材料和试剂

1. 0.22μm PVDF注射器过滤器（默克/密理博，产品编号：SLGV033RS）

2. 20毫升注射器（任何供应商）

3. 6孔培养板，组织培养处理（任何供应商）

4. 96孔平板，平底，组织培养处理（任何供应商）

5. 96孔板，U形底，组织培养处理（任何供应商）

6. Amicon超离心过滤装置，Ultra-15，MWCO 10 kDa（默克/密理博，目录号：UFC901008）

7. 细菌散布器（默克/西格玛，目录号：Z723193-500EA）

8. 培养瓶，T175，组织培养处理（T25、T75、T175，任何供应商）

9. PCR管（任何供应商）

10. 培养皿，100 mm（任何供应商）

11. pH计或pH试纸（任何供应商）

12. 移液管尖端（未过滤）：10、200和1000μl（任何供应商）

13. 移液管尖端（过滤）：10、200和1000μl（任何供应商）

14. HisTrap excel列（5 x 1 ml）（通用电气生命科学公司，目录号：17371205）

15. CHO-K1电池（ATCC，目录号：CCL-61）

16. 大肠杆菌DH5α活性细胞（新英格兰生物实验室，配有NEBuilder试剂盒）

17. 琼脂糖（任何供应商）

18. Agencourt Cleaneqdye终结者移除（Beckman Coulter，目录号：A29151）–

19. 抗生素抗真菌溶液（100x）（默克/西格玛，目录号：A5955）

20. 大型染色终端套件（赛默飞世尔，产品目录号：4337455）

21. 细胞外CHO无蛋白培养基（默克/西格玛，目录号：14361C-1000ML）

22. ExpiCHO表达系统（可用于高产量蛋白质生产）（Thermo Fisher，目录号：A29133）

23. 中性缓冲福尔马林溶液，10%（默克/西格玛，目录号：HT501128-4L）

24. 氢氯酸（HCl）12m或更高（任何供应商）

25. 潮霉素（默克，目录号：H0654-1G）

26. NEBuilder高保真DNA组装克隆套件（新英格兰生物实验室，目录号：E5520S）

27. NotI HF（新英格兰生物实验室，目录号：R3189S）

28. 核酸凝胶染色（任何供应商）

29. 带标准缓冲液的OneTaq®热启动快速加载®2x主混料（新英格兰生物实验室，目录号：M0488L）

30. 质粒miniprep试剂盒（Machery Nagel，目录号：740499.50）

31. 聚乙烯亚胺（PEI）（线性，分子量25000）（Polysciences，目录号：23966-2）

32Pur-A-LyzerTM Mega透析试剂盒（默克/西格玛，目录号：PURG1202-1KT）32Pur-A-LyzerTM Mega透析试剂盒（默克/西格玛，目录号：PURG1202-1KT）

33. Q5®热启动高保真2x Master Mix（新英格兰生物实验室，目录号：M0494L）

34RPMI-1640介质（默克/西格玛，目录号：R7509）34RPMI-1640介质（默克/西格玛，目录号：R7509）

35. SmaI（新英格兰生物实验室，目录号：R0141S）

36. SOC媒体（新英格兰生物实验室，配有NEBuilder工具包）

37. 氢氧化钠（NaOH）10 M或更高（任何供应商）胰蛋白酶表达酶（Thermo Fisher，目录号：12604039）

38. 水（如Milli-Q去离子蒸馏水）（任何供应商）

39. 氯化钠

40. 氯化钾

41. Na2HPO4

42. KH2PO4

43. Tris基

44. FBS（热灭活）

45. 谷氨酰胺

46. 2-我

47. 赫普斯

48. DMEM公司

49. 未来作战系统

50. 丙酮酸钠

51. 二甲基亚砜

52. 胰蛋白酶

53. 酵母抽提物

54. 哈萨克斯坦国家石油公司

55. 甘油

56. 甘氨酸

57. 溴酚蓝

58. 1份pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水（见配方）

59. 10倍pH值为7.4的磷酸盐缓冲盐水（见配方）

60. Tris缓冲盐水（TBS）pH值7.5（见配方）

61. 20%乙醇（见配方）

62. 70%乙醇（见配方）

63. 1 M HCl（见配方）

64. 1 M NaOH（见配方）

65. 含10%胎牛血清（cRF10）的完整RPMI（见配方）

66. 含5%胎牛血清（cRF5）的完整RPMI（见配方）

67. 不含胎牛血清（cRF0）的完整RPMI（见配方）

68. 用10%FBS（cDF10）完成DMEM（见配方）

69. 混合瘤用20%FBS（cIF20）完成IMDM（见处方）

70. 2-巯基乙醇（2-ME）（默克/西格玛，目录号：M3148）（见配方）

71. 2x细胞冷冻培养基（见配方）

72. 氨苄西林原料（见配方）

73. 鲁里亚肉汤（LB培养基）（见配方）或（默克/西格玛，目录号：L3522）

74. 鲁里亚肉汤（LB）琼脂（见配方）或（默克/西格玛，目录号：L3147）

75. 中磅（低盐）（见配方）

76. LB琼脂（低盐）（见配方）

77. 细菌冷冻培养基（2x）（见配方）

78. 1.5 M Tris pH 8.8（见配方）

79. 1 M Tris pH 6.8（见配方）

80. 1 M Tris pH 9.0（见配方）

81. 氯化铵（阻断溶酶体降解）（见配方）

82. 二磷酸氯喹（默克/西格玛，目录号：C6628）（见配方）

83. 红细胞裂解缓冲液（见配方）

84. 10%叠氮化钠（见配方）

85. 4%多聚甲醛（见配方）

86. 流式细胞仪洗涤缓冲液，含叠氮化钠，不含EDTA（又名FACS缓冲液）（见配方）

87. 流式细胞仪洗涤液，含叠氮化钠和EDTA（又名FACS缓冲液）（见配方）

88. 流式细胞仪固定缓冲液（见配方）

89. 2x Laemmli缓冲液（见配方）

90. 6x SDS还原缓冲液（见配方）

91. 0.01 M Tris HCl（见配方）

92. 三甘氨酸十二烷基硫酸钠缓冲液（见配方）

93. 0.15 M NaCl（见配方）

94. 0.5 M EDTA（pH 8.0）（见配方）

95. 50x TAE（见配方）

96. 甘油和溴酚蓝凝胶缓冲液（6x）（见配方）

97. ELISA涂层缓冲液（见配方）

98. ELISA洗涤液（见配方）

99. D-荧光素钾盐（见配方）

100.RNA提取用裂解缓冲液（见配方）

101.BDT序列缓冲液（见配方）

102.免疫荧光阻断缓冲液（见配方）

103.HisTrap Excel试剂（见配方）

5 M咪唑

10倍平衡缓冲液

平衡缓冲液

冲洗缓冲液

洗脱液

设备

1. 1L烧杯（任何供应商）

2. 磁力搅拌棒（任何供应商）

3. ÄKTA启动蛋白质纯化系统（GE Life Sciences，目录号：29022094-Ecominsw）

注：可采用简单的蠕动泵或重力流柱代替，以节省成本。

4. 使用DNA测序机（任何供应商）

5. 自动细胞计数器或血细胞仪（任何供应商）

6. 37°C下的摇菌器（任何供应商）

7. 无菌细胞培养生物安全柜（BSC）（任何供应商）

8. 含5%CO2和37°C的细胞培养箱（任何供应商）

9. 最好使用冷冻离心机，但不需要（任何供应商）

10. 计算机（任何供应商）

11. 流式细胞仪（任何供应商）

12. 凝胶电泳设备（任何供应商）

13. 凝胶文件系统（任何供应商）

14. 磁力搅拌器（任何供应商）

15. 移液管控制器（又名移液器、移液器）（任何供应商）

16. 移液管（10μl、100μl、200μl、1000μl）（任何供应商）

17. 热循环器（任何供应商）

18. 分光光度计（任何供应商）

软件

1. 用于序列比较的NCBI BLASTN（在线免费使用；可免费下载：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)

2. SnapGene（免费序列查看器在线使用；建议购买质粒构建，SnapGene：https://www.snapgene.com/)

注：设计质粒和比对测序结果的软件。还有其他选择，但我们认为这是最好的。

3. CLC序列查看器（CLC序列查看器是免费的；这里提供CLC主工作台，Qiagen）

4. 恐惧症（免费在线使用：http://ferious.sbc.su.se/)

用于确定感兴趣蛋白质的SigP（信号肽）、ECD、TMD（跨膜域）和胞内域（ICD）位置的在线算法。

5. TMHMM服务器（免费在线使用：https://services.healthdech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）

蛋白质跨膜螺旋的预测。结果应该和恐惧症差不多。

6. SignalP（免费在线使用：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)

signalp5.0服务器可以预测古生菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真核菌中信号肽的存在及其裂解位点的位置。

7. 简单模块化架构研究分析（SMART）（免费在线使用：http://smart.embl-heidelberg.de/)

识别蛋白质的关键结构域。补充恐惧症和TMHMM分析。

8. 真核生物线性基序（ELM）资源（免费在线使用：http://elm.eu.org//index.html)

真核生物线性基序（即具有已知功能的蛋白质序列区域）的注释和检测。

9. Webcutter（免费在线使用：http://heimanlab.com/cut2.html)

通过引入不改变蛋白质序列的沉默突变来寻找DNA序列中潜在限制位点的工具。这是用来在构建过程中在质粒中引入限制性位点，然后用于质粒的下游修饰。

10. Russel Lab（免费在线使用：http://www.russelllab.org/aas/)

注意：如果你需要改变一个氨基酸来引入一个限制位点，那么检查氨基酸的特性和替换的结果，看看哪种氨基酸是最好的替代物。

数据库（在线免费使用）

1. Genbank（）（Benson等人，2013年）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/

由国家生物技术信息中心（NCBI）、国家医学图书馆（NLM）和国家卫生研究院（NIH）维护的序列数据库

2. Ensembl（）（Zerbino等人，2018年）http://ensembl.org/

欧洲分子生物学实验室（EMBL）维护的序列数据库

3. UniProt（）（联合体，T.U.2018）https://www.uniprot.org/

这应该是对任何感兴趣的蛋白质的基本了解的第一站。人类和小鼠基因的注释非常详细，在大多数情况下，其他物种的蛋白质具有相似的特征（例如，定位蛋白质内的细胞外和跨膜结构域）。商业供应商也可用于交叉引用UniProt和您自己的蛋白质分析结果（例如，RnD系统）。

