100毫升）

50毫升甘油

50毫升Milli-Q水

高压灭菌15-20分钟

8. Triton X-100裂解缓冲液

10毫米Tris pH 8.0

100毫米氯化钠

0.5%Triton X-100

1毫米PMSF

储存于4°C

9. 绑定缓冲区

10毫米Tris pH 8.0

100毫米氯化钠

储存于4°C

10. 洗脱液

50毫米Tris pH 8.0

10 mM L-谷胱甘肽还原

Milli-Q水

使用前先做新的

11. 透析缓冲液

10毫米Tris pH 8.0

100毫米氯化钠

储存于4°C

12. 缓冲器A

5毫米Na2HPO4 pH值7

用真空过滤和除气

储存于4°C

13. 缓冲器B

5毫米Na2HPO4 pH值7

1M氯化钠

用真空过滤和除气

储存于4°C

14. K562细胞培养基

RPMI

10%FBS

1%钢笔/链球菌

15. hek293t和COS7细胞培养基

DMEM公司

10%FBS

1%钢笔/链球菌

16. 杀螨素原药

5 mg/ml水中

17. 4%多聚甲醛（PFA）

10毫升20%全氟辛烷磺酸

40毫升1x PBS

18. 0.2%皂甙

0.2g皂甙

10毫升1x PBS

19. FACS缓冲区

1个PBS

2%FBS

致谢

这项工作得到了美国克罗恩和结肠炎基金会和鲁宾-沃尔波奖学金（波士顿儿童医院）的支持。国家卫生研究所拨款T32HD007466、DK048106和DK084424。我们感谢Luong之前发布的协议。（2020年）对现行协议进行了修改。et公司艾尔

竞争

作者声明没有竞争性利益。

工具书类

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