注：我们发现对于信息有限的物种（如塔斯马尼亚魔鬼），从头转录组组装是非常有用的。许多物种的初始基因组组合是不完整和/或不准确的，因此Genbank和Ensembl可能不包含您的GOI的正确序列。RNA测序数据的从头组装可以提供精确的全基因转录本，可以用来与Genbank和Ensembl序列进行交叉检查。此外，使用从头转录组组装允许该协议应用于没有参考基因组组装的物种。RNA测序数据可以通过单读或成对端协议获得，尽管成对端数据被推荐用于更高的序列可信度。来自外周血细胞、脾脏或淋巴结的转录组应该产生大部分与免疫系统相关的基因。从头转录组组装需要比本协议其他部分更深入的生物信息学技能，因此对于没有这方面专业知识的团队，我们建议在第一种情况下寻找有经验的合作者，然后在需要时发展自己的技能。请联系Andrew Flies博士，以帮助寻找具备必要技能的合作者。@野生免疫

程序

我们把协议分为五个部分。

程序A：描述GOI和POI

步骤二：设计表达载体

步骤C：组装表达载体

步骤D：用表达载体转染真核细胞系

步骤E：检测重组蛋白

A、描述GOI和POI

1. 识别GOI（例如，CD200、CD200R1、41BB、41BBL、PD1或PDL1）。

2. 从雨果基因命名委员会为你的GOI找到批准的基因名(http://www.genenames.org/).

e、 g.，CD200（OX2，OX-2，MOX1，MOX2，MRC）

3. 使用Ensembl或NCBI Genbank按名称搜索基因。

http://asia.ensembl.org/index.html

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

4. 定位基因的转录序列。

每个基因可能存在多个版本。e、例如，CD200_X1、X2、X3、X4（Genbank）或CD200-201、202（Ensembl）。

注：Genbank和Ensembl中的转录序列应该匹配，但是我们发现它们通常是不同的，所以最好检查两个数据库中的GOI/POI。

5. 使用适当的命名约定将GenBank（.gb）文件cDNA转录本保存到您的计算机中（图2）。

a、物种代码-批准的基因名称-参考代码。

e、 g.，saha_CD200_ENSSHAT00000000104-201（Ensembl）。

e、 g.，saha_CD200_X1_XM_023500980.1（GenBank）。

b、有关适当的物种代码，请参阅下面的物种表。

拉丁属和种的前两个字母。

i、例如，塔斯马尼亚魔鬼：沙蚕。

二。Ensembl使用三个字母的物种代码（sha），但我们建议使用四个字母的物种代码（saha）。

c、 Ensembl代码从ENS开始，然后是物种代码，然后是G代表基因或T代表转录。

e、 g.，ENSHAG0000000091

e、 g.，ENSHAT00000000104

d、可以创建一个NCBI帐户来在线保存您的成绩单。

e、 FASTA（.fa或.FASTA）序列也可以，但是GenBank（.gb）有其他有用的信息。

图2。从NCBI GenBank导出文本文件

6. 使用SnapGene打开文件。请注意，也可以使用其他软件程序。

7. 如果编码序列（即基因的开放阅读框（ORF））没有注释，则检查Ensembl。如果需要更多的信息，执行BLAST搜索，将你的GOI序列与其他物种进行比较。这可以让你确定潜在的起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA、TAG或TGA）在哪里。

8. 在SnapGene文件中创建一个新特性，该特性指示编码序列的位置。

a、突出显示DNA序列。

b、选择“Add Feature”（添加功能）并将功能类型设置为“CDS”（编码顺序）。

9. 复制编码序列的氨基酸翻译（即蛋白质序列），并使用免费的分析软件对蛋白质进行表征。

a、恐惧症：预测跨膜拓扑结构和信号肽（图3）(http://ferious.sbc.su.se/).

图3。恶魔CD200恐怖蛋白分析。塔斯马尼亚魔鬼CD200分析使用恐怖算法识别信号肽，细胞外域，跨膜和细胞内域，以及ICD（又名细胞质）。CD200被预测有一个弱信号肽（又名SigP）。TMHMM服务器可以用于额外的分析，但通常会产生类似于恐惧症的结果。

b、 ExPASy生物信息学服务器上的ProtParam工具：预测分子量和消光系数(http://web.expasy.org/protparam/).

为了分子量和消光系数分析，从蛋白质序列中去掉SigP，因为SigP不应该出现在最终的蛋白质产品中。

c、信号肽：预测信号肽的位置和肽被靶向分泌途径的概率（图4）。

图4。CD200 signalp5.0魔鬼CD200蛋白分析。用signalp5.0算法分析塔斯马尼亚魔鬼CD200，以确定有信号肽的概率。结果表明，CD200-SigP有40%的机会产生一种分泌蛋白。我们用这种天然的CD200-SigP作为CD200-mTagBFP和CD200-mOrange快速蛋白，我们在上清液中恢复了足够的这些蛋白质产量，这表明CD200-SigP足以快速分泌蛋白质。

d、真核生物线性基序（ELM）资源：真核生物线性基序的注释和检测(http://elm.eu.org//index.html).

e、简单模块化体系结构资源工具（SMART）：信令域序列的识别和注释(http://smart.embl-heidelberg.de/).

10. 保存上述每个程序的结果。

a、另存为网页（html）或PDF。

b、使用与SnapGene文件名匹配的正确文件名保存。

i、 saha_CD200_X1_XM_023500980.1_恐惧症

二。涙200 xmu参数

iii.saha_CD200_X1_xxm_023500980.1_信号

四、saha_CD200_X1_XM_023500980.1_ELM

v、 saha_CD200_X1_XM_023500980.1_智能

11. 如果你还没有一个基因表，创建一个电子表格并记录蛋白质的关键信息，这样你就有一个单一的参考来查找关于你的蛋白质的关键信息。您还可以将大部分信息保存在SnapGene文件中。

12. 使用每个预测工具的关键信息更新SnapGene文件的注释。

注意：在下面的步骤中，参考UniProt是很有用的，看看你的物种中的POI是否与人类的正位基因相似(https://www.uniprot.org/uniprot/P41217).

a、恐惧症：信号肽（SigP；图5）、细胞外结构域（ECD；图6）、跨膜结构域（TMD）、胞内结构域（ICD，又称胞浆结构域）（图7）。

图5。分配CD200信号肽。突出显示由SignalP标识的SigP序列，然后选择Feature→addfeature。当对话框打开时，在名称中粘贴序列号和后缀SigP（例如，saha_CD200_X1_XM_023500980.1_SigP）。将“类型”改为sig_肽。

图6。分配CD200功能域。从SnapGene中CD200注释的“序列”视图。要注释CD200序列，请突出显示由恐惧症识别的ECD序列，然后选择Feature→Add Feature。当对话框打开时，在名称中粘贴序列号和后缀ECD（例如saha_CD200_X1_XM_023500980.1_ECD）。勾选“Translate this feature in sequence view”（在序列视图中转换此功能）的框。对TMD和ICD重复此过程。您还可以为5'未翻译区域（5'UTR）和3'未翻译区域（3'UTR）添加功能。

图7。最终恶魔CD200注释域。SnapGene中CD200注释的线性“地图”视图。塔斯马尼亚魔鬼CD200转录本的地图视图，包括5'和3'UTR，以及预测的SigP、ECD、TMD和ICD。

b、信号肽和信号肽的预测。

c、 ProtParam：分子量，千道尔顿（kDA）。

d、 ELM：关键基序（如免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIM）、免疫受体酪氨酸基活化基序（ITAM）。

e、 SMART：免疫球蛋白（Ig）或肿瘤坏死因子（TNF）结构域。

13. 确保保存SnapGene文件。也可以将其导出为GenBank（.gb）文件作为备份。

14. 在SnapGene中，复制氨基酸序列并在CLC序列查看器中创建新的蛋白质序列。

a、包括你的基因序列。

e、 g.，saha_CD200_X1_XM_023500980.1

b、包括通用名。

e、 g，魔鬼

c、包括拉丁物种名称。

e、哈氏嗜肉菌

15. 为每个基因创建一个新文件夹。

e、克，CD200

16. 将文件保存到正确的基因文件夹中。

比较不同物种的POI

17. 使用NCBI“基因”数据库查找您的GOI名称（例如，CD200）。基因页面将有一个“同源基因”链接，显示该基因的所有已发表的同源基因（即不同物种的同一基因）。

18. 使用NCBI blast来寻找下面基因表中所列物种的同源物。

19. 同时下载多个序列（相关匹配基因的勾选框）。

20. 将文件保存到您的计算机或NCBI帐户。

21. 将蛋白质序列复制到CLC序列查看器中，并创建蛋白质比对（图8）。

图8。CD200的多物种蛋白质比对。排列下方的黑色条形图代表了八种物种中氨基酸的保存百分比。RasMol着色方案用于突出传统氨基酸特性（例如，绿色=脂肪族氨基酸-亮氨酸、异亮氨酸-缬氨酸），这有助于解释物种间的氨基酸差异。

22. 确定蛋白质的关键结构特征在物种间是否保守。

a、例如，形成二硫键的半胱氨酸

b、例如，保守的信号肽和跨膜结构域

B、设计表达式向量

1. 为基因选择一个表达载体（又名质粒）。

在这里，我们将通过将上面分析的塔斯马尼亚恶魔CD200插入我们的pAF164向量来演示这个过程。使用Addgene和Erik Kowarz实验室提供的睡美人质粒构建快速蛋白载体（Kowarz等人，2015年）。我们将使用限制性酶从pAF164载体中切出saha_TNFRSF9_XM_003765221.2-ECD DNA序列，然后使用Gibson组件（例如，NEBuilder）插入saha_CD200_X1 XM_023500980.1-SigP-ECD。

***关键步骤***

a、如果你正在制造一种可溶性蛋白质，那么你只需要把你的蛋白质的SigP和ECD的编码区（例如SigP-ECD）加入到你的表达载体中。

b、如果你要制造一个全长的细胞表面蛋白，那么你需要在你的表达载体中包含你的基因的整个开放读写框架（例如，SigP-ECD-TMD-ICD），但是一定要删除开放读写框架末端的终止密码子，这样开放读写框架继续到荧光蛋白编码序列的3'-端。

2. 在SnapGene中，将质粒的起始点设置为ORI 5'端的第一个碱基。这为我们库中的所有质粒创建了一个标准参考点。

a、打开SnapGene文件，将光标放在5'ORI的第一个基部和5'基部正前方的基部之间。

b、查看→设置原点。

3. 找到要替换的编码序列的位置（TNFRSF9 SigP ECD）（图9）。

图9。选择要替换为新GOI的GOI特征。质粒文件的地图视图和将被新的GOI替换的GOI区域。

4. 从“映射”视图切换到“序列”视图。

5. 确保要替换的GOI的整个编码序列都突出显示（图10）。

***关键步骤：确保只突出显示GOI；不要在GOI、TEV站点、链接器、6xHis、SalI限制位点或荧光蛋白（例如mOrange）之后突出显示SmaI/XmaI限制位点***

图10。将被新的GOI取代的GOI区域的序列视图

6. 切换到包含你的GOI的SnapGene文件。在本例中，我们将切换到在过程A中创建的saha_CD200_X1_XM_023500980.1文件。

7. 突出显示saha_CD200_X1_XM_023500980.1 SigP和ECD（图11）。

***关键步骤：要获得分泌蛋白，您需要确保只有GOI/POI的SigP和ECD包含在新的质粒结构中***

如果SignalP算法预测您的POI具有弱SigP，那么您可能需要用更强大的SigP替换SigP。我们经常使用仓鼠白细胞介素2（mau_IL2_NM_001281629）SigP，因为我们使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产我们的蛋白质，因此仓鼠SigP工作良好。这种蛋白的SigP通常在内质网中被信号肽酶切割掉，因此通常不包含在成熟分泌蛋白中，不应改变下游功能。基本上，一个强大的SigP将在这个过程结束时产生更高的蛋白质浓度。

a、 mau_IL2_NM_001281629_SigP DNA:atgtacagcatgcagtcatcctgtcttgcactgacgtcgctctcttgtcaggt

b、 mau_IL2_NM_001281629_SigP蛋白质：MYSMQLASCLALTLALLVSS

图11。POI的SigP ECD。要插入到表达载体中的GOI的DNA文件的映射视图。确保选择SigP+ECD。如果你没有SigP，那么你可以考虑使用来自不同基因的SigP。我们通常使用仓鼠IL-2sigp，因为它在CHO细胞中工作良好，而CHO细胞是用来产生可溶性蛋白质的。

8. 切换回pAF164质粒文件。

9. 重命名该文件，这样就不会销毁以前的文件。

pAF176_OFP是魔鬼CD200 mOrange快速蛋白质

10. 将复制的saha_CD200_X1_XM_023500980.1_SigP-ECD粘贴到pAF176文件中以前的GOI所在的位置（图12）。

图12。新的CD200表达载体（pAF176）。POI以蓝色突出显示。注意，荧光蛋白3′端的终止密码子应该是整个ORF中唯一的帧内终止密码子（5′端SigP到mOrange的3′端）。

11. 更新pAF176_ORF特性，使其从SigP开头的ATG start密码子运行到mOrange末尾的TAG stop密码子（图13）。

对于saha_CD200_X1_XM_023500980.1融合到mOrange的pAF176，准确的DNA位置应该是4246到5745。这将产生1497bp的ORF和690个氨基酸的蛋白质。注意，开放式阅读框中碱基对的数目应该总是可以被3整除，因为每个氨基酸都需要一个三碱基对密码子。如果你的ORF不能被3整除，那么这个蛋白质可能已经超出了框架，不能产生正确的蛋白质。

图13。更新ORF以匹配新插入基因的ATG起始密码子

12. 检查更新后的pAF176序列，确保完整的ORF在帧中。例如，saha_CD200_X1_XM_023500980.1 mOrange快速蛋白质N端（即CD200起始端）的ORF应具有MELQV（图14），而C-端（即mOrange端）应具有DELYK*。“*”表示终止密码子。

***关键步骤：确保序列中没有早期终止密码子。这可能是因为在结构中包含了你的GOI的ICD，这将导致链接器和荧光报告蛋白没有被翻译***

图14。新ORF的N端。如果你使用的是塔斯马尼亚魔鬼CD200，那么确保N-末端与这里显示的MELQV氨基酸序列相匹配。如果你插入了一个不同的基因，序列会不同，但是起始位置应该是相同的（如果你在步骤B2b中正确地“设置原点”，那么位置4246）。

13. 在这一点上，你有一个完整的硅质粒构造。下一步，我们需要开发一种方法，把我们的GOI的实际DNA放入这个结构中。有两种选择。第一种也是最简单的方法是从商业供应商（例如IDT-DNA）订购一个合成的双链DNA块（例如gBlock）。如果你确信你知道你的GOI的确切顺序，那么我们推荐这个选项。如果你对你的DNA序列没有100%的信心，那么最好用PCR扩增你的GOI。这两种方法都要求插入表达载体的DNA序列与表达载体中的插入位点至少有20bp的重叠。在提供的pAF164向量中，我们将重叠区域注释为“Gibson_5''u overlap”和“Gibson u3''u overlap”。如果您想在开始自己的序列之前使用它来练习复制一个工作结构，那么包含魔鬼CD200序列的pAF176向量可以从该协议的作者那里获得。

a、 gBlock方法：高亮显示Gibson u5''u重叠+SigP+ECD+Gibson u3''u重叠，并创建一个新特性pAF176 gBlock。

对于本例，gBlock应该是778 bp。

b、 PCR方法：创建一个正向和反向引物，从你的物种的cDNA中扩增插入物（图15）。

i、引物将包含18-30个碱基，与你的甲状腺肿5'-端相匹配。与您的GOI匹配的退火（即熔化）温度应至少为55°C。对于pAF176结构，与saha U CD200_X1_XM_023500980.1的匹配可以是21 bp（~57°C）：ATGGAGTGCAAGTATGAG。

二。引物还需要包含延伸，以在PCR扩增的每个周期中添加载体重叠区域。

iii.使用光标突出显示Gibson 5''u重叠部分的5'-端，直到您的GOI底漆（总共59 bp）：gtgaaactccccagtggcctgcgcgccccacatggaggcagccagtagcaagtagagtacatgg。

四、请注意，底漆设计的一般原则应该遵守，但我们发现大多数底漆都会在第一次试用时起作用。我们尽量让我们的引物以C或G结尾，并避免引物末端重复（例如GG或CC）或三倍，但如果GOI重复时间较长且没有其他选择，则可以接受。

v、重复步骤i-iv，为您的GOI的3'端构建反向引物。

图15。吉布森装配底漆。前向引物用于扩增GOI，侧翼区域并提供与载体主干的序列重叠。

14. 从商业供应商处订购gBlock或底漆，并继续执行程序C。

C、组装表达式向量

笔记：

a、我们将基本上使用Gibson组装过程（，但我们通常使用NEBuilder工具包。吉布森等人，2009年）

b、全套引物、gBlocks和质粒可从与本方案相关的出版物的补充材料中获得。Flies等人，2020年）

用Gibson组装法将DNA插入到表达载体中

exp_ID_1:在（实验电子表格）中插入_PCR标签

1. 在打开装有g块或引物的小瓶之前，以10000 x g的速度旋转瓶子一分钟，以确保所有的冻干DNA都在小瓶底部。

2. 在无菌去离子蒸馏水（ddH2O）中将gBlock和/或引物稀释至100μM。TE缓冲液也可以使用，但ddH2O对我们很有效。

3. 如果要在表达式向量中插入gBlock，请跳到步骤C14。

4. 执行触地PCR扩增并扩展目标GOI。

在初始扩增过程中，延伸引物的退火温度较低（~60°C），因为只有约50%的引物与目标DNA结合（图16）。目标DNA扩增后，引物退火温度将更高（例如68°C）。为了解释靶特异性和扩增稀有靶转录物的困难之间的潜在权衡，我们使用了触地PCR。我们从较高的退火温度开始，在前十个循环中，每一个都将温度降低1℃。然后我们在更高的退火温度下运行额外的25-35个周期以增加特异性。

图16。重叠延伸聚合酶链反应将5'和3'重叠部分添加到GOI上，组装到表达载体中

5. 用高保真聚合酶建立PCR反应。我们使用新英格兰生物实验室Q5®热启动高保真2x主混音。

6. 当PCR进行时，注入1%TAE琼脂糖凝胶和核酸染色。

7. PCR结束后，用凝胶负载缓冲液稀释20μl反应混合物。

8. 将~20μl反应+溴酚蓝凝胶负载缓冲液添加到凝胶上的适当通道中。

注意：你需要一个深井来加入20μl的体积，但最好尽可能多地使用DNA，因为凝胶中的DNA回收率可能很低。

9. 在1x TAE缓冲器中以100 V电压运行约30分钟。

10. 在蓝光透照仪上观察凝胶。

如果没有蓝光透照器，可以使用紫外线光源。应该注意限制DNA暴露在紫外线下，因为这会损害DNA，并且是下游克隆问题的一个重要来源。用无菌剃须刀或塑料切割工具在目标DNA带周围切割。确保不要直接切割紫外线/蓝光的玻璃，否则会损坏玻璃。为每一条带使用一个新的刀片，以防止样本之间的DNA携带。

11. 用市售DNA凝胶纯化试剂盒纯化DNA。

12. 使用A280 DNA设置在纳米分光光度计上对DNA进行定量。

13. 用TE将DNA稀释至10 ng/μl，并在-20°C下储存DNA，直至需要。

制备质粒DNA，组装到表达载体中

实验2：质粒摘要（实验电子表格）

14. 解冻质粒pAF137（或其他需要的载体）并保存在冰上。

15. 冰上解冻限制酶（如NotI HF、SmaI）。

注：XmaI和SmaI都有相同的识别位置，但SmaI产生钝切，因此在Gibson组装过程中不太可能重新退火。

16. 按照制造商的说明混合DNA和限制性酶。

***关键步骤：不完整的摘要是下游问题的主要来源，因此确保摘要干净至关重要***

在我们通过在一个成功的装配中使用摘要确认了一个干净的切割之后，我们保留摘要并在以后的装配中重用。

17. 方案1：制备1%琼脂糖凝胶，核酸染色，可容纳60μl反应混合物+溴酚蓝负载缓冲液。我们通常是通过在梳齿的两颗牙齿之间放置一条胶带来完成这一点的。

方案2：使用2-4口井装载整个60μl的体积。如果你使用选项2，你必须从凝胶上剪下几条带而不是一条。

18. 将消化后的DNA加入凝胶中。总是包括未消化的质粒作为对照和DNA梯来估计带的大小。

19. 在1x TAE缓冲器中以100 V电压运行约30分钟。

20. 在蓝光透照器上观察凝胶（图17）。

Figure 17. Image of digested and undigested plasmid DNA migration in agarose gel electrophoresis. Lane 1 shows the DNA ladder and lane 2 shows the plasmid in its native state (i.e., no restriction digest). Lane 3 shows a plasmid that has been digested with two different restriction enzymes. When each enzyme cuts only one site in the plasmid, this results in two fragments. The upper band needs to be excised and purified and then used to assemble your new plasmid. The lower band is the fragment that needed to be removed from your plasmid prior to assembly. Lanes 4 and 5 show plasmids that have been digested with a single restriction enzyme. Note that circular DNA (lane 2) travels through the agarose gel faster than linear DNA (lanes 4 and 5) even when they are equivalent size. Image adapted from Addgene (https://blog.addgene.org/plasmids-101-how-to-verify-your-plasmid).

21. Purify the DNA using a commercially available DNA gel purification kit.

22. Quantify the DNA on a NanoDrop spectrophotometer using the A280 DNA setting.

23. Store the digested DNA at -20 °C until needed.

组装表达式向量

实验3：质粒组装（实验电子表格）

24. 计算所需的质粒DNA、插入DNA和Gibson组装主混合试剂（如NEBuilder）的数量。

a、我们通常使用1:3的比率质粒：插入单个嵌件小于1000 bp。

b、我们在10μl反应中也使用了50ng的消化质粒DNA，而不是制造商推荐的20μl组件。

25. 融雪大师的DNA混合。

26. 把DNA和试剂加入混合物中。

27. 使用NEBuilder阳性对照（制造商提供）作为阳性对照。

28. 单个插入物在50°C下培养60分钟。15分钟就足够了，但60分钟似乎效果更好。

29. 将样品储存在冰上或冷冻直到需要。最好在一天内完成装配，但是存放14天的装配仍然可以工作。

转化细菌组装表达载体用于质粒扩增

注：使用一套单独的移液管进行细菌培养和无菌细胞培养。

30. 将带有LB琼脂和100μg/ml氨苄西林的细菌生长板转移到37°C的培养箱中进行预热。

31. 用1.5ml微乳管中的DH5α活性菌进行转化。

32. 在冰上解冻细菌，并准备在细菌解冻后立即（2-5分钟）将组装好的质粒添加到细菌中。

33. 直接向细菌中加入2μl（10 ng）的DNA组件，并用移液管将细胞上下5倍混合。

轻轻拍打小瓶，确保DNA与细菌完全混合。

34. 立即将小瓶放在冰上，培养30-45分钟。

下一步需要从冰快速过渡到42°C再回到冰上。在42°C下设置一个微型加热块或在42°C下准备水浴。我们使用水浴获得了更一致的结果。如果没有水浴槽，可以使用任何液体容器，在热冲击步骤前立即将其装满温水并将温度调节至42°C。

35. 将细菌瓶从冰上转移至42°C 30 s。

36. 转移回冰上至少两分钟。

37. 向每根管中添加950μl SOC介质。

38. 把管子关紧。

39. 将试管转移到轨道振动筛上，设置为至少180转/分。水平存放试管或以45度角存放有助于确保正确混合。

40. 在37°C的摇床上孵育60分钟。

41. 在8000 x g下旋转转化细菌30秒。

42. 用100μg/ml氨苄西林在100μl LB培养基中重新培养细菌，并用氨苄西林转移到LB琼脂平板上。

43. 用细菌撒布器将细菌均匀地分布在盘子的一半上。

44. 用一个接种环把细菌划到盘子的另一半。即使转染效率高或低，这种方法也能产生可单独识别的菌落。

45. 将残留细菌储存在4°C的小瓶中，以防出现下游问题。

46. 将培养皿在37°C下培养过夜。

进行菌落PCR以确定细菌中是否存在插入物

实验4：菌落PCR（实验电子表格）

47. 在细菌电镀后18小时内检查菌板。计算每个平板上的菌落数。

***关键步骤：如果新组件上的菌落数量至少高出5倍，阴性对照板上的几个菌落是可以的。阳性对照板的菌落数应过多***

48. 确定要测试的菌落数。

49. 创建一个克隆PCR协议（参见协议电子表格中的“克隆PCR”选项卡）。

50. 使用pSB_EF1a_顺序以及pSB_顺序版次扩增快速蛋白质编码序列的整个开放式阅读框。正向引物与GOI上游的EF1α启动子结合，反向引物与荧光蛋白编码序列下游的bGH-UTR区结合。

51. 根据扩增的DNA和引物的长度，使用SnapGene计算扩增子的预期大小。

52. 标记符合方案的PCR管。

53. 创建一套额外的PCR管，以匹配要测试的菌落。在试管上贴上“细菌管”的标签。

54. 向每个细菌试管中添加10μl无菌PBS。

55. 用标准缓冲液（NEB#M0488L）解冻底漆和OneTaq®热启动快速加载®2x主混合物。

OneTaq主混料含有凝胶加载缓冲液，因此在运行凝胶之前不要添加额外的加载缓冲液。

56. 根据“菌落PCR”电子表格中的方案混合PCR试剂。

57. 将PCR混合液分配到菌落PCR管中。

58. 用过滤过的移液管尖轻轻地接触其中一个选定的菌落。

***关键步骤***

a、确保只接触一个殖民地，而不是整个殖民地。混合两个菌落会导致失败。另外，如果出现其他问题，菌落可能必须用来开始新的培养，所以在菌落中留下足够的细菌来接种新的培养物。

b、尽量不要把琼脂放在尖端，因为太多会使PCR过载。即使是一种细菌也应该有足够的DNA来进行PCR。

59. 将带细菌的移液管尖端插入含有10μL无菌PBS的适当“细菌管”中。用移液管上下吸几次，并在试管周围拖动尖端，以确保有些细菌留在PBS中，有些细菌留在尖端。如果菌落PCR产生阳性结果，这些试管是接种过夜培养物的细菌储备。

60. 将带细菌的尖端直接转移到合适的菌落PCR管中。用移液管上下吸几次，并将尖端绕管拖拉，以确保有一些细菌转移到菌落PCR管中。

61. 将针尖扔进漂白剂中，每增加一个菌落，重复上述步骤。

62. 在55°C的退火温度下进行30-35个周期的PCR反应。有关更多详细信息，请参阅实验模板。

63. PCR进行时，注入1%TAE琼脂糖凝胶和核酸染色。

64. 从菌落PCR管中转移10μl到凝胶上的适当孔中。

65. 在1x TAE缓冲器中以100 V电压运行约30分钟。

66. 记录凝胶的图像。

67. 确定哪些通道/管道具有正确尺寸的放大器（图18）。

图18。菌落PCR琼脂糖凝胶电泳示例。所示的三条强带与包含所需插入物的质粒的预期大小相匹配。从符合这些结果的5个细菌菌落中选择5个，并在37℃下用氨苄西林在5ml LB培养基中培养过夜（不超过16h），并以200 rpm振荡。

68. 通过将5ml LB培养基和100μg/ml新鲜解冻氨苄西林转移到无菌50ml试管中，为产生正确大小的扩增子的菌落建立过夜培养。

69. 从“菌管”中移入5μl于适宜的50ml试管中，接种过夜培养物。

a、未经转化的细菌不能形成氨苄西林阴性对照。NEBuilder阳性对照细胞或任何对氨苄西林耐药的细菌都可以作为阳性对照。

b、在37°C下，以至少180 rpm的转速在摇床上孵育过夜。

70. 隔夜培养后（少于16小时），检查细菌是否增殖。一个浑浊的（即浑浊的）试管表明细菌已经繁殖。

Miniprep从细菌中分离质粒DNA

71. 在显示细菌增殖的试管上贴上2毫升的微乳管标签。

72. 将1.5毫升的细菌肉汤转移到适当的微乳管中。

73. 以8000 x g的速度旋转30秒。

74. 用移液管移走上清液。

75. 将另1.5 ml相同的细菌肉汤转移到各自的试管中，再次旋转并去除上清液。如果细菌产生高拷贝数的质粒，那么第二步就不需要了。

76. 按照制造商的说明进行miniprep程序。

保证细菌完全裂解释放质粒DNA是获得高产量质粒DNA的关键。

77. 使用纳米滴分光光度计上的A280 DNA装置对DNA进行定量。

用质粒DNA试剂盒提供的洗脱缓冲液使分光光度计空白。

78. 把质粒DNA储存在冰箱里，直到你准备好对DNA进行测序。

质粒DNA测序

我们强烈建议您使用商业DNA测序服务提供商对您的DNA进行测序。例如，在澳大利亚，有许多澳大利亚基因组研究机构（AGRF）收集点，在那里可以提取带有测序引物的DNA。测序结果通常在1-2天内返回。如果你所在的机构有DNA测序机，请联系机器的经理以获得正确的协议和建议。下面的协议是特定的使用应用生物系统3400基因分析仪与大染料终结者（BDT）。其他试剂和测序机将有不同的协议。

实验5：质粒测序（实验电子表格）

79. 为测序PCR标记PCR管。

PCR测序只需要一个引物，而普通PCR只需要一个正向和反向引物。然而，你需要从正向和反向两个方向对质粒插入物进行测序，因此每个质粒需要两个反应。

a、 pSB_EF1a型_顺序：结合DNA插入物的上游。

b、波黑_顺序版次：结合DNA插入物的下游。

80. 在冰上提取引物、质粒、测序缓冲液和BDT。

a、引物和质粒保存在-20°C。

b、测序缓冲液保存在4°C。

c、 BDT在-80°c下储存在10μL等分试样中。

购买一个BDT工具包是一个相对较大的投资，所以希望您可以使用一个排序服务，而不是自己做整个过程。

81. 准备测序混合物。

多做一点，以确保你不会用完最后一根管子。

1x体积（μl）

序列缓冲液1.75

大染缸0.25

DNAμl（质粒100-500 ng）X

底漆1

向10μl 10-1.75-0.25-X-1中添加H2O

82. 将ddH2O等分放入PCR管中。

83. 将小份DNA放入PCR管中。

84. 将小份引物放入PCR管中。

85. 将总BDT+测序缓冲液和等分试样混合到PCR管中（2μl/管）。

86. 在热循环器上进行序列反应。

d、在96℃下变性10 s。

e、在55°C下退火5s。

建议使用50°C，但退火温度通常较高，因此我们通常使用55°C。

f、在60°C下延长4分钟。

g、运行35个循环

25个周期应该有效，但通常会在距离5'起始区域70 bp的结果中产生残留的“染料前沿”。

用Agencourt CleaneQ清洁你的测序反应

87. 旋涡清洁管，使任何可能已沉淀的磁性颗粒重新悬浮。

88. 向每个样品中添加10μl CleaneQ。

89. 根据下表向样品中添加42μl 85%乙醇。

90. 通过移液管混合或更换盖子并倒置几次，彻底混合反应。混合后应均匀混合。

91. 将样品放在磁性板上3分钟。等待溶液澄清后再进行下一步。

92. 吸取干净的溶液并丢弃。必须在磁性板上执行此操作。

93. 不要打乱粘在管子边缘的珠子环。

***关键步骤：用移液管小心移液，避免将珠子带入测序分析***

94. 加入100μl 85%乙醇。

95. 孵育30秒。

96. 抽吸并丢弃乙醇。

97. 重复步骤95-97一次。

98. 在室温下干燥样品至少15分钟。

***关键步骤：确保样品完全干燥，残留的乙醇会影响结果***

99. 加入30μl水，用移液管混合，或通过添加盖子和倒置几次来再次混合。在室温下培养2分钟。

100. 除去15μl透明液体，避免任何珠子，并将其添加到96孔测序板中。小心不要打乱珠子环。

101. 通过将平板放入热循环器（灰色隔膜盖已就位）并在95°C下加热5分钟，使清洁的序列产品变性。确保加热盖功能关闭。

102. 反应板现在准备好加载到定序器中。

103. 请让测序机的经理设置您的第一个协议。

结果分析测序

该协议展示了如何使用SnapGene分析结果，但也可以使用许多其他程序，包括Genomics Workbench Sequence Viewer。

104. 从测序机导出.abi文件并将其保存在实验数据文件夹中。

105. 其他关于测序过程的信息是可用的，但是.abi文件提供了评估质量和与质粒文件对齐的色谱图。

106. 打开你的质粒的SnapGene文件。

107. 单击对齐按钮。

108. 单击“对齐导入的序列”。

109. 找到你的.abi色谱文件。

110. 首先检查“地图视图”比对，以了解测序结果相对于整个质粒的排列位置。

111. 下一步点击“序列视图”标签查看DNA比对。

***关键的一步：你的顺序需要完美。如果你的测序结果显示有替换、插入或缺失，你需要从你的琼脂平板中挑选一个新的菌落，并进行另一个菌落PCR、过夜细菌培养、质粒纯化和测序反应***

注：色谱图的开始和结束可能会很混乱，因此，如果需要，请向更有经验的同事咨询解释这些区域的结果。

D、用表达载体转染真核细胞系

现在你已经组装并测序了你的质粒表达载体，质粒DNA可以用来生成你的POI。睡美人转置系统（更多信息请访问https://blog.addgene.org/sleepping-beauty-awarks-for-genome-engineering)在快速蛋白载体应该是有效的在许多不同的细胞系，但当选择一个细胞系来制造你的蛋白质时，应该考虑。多合一载体包含转座子盒（即在细胞系中表达的POI）和转座子酶（即，将货物插入细胞基因组的酶），因此只需转染一个质粒，而不必为转座子和转座子分离质粒。一旦进入细胞，巨细胞病毒启动子（CMV）将驱动转座酶的高表达。然后转座子酶结合转座子盒的反向末端重复序列，并将盒从质粒中切出。剩下的质粒DNA被降解。该盒插入宿主细胞基因组中的“TA”二核苷酸之间，因此插入位置几乎可以在任何地方，并且可以将多个拷贝整合到单个细胞中。作为正常细胞调节过程的一部分，过度转座酶应该随着时间的推移而降解。

成功整合到基因组中的盒式磁带是永久整合的。由于插入位点可以位于基因组中含有“TA”二核苷酸的任何位置，因此插入位点可能会影响细胞功能。例如，如果盒插入对细胞分裂至关重要的宿主细胞基因的编码区，宿主细胞将不再分裂并最终死亡。另一种选择是，该盒可以插入基因组的一个非活性区域（例如高度甲基化），这可能导致POI的表达降低。然而，我们已经在我们的一些睡美人细胞系上执行了RNAseq，而GOI的转录本通常是细胞中表达最高的转录物之一（即细胞制造大量这种RNA）。

我们用CHO细胞制造我们分泌的大部分蛋白质。我们还使用CHO细胞进行细胞表面蛋白的初步测试，因为据报道这些细胞不表达Fc受体，而Fc受体可以与具有Fc区域的快速蛋白质结合，并在下游实验中与次级抗体结合。CHO细胞用于制造临床使用的大多数蛋白质，并产生与其他哺乳动物细胞系类似的蛋白质糖基化模式（Zerbino等人，2018年）。一个基本的贴壁CHO-K1细胞系可以用于这种蛋白质生产的所有方面。我们已经切换到悬浮ExpiCHO细胞系，可以在无蛋白培养基中高密度（5×106个细胞/ml）生长。我们建议从低传代的CHO-K1细胞系开始，以保持简单和廉价。

当你开始对你的蛋白质进行功能测试时，你很可能需要使用你研究物种的细胞系。我们已经用这个系统制造了几十个魔鬼面部肿瘤细胞系。我们还转染了人（例如HEK-293，K562）和狗（A-72，DH82）细胞系。一个类似的睡美人系统已经被用于制造人类临床试验的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T），因此该系统应该对免疫细胞起作用，但是我们还没有尝试过。

快速批取蛋白质后，可收集转染后3-7天的培养上清液，用于检测您的蛋白质。一个好的蛋白质产量将需要高转染效率（即，在烧瓶中至少有一半的细胞将转座子盒整合到基因组中）。如果你的GOI和随后的POI不能整合到基因组中，它可以直接从质粒中表达出来。然而，未整合的质粒DNA将在几天内降解。我们通常建立稳定的细胞系，而不是从最初的转染中收集蛋白质。除非你的转染效率是100%，这是不太可能的，否则你需要对你的细胞进行分类或者使用药物选择来建立一个稳定的细胞系。基于荧光蛋白表达的细胞分类很快，因为可以在第二天完成，但是我们观察到转染后不久进行细胞分类时细胞死亡率很高。因此，只要荧光报告物通过显微镜观察到或取一小份细胞并通过流式细胞仪运行，我们就添加高浓度的选择药物（例如潮霉素）。我们用潮霉素、基因素（G418）、囊胚霉素和嘌呤霉素进行筛选。所有这些选择药物都有效，但我们发现潮霉素的选择是快速和完整的。由于许多这些药物通过破坏DNA来杀死细胞，所以你的耐药基因的表达需要很高，以避免不必要的DNA损伤。这是至关重要的，如果你要做细胞系功能测试。

我们使用聚乙烯亚胺（PEI）与DNA以3:1的比例（每1μg DNA 3μg PEI）进行大多数转染。它是最便宜的转染试剂之一，可以多次冷冻/解冻，并且可以在-20°C下长时间储存。我们的转染效率一般为5-30%，有些标准认为这是很低的，但是CHO细胞的快速增殖使我们在大多数情况下可以在5-10天内形成一个完全选定的细胞系。

用热法制备PEI转染试剂（替代品见制造商）

Polysciences Inc.的协议（产品#23966–线性聚乙烯亚胺25000的协议）

1. 称取500毫克至2克贝聿铭粉。

2. 将PEI悬浮在烧杯中，加入500毫升至2升水（最终浓度为1毫克/毫升）。

3. 盖上容器顶部，加热至80°C，搅拌3小时，或直到溶液基本澄清。

4. 将溶液冷却至室温。

5. 将溶液的pH调至7.0。

6. 通过0.22µm膜的无菌过滤器

7. 等分到所需体积。

8. 将等分试样储存在-20°C。

哺乳动物细胞的转染

实验6：转染（实验电子表格）

注：如果您的质粒不包含荧光报告蛋白，那么我们建议您至少获得一个已验证的质粒，该质粒确实含有荧光报告蛋白。这将便于通过显微镜或流式细胞术监测转染效率和药物选择。

***关键步骤：我们强烈建议建立只表达基底载体（pAF112，pAF123）的细胞系，作为下游检测的阴性对照***

第0天：解冻细胞进行转染

9. 解冻至少1 x 106个CHO-K1细胞。

10. 加入cRF10中的T75烧瓶中。

11. 培养过夜，用新鲜的cRF10代替培养基。

注：如果细胞接近80%汇合，则传代细胞以保持对数期生长和细胞活力。

第2天：将小份细胞放入6孔板中

12. 从单元中取出介质。

13. 用5毫升无菌室温PBS冲洗。

14. 从烧瓶中取出PBS。

15. 向烧瓶中加入4 ml胰蛋白酶（即重组胰蛋白酶），分离粘附细胞。

16. 在37°C下培养3-5分钟。

17. 在显微镜下检查烧瓶。此时单元格应该是浮动的或是圆形的。

18. 轻轻拍打烧瓶侧面，分离剩余的弱粘附细胞。

19. 向烧瓶中添加8 ml cRF10。

20. 用移液管将细胞上下移5倍。每次，将培养基向烧瓶底部（即粘附细胞所在的位置）排出，轻轻地将弱粘附细胞从烧瓶中挤出。

21. 将细胞转移到50毫升的试管中。

22. 室温下在200 x g下旋转3分钟。

23. 用血细胞仪或自动计数器计数细胞。

自动计数器可用于细胞系，但通常不适用于原发组织（如血细胞）。

24. 在cRF10中将细胞稀释至1 x 105 cells/ml。

25. 将2.5 ml细胞（2.5 x 105个细胞）转移到6孔板中的每个孔中。

26. 隔夜孵化。

第3天：转染

27. 用显微镜检查细胞。在转染之前，细胞应该是50-70%融合。

a、如果密度太低，那就等到第二天。

b、如果密度太高，则丢弃此培养皿，并返回到第2天培养新一批细胞。

28. 在冰上解冻质粒和PEI转染试剂。

注：将质粒和PEI完全解冻（即试管内无固体残留）。

29. 解冻时，为每一个质粒标记一个微型胶管。

30. 以60μg/ml的浓度在PBS中制备PEI的主混合物，并将其置于微胶囊管中（对于较大的转染，则为15ml试管）。

制作1.2倍的总量，以确保有足够的主混料。如果每个质粒中有1.0μl的质粒，则每个质粒的产量为1.0μl。

31. 向主混合管中添加PBS。

32. 在主混合管中加入PEI。

33. 用移液管轻轻搅拌。不要涡流。

34. 将100μl PBS加入到每个质粒的微管中。

35. 将2.0μg质粒DNA添加到适当的微管中（例如，每100μl PBS中2μg DNA）。

36. 用移液管轻轻搅拌。不要涡流。

37. 从主混合物（PBS中的PEI）中加入100μl到含有质粒DNA的微胶囊管中。这应该给6μg PEI，以达到3:1裴：DNA比率。

38. 轻轻吸管一次混合。不要涡流。

39. 室温下培养15分钟。

40. 吸入CHO细胞上的培养基。

41. 用2毫升新鲜的cRF10轻轻更换CHO细胞上的培养基。

42. 从DNA:PEI溶液滴到适当的井。

43. 轻轻地来回摇动盘子，将PEI:DNA复合物整个井。

注意：不要使板旋转。

44. 用转染试剂在cRF10中孵育3-24小时。

第4天：药物选择和监测

45. 第二天早上用2毫升热的cRF10代替培养基。如果毒性问题，则在3-6小时后更换介质。

46. 用荧光显微镜或流式细胞仪检测细胞转染效率。

a、如果你的质粒不包含荧光报告者，那么就包括一个标准的荧光蛋白载体（例如，GFP）作为阳性对照，以帮助监测转染成功率。

b、对于流式细胞术，我们通常收集漂浮的细胞并通过流式细胞仪运行。这将主要由死亡细胞组成，但应提供是/否的答案，以确定转染是否成功。

47. 一旦报告者可见或24小时后，立即添加选择试剂（即800μg/ml的潮霉素）。

48. 每天监测并记录荧光和汇合。

a、如果使用高剂量潮霉素，大量细胞死亡应在1-3天内发生。每隔一天取出漂浮细胞，用800μg/ml潮霉素代替新鲜的cRF10。

b、小的细胞集落应该在2-5天内开始形成。

c、在用胰蛋白酶分离细胞之前，允许将菌落分裂到至少20个细胞。

49. 当细胞在高剂量潮霉素中增殖活跃时，在第2天的步骤中使用胰蛋白酶传代细胞。

50. 当所有细胞都表达报告蛋白（即药物选择完成），或当所有细胞在烧瓶中看起来健康时，潮霉素剂量可降至100-200μg/ml。

51. 展开细胞并冷冻。

a、 3-5小瓶就足够了，除非你经常使用这些细胞。

b、对于分泌重组蛋白的细胞，我们通常会纯化一大批持续数年的蛋白质。

注意：如果您的载体用于制造表面蛋白或其他非分泌性蛋白质，那么您可以跳过D部分的剩余部分。请确保在-80°C的温度下至少冷冻两瓶细胞（至少1 x 106个细胞）。

第10-18天：收集上清液进行检测

52. 传代细胞至低密度（1×105个细胞/ml），置于T75烧瓶中。

53. 在这一步中，只要你在冰箱里有冷冻的存货，就可以省去选择药物。

我们在没有进行药物选择的情况下维持了3个月的睡眠美人转染细胞，并观察到靶蛋白表达的最低限度下降。

54. 让细胞增殖到90%以上的汇合处。

55. 收集上清液。

56. 在>3000 x g的温度下在4°C下离心15分钟。

57. 收集上清液并使用20 ml注射器和0.22μm PVDF过滤器去除细胞碎片。

58. 将上清液储存在4°C下，并在28天内使用。

我们观察到，在4℃的上清液中，一些快速蛋白质在2个月后仍能与预期受体结合。但是，蛋白质的稳定性是可变的，因此最好在收集上清液后立即测试蛋白质。

使细胞适应无蛋白培养基以产生大量纯蛋白质

59. 细胞可以从上面的步骤中使用，也可以从冰冻的小瓶中解冻。

60. 确保细胞完全经过药物筛选并在cRF5中培养。

目前正在进行的药物选择是可选的。我们通常保持低浓度的药物（例如，100μg/ml的潮霉素）。

61. 当细胞处于对数增殖期，汇合30-50%时，从烧瓶中取出一半的cRF5，换上热的CHO-EX-CELL无蛋白培养基。

a、任何不含蛋白质的CHO细胞特异性培养基都可以在这里工作，但是我们已经用CHO细胞外培养基得到了很好的结果。注意，这种CHO细胞外培养基需要添加4倍于RPMI的L-谷氨酰胺。

b、或者，可以从cRF5上清液中纯化蛋白质。组培柱应只纯化His标记的蛋白质，尽量少携带FBS成分（如牛血清白蛋白）。确保用于选择细胞系的药物（例如潮霉素）不包含His标签。

62. 重复步骤D61，但将所有培养基更换为CHO EX-CELL无蛋白培养基。

a、在这个阶段，细胞活力通常会下降。确保你有一个大于90%存活率的大批量细胞继续。

b、如果您使用悬浮培养系统，如旋转瓶或螺旋桨瓶，那么您需要以高密度（至少5x105个细胞/mL）种子细胞。

63. 从这里开始收集上清液。

a、离心上清液并如上所述储存在4°C。

b、这里可以省去过滤，纯化后的蛋白质将被过滤。

64. 用30ml CHO EX-CELL培养基接种5 x 106个细胞/烧瓶，将细胞扩大到3个T175烧瓶中。

65. 让细胞增殖至约80%汇合。

***关键步骤：不要让细胞融合超过80%，因为它们需要在转移到无蛋白培养基后始终快速增殖***

66. 继续传代细胞，直到收集到至少200毫升的上清液。

注意：细胞株并不总是很好地适应无蛋白培养基。如果您在扩展细胞系时遇到了反复的问题，那么您可能需要从cRF2.5培养基中而不是无蛋白培养基中纯化蛋白质。

67. 离心所有上清液并在4°C下储存。

68. 在24小时内纯化蛋白质，以减少异常的蛋白质聚集和降解。许多蛋白质会在较长时间内保持稳定，但最好的做法是在收集后立即纯化蛋白质。

蛋白质纯化

快速蛋白中POI和荧光报告子之间的连接肽中含有6个组氨酸残基（6xHis），便于纯化真核细胞分泌的蛋白质。基本方案是离心上清液以去除碎片，然后使用蠕动泵将上清液应用到亲和柱上。6xHis标签与柱中的Ni2+离子结合，然后使用高浓度咪唑洗脱蛋白质，后者与6xHis竞争结合Ni2+离子。

大多数大中型机构可能会有一个蛋白质纯化系统。我们建议四处看看你能找到什么。否则，一个基本的蠕动泵就足够了。塑料管可以在家居装修或家庭酿造车间找到。用于纯化的连接件应与您购买的蛋白质柱一起提供。确定流速为1 ml/min所需的泵速。可以将输出管放入量筒中，测量使10ml水流过色谱柱所需的时间。调整泵，并根据需要重复多次，直到确信流量准确为止。注意，当连接色谱柱时，流速可能略有变化。还要确定你的管子从入口到出口的液体体积。这有助于洗脱步骤，所以你不会收集不必要的流量通过你的蛋白质收集管。

将流速校准到1毫升/分钟后，将泵插入一个简单的电源插座计时器，当您在色谱柱中运行大量上清液时，可以让您离开。

当前可在此处找到HisTrap excel列的制造商协议。

69. 准备配方电子表格中列出的所有必要解决方案。

a、 5 M咪唑。

b、 HisTrap excel平衡缓冲液（20 mM磷酸钠，0.5 M NaCl，pH 7.4）。

c、如果计划进行几次提纯，则准备一个10倍HisTrap excel平衡缓冲液。否则，准备一个1x HisTrap excel平衡缓冲区。

d、 HisTrap excel洗涤缓冲液（20 mM磷酸钠，0.5 M NaCl，10 mM咪唑，pH 7.4）。

e、组氨酸洗脱缓冲液（20 mM磷酸钠，0.5 M NaCl，0.5 M咪唑，pH 7.4）。

70. 标记10个微囊管收集洗脱的蛋白质。

71. 混合所有含有相同蛋白质的上清液（例如pAF176上清液）。

a、如果一些上清液小份是新鲜的，有些是大于7天的，那么最好只纯化新鲜的上清液。

b、在此步骤之前，所有上清液应在>3000 x g和4°C下离心15分钟。

注：上清液可通过0.45μm PVDF膜过滤以去除碎屑，但对于我们团队通常用于6xHis tag纯化的HisTrap excel纯化柱，则不需要这样做。

72. 用平衡缓冲液稀释上清液1:1（v/v）。现在pH值应该是~7。如果pH值不在6和8之间，则用弱酸或弱碱进行调节。

73. 将输出管放入废物收集容器中。

74. 如果泵或您的蛋白质纯化机中的管子已经好几周没有使用了，或者在上次使用后没有正确地清洗，那么用1 M NaOH清洗管子。设置泵，将NaOH溶液吸入管道。在将足够的NaOH溶液注入试管中，然后停止泵，让其浸泡1-24小时，然后清空试管，用无菌水冲洗。

注意：在使用NaOH进行蛋白质纯化之前，确保将所有NaOH从试管中取出。

75. 用无菌ddH2O填充泵管。

注意：在整个过程中，确保管道入口完全浸没在所有溶液中；管或柱中的气泡会破坏您的纯化和蛋白质。

76. 从柱子顶部取下塞子。

77. 将泵设置为以低流速（<1 ml/min）运行，并让ddH2O滴到柱顶部的进气口，以排出空气。少量ddH2O应溢出色谱柱，因为这有助于确保进气口中没有空气。

78. 停止泵。

79. 将管接头拧入色谱柱，确保色谱柱中没有空气滞留。

***关键步骤：确保没有气泡进入色谱柱***

80. 拆下柱出口的卡扣端。

81. 将进气管移入平衡缓冲器。

82. 用5个柱体积的平衡缓冲液以1ml/min的速度使柱平衡。

83. 停止泵。

注意：小心操作管子，以免空气在转移过程中进入管子。

84. 将进气管浸入样品容器底部。

注：如果样品在量筒中（确保它是干净的），那么您将精确地知道您的样品体积，并可以相应地设置计时器。

85. 将输出管转移到干净的“过流”收集容器中。如果因为某种原因你的纯化失败了，那么你可以重新运行这个流程来挽救蛋白质。

86. 将计时器设置为通过色谱柱运行约80%的样品体积。

87. 启动泵。

88. 启动计时器。

a、确保在从平衡缓冲液到样品的过渡过程中监控试管。如果观察到油管中有气泡，则断开油管与色谱柱的连接，并将气泡挤出。然后使用上述“滴对滴”方法重新连接油管和柱。

b、确保在计时器接近停止点时监控泵。如果你的流速比预期的要快，那么你可能会把空气吸入色谱柱，破坏你的蛋白质。

89. 如果样品残留在容器中，重新启动泵，并让其运行，直到样品几乎消失。最好在容器中保留几毫升样品，而不是试着每滴都要冒着把空气引入色谱柱的风险。

90. 停止泵。

91. 将进气管浸入清洗缓冲罐中。

92. 启动泵。

93. 将20柱体积的洗涤缓冲液通过色谱柱。

94. 停止泵。

95. 将进气管浸入0.5 M咪唑洗脱缓冲液中。

96. 启动泵，并将数毫升注入流量容器中。

注：流入流体的体积由管道所持的体积决定（即，长管需要更多的溶液流过以清除管道）。

97. 将输出管转移到您的第一个蛋白质收集微管中，收集~1ml。

98. 重复这个步骤，直到你收集了至少10毫升，并且确信你所有的蛋白质都已经被洗脱。

99. 检查蛋白质收集管。

注意：如果您正在纯化一种快速蛋白质，那么您只需将试管置于蓝光下，看看它们是否发出荧光（图19）。

图19。快速蛋白质洗脱管的图像。前几根管子可能只含有低浓度的蛋白质，中间的管子应该含有大量的蛋白质，最后几根管子应该含有很少或根本没有蛋白质。这表明荧光融合蛋白已从色谱柱中洗脱出来，表明荧光蛋白折叠良好。

100. 使用可小体积使用的分光光度计检查蛋白质浓度（例如，在纳米滴分光光度计上使用1μl）。

101. 在机器上设置消光系数，使其与程序A步骤9b中计算的消光系数相匹配，并使用纳米滴分光光度计上280 nm处的吸光度。

102. 用洗脱缓冲液使分光光度计空白。

103. 测量并记录每个蛋白质收集管中的蛋白质浓度。同时记录280 nm处的吸光度以及260 nm和280 nm处的吸光度比。这些可以显示你的蛋白质纯度。

104. 清洗色谱柱和试管时，将试管放在冰上。

105. 将进气管浸入平衡缓冲器中。

106. 启动泵。

107. 在色谱柱中运行10列卷。

108. 停止泵。

109. 将进气管浸入20%乙醇中。

110. 启动泵。

111. 在色谱柱中运行10列卷。

112. 停止泵。

113. 将转向柱出口盖（应与转向柱一起）拧到转向柱的出口上。

114. 将连接器从列中拧出。

115. 在色谱柱的进气口滴几滴20%的乙醇，以确保色谱柱中没有空气。

116. 将原来的塞子拧回柱中。

117. 将柱储存在含有20%乙醇的15ml试管中。列可以存储几个月（可能是几年），直到您需要重新使用它。

最好对每种不同的蛋白质使用不同的色谱柱，但是通过适当的洗脱和洗涤柱，如果预算有限，您应该能够对不同的蛋白质使用相同的色谱柱。在实验方法中应报告对不同蛋白质的重复使用。

118. 此时你的管子应该是干净的。可以将进气管连接到输出管以创建循环系统。如果你确信你的管子不会泄漏，那么你可以在里面放一到两天的乙醇，或者用水冲洗，以便长期保存。

蛋白质透析

119. 准备3L高压灭菌PBS。

120. 将PBS储存在冰上或4°C，直到PBS变冷。

121. 用冷的，无菌的PBS弄湿你的透析盒。

122. 把你的PBS转移到一个干净的1L烧杯里。

123. 将一个无菌的磁性搅拌棒放入带有铝箔的PBS盖中，并将烧杯放在冰上或4°C下。

124. 结合你的蛋白质收集管的溶液，这些溶液含有你的POI的合理产量。基本上，如果有些管子里没有蛋白质，那你就不需要它们了。

125. 把混合蛋白溶液转移到透析盒里。

126. 将磁带放入冷PBS中。

127. 将容器放在冰箱或冷藏室的磁力搅拌器上。

128. 把磁力搅拌器调到一个低转速，刚好足够让PBS在容器周围做圆周运动。

129. 搅拌至少一小时；只要温度为4°C，过夜即可。

130. 将盒式磁带转移到新的烧杯中，烧杯内装有新鲜、冷的PBS。

131. 再次搅拌至少一个小时。

蛋白质过滤和等分

***关键步骤：在无菌层流生物安全柜（BSC）中执行这些步骤。离心步骤将在层流平衡计分卡外部进行，但当在层流平衡计分卡外部时，管道应始终保持关闭***

132. 将一个50毫升的无菌收集管放在平衡计分卡的一个坚固的架子上。

133. 从平衡记分卡的20毫升注射器上取下柱塞。

134. 将0.22μm PVDF过滤器连接至20 ml注射器过滤器。

注意：注意不要触摸过滤器的出口，因为过滤器的下半部分需要保持无菌。

135. 向注射器中加入~5 ml冷的无菌PBS，以预湿过滤器。

136. 用移液管将透析过的蛋白质移到注射器内的PBS中。

137. 将柱塞放回注射器中，并通过过滤器将溶液轻轻排出至50 ml收集管中。

注意：一些残留液体会留在过滤器中，导致蛋白质回收率降低。用额外的PBS冲洗过滤器可以减少蛋白质的损失。

138. 将无菌蛋白质溶液转移到蛋白质旋转过滤装置（如Amicon ultra）。

我们通常使用Amicon超离心过滤装置，Ultra-15，MWCO 10kDa。大多数荧光蛋白大于20 kDa，我们的POI通常也大于20 kDa，因此可以接受较大的截止重量，而不会有丢失纯化蛋白质的风险。然而，我们的蛋白质是用无蛋白培养基在细胞培养中产生的，并且他的标签纯化了，所以使用10 kDa的截止值应该可以使蛋白质损失最小，纯度>90%。

139. 添加冷的无菌PBS，将旋转过滤器充满至最大容量（15 ml）。

140. 按照制造商的说明对装置进行离心分离。

a、确保溶液始终保持冷态。

b、在3000 x g条件下30分钟，溶液的浓度应为15毫升至3毫升。

141. 再次注入15毫升的冷无菌PBS进行第二次清洗。

142. 在3000 x g下离心30分钟。

143. 将装置放回无菌BSC。

144. 在这一步，即使只有可见光激发，高浓度的快速蛋白质也应该是可见的（图20）。

图20。浓缩的快速蛋白质。离心浓缩管中快速蛋白质的图像。即使使用可见光也可以看到高浓度的快速蛋白质。从左到右依次是mCherry、mCitrine、mOrange和mCherry。

145. 将浓缩的蛋白质转移到放在冰上的微型食品管中。

146. 按照程序D-蛋白质纯化中所述测量蛋白质浓度。

a、这次用冷PBS代替洗脱缓冲液空白。

b、在分光光度计中输入第A节第9b步中确定的准确消光系数。

c、记录吸光度比。

147. 如果浓度太低，再次离心过滤装置，以获得更小的体积。然后取另一份等份进行测量。

148. 重复上述步骤，直到蛋白质浓度至少为0.5mg/ml。

浓度应在0.5 mg/ml至2.0 mg/ml范围内，以确保分光光度计的准确度。

149. 可选步骤：用冷的无菌PBS将蛋白质稀释到1毫克/毫升或0.5毫克/毫升。这使得下游实验的计算变得容易。

150. 将你的蛋白质等分到无菌的1.5毫升的扣盖微型胶管中，并保存在冰上。

a、 10μl/管是理想的，因为你每次需要蛋白质时都可以解冻一批新鲜的蛋白质。

b、如果-80°C冷冻机的存储空间有限，则可等分50-100μl/管。

151. 在试管上贴上蛋白质名称、日期和浓度的标签。

152. 在-80°C下冷冻至需要。

a、如果你在下周内使用这种蛋白质，你可以在4℃保存一份。

b、我们的大多数蛋白质似乎能耐受几个冷冻/解冻循环，但最好只解冻一次，并使用整个等分样品。

E、检测重组蛋白

有很多方法可以测试你的蛋白质。SDS-PAGE和western blot可用于确认蛋白质大小和表位，详细协议可在其他地方获得（Consortium，2018）。然而，如果最终目标是确定受体-配体的相互作用，并且该蛋白在其他物种中已经得到了很好的研究，那么直接生产一种表达受体的细胞系，通过流式细胞术来测试结合可能是最有效的方法。这是我们将在程序E中描述的方法。

如果你的蛋白质可能对某些细胞类型产生功能性影响，那么功能测试也是一个不错的选择。例如，如果你制造了一种重组干扰素-γ细胞因子，那么你可以用一系列剂量治疗你感兴趣物种的原代细胞或细胞系，并通过qPCR评估MHC-I和PD-L1的上调。这将在一周内给你一个关于你的蛋白质是否有功能的答案。此外，检查商业供应商提供的人类和小鼠重组蛋白产品。在很多情况下，你可以尝试为你的物种复制他们的验证方法。

如果您为可溶性POI（如CD200）制作了受体（如CD200R1）的表达载体，则继续进行程序e。如果您还没有与目标受体建立细胞系，则重复程序a-D，但在设计插入物时，您需要保留目标受体GOI/POI的TMD和ICD。

流式细胞术检测受体-配体相互作用

实验7：流式细胞术（实验电子表格）

目的：

检测快速蛋白与转染受体的细胞系的结合情况（例如，CD200 mOrange或CD200 mTagBFP结合到CHO.CD200细胞系）。

概述：

一种向活靶细胞添加快速蛋白质的单步分析法。可溶性蛋白可以结合表面受体，留在细胞表面或通过受体介导的内吞作用进入细胞。通过使用氯喹或氯化铵阻止了所捕获蛋白质的溶酶体降解，使荧光信号随着时间的推移积累并产生更强的信号。在流式细胞仪分析之前，将细胞洗涤一次。

注意：如果你只有一种快速蛋白（例如，CD200莫兰奇），那么你就没有合适的阴性对照（例如，仅mOrange）。然而，通过对几种细胞系测试单一的FAST蛋白，您可以确定您的蛋白质是否与预期的细胞系特异结合。例如，只对野生型（CHO）检测CD200快速蛋白，仅检测载体(CHO.pAF112型)，CD200R1(CHO.pNP1)，和PDL1(CHO.pAF146)细胞系。如果CD200快速蛋白只与CHO.pNP1，那么就可以得出一个强有力的推论，即预期的蛋白质相互作用发生了。

解冻你原来的CHO细胞系，它能为每种颜色分泌快速蛋白质。这些可作为建立流式细胞仪的单色阳性对照。这些可以在cRF10分析前一天解冻，并在第二天使用。

在这项检测中，我们将准备一个“快速装载”板，其中包含最终染色浓度的快速蛋白质。这允许使用多通道移液管快速将治疗转移到靶细胞，并减少染色时间的变化。

关于可填充板布局，请参阅“exp_ID_流式细胞术”

步骤E所需的材料和试剂：

1. T75无菌组织培养处理过的细胞培养瓶，每个使用的细胞系有一个通风帽

2. 1x U形底部96孔板（无菌带盖）

3. 1个U形底部96孔板（无菌带盖），用于快速装载热处理的等分处理（即，这是“快速装载”板）

4. 无菌微型食品管-每种快速蛋白质使用1个

5. 无菌50毫升试管-每个细胞系2个

6. 无菌5毫升试管-每种细胞株1支

7. 自动移液器和10毫升无菌移液管

8. 移液管和无菌移液管尖（10μl、100或200μl和1000μl）

9. 流式细胞仪可以检测mTagBFP、mCitrine和mCherry

10. 离心机

11. 培养箱，37°C，含5%二氧化碳

12. 层流生物安全柜（即无菌罩）

13. 70%乙醇

14. 漂白剂

15. 温热胰管

16. 加热cRF5或cRF10（>300毫升）；CHO细胞使用cRF5，大多数其他细胞系使用cRF10

17. 潮霉素200μg/mL（H200）溶于cRF5。潮霉素储备通常为~50 mg/ml

18. 0.1 M氯喹。氯化铵可以代替氯喹，大多数实验室不需要购买新试剂，但我们通常使用氯喹

19. 快速蛋白质（μg–取决于使用的细胞系数量）*如有需要，解冻新鲜批次*。

20. 冷流式细胞仪缓冲液（不含EDTA–我们还没有测试EDTA是否影响细胞系的快速蛋白质结合）。一个健康的CHO细胞株不会结块，所以不需要EDTA

21. 温cRF5（~100毫升）

在实验开始前解冻并培养细胞

第0天：解冻细胞

1. 解冻cRF10中的靶细胞。

细胞系靶

CHO野生型

CHO.pAF123病媒控制

CHO.pMK1公司saha_CD200（全长表面蛋白）

CHO.pNP1saha_CD200R1（全长表面蛋白）

第1-2天：传代细胞

2. 用cRF5替换介质。检测开始当天，细胞融合率应<80%。根据需要传代细胞，以确保细胞在检测开始时处于增殖阶段。

第3天：结合试验

3. 在水浴中加热TrypLE和cRF5。

4. 在冰上解冻快速蛋白质。

5. 关于可填写表格，请参阅“exp_ID_Flow_Cytometry”表1–快速蛋白质稀释。

笔记：

a、蛋白质结合动力学受温度的影响，所以在不同的处理过程中保持一致的温度是很重要的。

b、避免使用板上的外部孔进行温度和水分含量很重要的分析。这些井加热最快，蒸发率最高。

6. 将5 ml cRF5转移到5 ml试管中。

7. 添加5μl 100 mM氯喹，使cRF5中的氯喹浓度达到100μM。氯喹被添加来阻止溶酶体的酸化，这使得内部的荧光蛋白积累并产生更强的信号（Qureshi等人，2011年）。

8. 用1.4μg的氯代蛋白快速转移到100μg/ml的氯代蛋白管中。

9. 将适量的FAST蛋白转移到microfuge试管中。

10. 将110μl稀释的快速蛋白质等分到U形底96孔板的适当孔中。

11. 将110μl PBS等分加入所有其他井。这是为了在没有电池的井中保持湿度和温度。

注意：将100μl从该平板转移到下面的分析板中。

12. 将快速加载板存放在37°C，盖上盖子，直到需要为止（不超过一到两个小时）。

贴壁靶细胞系的制备

13. 将培养基从T75烧瓶中的目标细胞倒入含有漂白剂的废水池中。

笔记：

a、试验结束时，贮存器中漂白剂的最终浓度应大于10%。

b、如果使用不粘附的不同靶细胞系（即悬浮细胞），则不需要胰蛋白酶，细胞可以直接转移到50毫升的试管中并离心。

14. 将5 ml室温PBS移入烧瓶中。

15. 轻轻地来回摇动烧瓶，冲洗细胞。

16. 将烧瓶中的PBS倒入废水池。

17. 在每个烧瓶中加入3毫升热胰蛋白酶。

18. 在37°C下培养5分钟。

19. 向每个T75烧瓶中添加7 ml热cRF5。

20. 用10毫升移液管吸出并轻轻地将培养基移到烧瓶底部（即有些细胞可能仍然粘附在那里）。

21. 用10毫升移液管将细胞转移到适当的50毫升试管中。

22. 以200 x g离心4分钟。

23. 将介质倒入废水池。

24. 在2ml温的cRF5（本步骤不含氯喹）中重新培养细胞。

25. 用自动细胞计数器或血细胞仪计数细胞。

笔记：

a、请参阅“exp_ID_7:流式细胞术”表格“细胞计数”以获取可填充表格。

b、参见上面的板布局。

c、每个细胞系每个孔25000-100000个细胞系是可以接受的，只要在细胞系之间是一致的。

26. 将适当体积的细胞储备转移到一个新的50毫升试管中（即体积达到1 x 106个细胞）。

27. 将试管加满至10毫升。

28. 以200 x g的速度旋转4分钟。

29. 旋转时，将1 x 105至1 x 106细胞等分回原烧瓶中，以备将来需要时进行实验。

30. 在T25烧瓶中加入cRF5和H200，使其达到5 ml，或在T75烧瓶中达到12 ml。

快速加载分析板

31. 从离心机中取出50毫升试管，并清除上清液（在去除上清液之前，务必检查颗粒）。

32. 将1ml cRF5+氯喹转移到试管中，用移液管移取5x，使1 x 106个细胞/ml重新悬浮。

33. 快速将100μl的细胞从合适的试管转移到合适的孔中（见上面的板布局）。

34. 用显微镜快速检查细胞，确保它们是圆的和健康的。

注：很难将透镜聚焦在U形底板上，但聚焦在孔的最底部可以很好地观察细胞，以确认它们的存在。

35. 只有在准备好加载时，才能从37°C的温度下拆下快速加载板。

36. 用多道移液管从含有快速蛋白质的快速装载板快速转移100μl到含有细胞的分析板上。

注：使用多通道移液管轻轻混合试管5倍。丢弃移液管尖端，每次转移时取新的移液头。

37. 在37°C下培养1至3小时。

准备供流式细胞术分析用的分析板

38. 以500 x g的速度旋转平板3分钟。

39. 取下板盖，将其倒置，然后倒出介质。

注意：如果您没有这样做的经验，请在使用真正的电池之前，在测试板中装满水并进行练习。当板子倒置时，表面张力使板中的液体保持不变。要卸下介质，请快速向下移动，然后平稳地停止移动，而不要将板向后推。

40. 在每个含有细胞的孔中加入100μl温胰蛋白酶。

41. 在37°C下培养5分钟。

42. 用显微镜检查细胞，确保细胞不再粘附在板上。

43. 添加100μl冷FACS缓冲液（含NaN3）。

44. 用移液管将细胞上下移5倍，形成单细胞悬浮液。

45. 在500 x g的温度下，在4°C下旋转板3分钟。

46. 取下板盖，将其倒置，然后倒出介质。

47. 使用多通道移液管在200μL的FACS中上下移动5x细胞。

48. 在4°C下培养至少15分钟。

笔记：

a、在此步骤中，将板存放在摇动平台上是有帮助的，但不是必要的。

b、对于预测低亲和力的快速蛋白质，最好直接在FACS缓冲液中运行细胞。

49. 以500 x g的速度旋转3分钟。

50. 在250μl的FACS缓冲液中重新投入，并转移到FACS管中。

注意：如果你的流式细胞仪有一个平板加载器，你可以直接从平板上运行细胞。然而，如果这是第一次尝试检测，最好是用试管而不是平板来检测细胞。

51. 保存在4°C，直到流式细胞仪分析。

流式细胞术

注意：如果这是你第一次做流式细胞术，那么你需要找一个有经验的同事来帮助你做这个检测。不要羞于跨越学科，这可能是一个很好的合作机会。

52. 从您的单色阳性对照细胞系（例如分泌快速蛋白的细胞-176.1帕乔).

53. 将5 ml室温PBS移入烧瓶中。

54. 轻轻地来回摇动烧瓶，冲洗细胞。

55. 将烧瓶中的PBS倒入废水池。

56. 在每个烧瓶中加入3毫升热胰蛋白酶。

57. 在37°C下培养5分钟。

58. 用显微镜检查细胞，确保它们看起来是圆的，没有粘附。如果细胞看起来是圆的，但仍然是粘附的，轻轻拍打烧瓶，将细胞从烧瓶中取出。

59. 向烧瓶中添加7 ml冷FACS缓冲液。

60. 用10毫升移液管上下混合，轻轻地将培养基移到烧瓶底部（即，有些细胞可能仍粘附在烧瓶上）。

61. 在4°C下以500 x g离心3分钟。

62. 在流式细胞仪固定缓冲液中彻底回收细胞。

63. 在4°C的黑暗中储存（即用铝箔包裹），直到需要。

注：固定细胞可以保存数月，并作为流式细胞仪设置的对照。

64. 激活你的流式细胞仪上的激光和滤光片来匹配你的荧光蛋白。如果您没有使用流式细胞仪的经验，请咨询流式细胞仪设备经理。

65. 创建分析样本的绘图。

a、前向散射高度相对于侧面散射高度（用于识别目标细胞群-即活细胞）。

b、前向散射区域相对于前向散射高度（用于排除双重点）。

c、 BFP高度对mOrange高度。

注意：你也可以为每种颜色创建一个直方图。

66. 使用流式细胞仪上的默认设置运行第一个样本（基于日常质量控制测试）。

67. 使用前向散射（大小）和侧面散射（粒度）属性确定目标群体。

68. 在你的目标人群周围画一道大门。

69. 使用前向散射区域和前向散射高度图确定单个单元格。

70. 在单个细胞群周围画一个门。

71. 为每个多色图添加象限门。这些门可以根据您的单色控制的荧光输出根据需要进行调整。

72. 运行你的单色控制和调整电压和补偿需要。这需要有经验的流式细胞仪用户。

73. 根据需要调整闸门。

注：如果分析未固定的细胞，重要的是使用未固定的单色对照品，因为固定可能会改变细胞的背景荧光。

74. 设置电压和门之后，运行样本并记录至少10000个事件。

75. 使用机构提供的软件（如FCS Express、FlowJo）分析数据。

笔记

步骤A：故障排除

台阶

问题

可能的解决方案

3

在任何数据库中都找不到您的GOI

GOI可能不存在于你们的物种中。我们建议在尝试发现一个全新的基因之前，先用已知的基因来尝试这个过程。

准备一个从头转录组组装，并用你能找到的最密切相关物种的GOI序列爆破从头组装。

4

甲状腺肿的多种亚型

比较编码区域和功能域以获得最佳转录。如果需要的话，与同源序列和同源序列进行比较，以确定主转录本。

4

有冲突的GOI记录

确定DNA/蛋白质序列的变化以及对最终蛋白质的影响。与同系物和同源物比较。

7

GOI转录本中没有起始或结束信号

使用部分序列从备用数据库中标识全长序列。如果可能，调查从头转录组。

9

GOI注释可用或可检索的有限信息

通过与同系物或同源物的比较来识别潜在的功能域。

9

GOI成绩单没有签名

使用部分序列从备用数据库中标识全长序列。如果可能，调查转录组。或者，使用来自其他类似的、表达良好的蛋白质的天然SigP。

17-22

GOI与同源同源同源物之间功能域的有限或不守恒

使用正交和同源查询，调查其他潜在的转录本。如果没有其他人找到，即使功能不对等，该成绩单可能仍然具有相关性。

步骤B：故障排除

台阶

问题

可能的解决方案

7

GOI成绩单上没有SigP

使用仓鼠IL2 SigP，如步骤7所述。更多详细信息见vector pAF92(https://www.addgene.org/135929/).

13

GOI段不在最佳GC%范围内

订购一个以上可能的引物，找到一个组合，可以放大目标序列与必要的向量重叠片段。

程序C：故障排除

台阶

问题

可能的解决方案

PCR和凝胶

无PCR产物

参见其他地方的一般PCR故障排除指南。

从凝胶中提取DNA（PCR或质粒消化）

限制性消化中使用的PCR产物产量或质粒DNA不足。

重新运行PCR或限制性摘要。如果产量又低了，那么只要凝胶中的带大小正确，就在组装中使用低产量的DNA。

装配与改造

殖民地太多了

执行新的隔夜限制摘要

把细菌分成一半或三分之一

无盘菌

检查氨苄西林浓度（检查制作日期板）

头部电击后在眼眶摇床上孵育时间过长。孵育一小时就足够了。如果培养时间延长，细菌可以进入指数增长期，导致阳性克隆的大量扩张。

装配与改造

无菌落或阴性

限制性消化不良。

检查酶，反应条件，限制性酶位点的甲基化。

嵌件中的重叠可能不够长或设计不当。

自制的有能力的细菌质量可能很差，从供应商处购买合格的细胞（例如，NEBuilder试剂盒附带预先确认的DH5α）。

如果使用紫外线光源来观察凝胶中的DNA，那么应该注意限制DNA暴露在紫外线下，因为这会损坏DNA，并且是下游克隆问题的一个重要来源。

用无菌剃须刀或塑料切割工具在目标DNA带周围切割。确保不要直接切割紫外线/蓝光的玻璃，否则会损坏玻璃。为每一条带使用一个新的刀片，以防止样本之间的DNA携带。

夜间细菌培养。

细菌培养无法扩展

确保使用了正确的抗生素和剂量。

分析你的测序结果。

测序结果不干净

DNA上残留的乙醇。重复测序程序，让你的DNA在去除乙醇时有更多的时间干燥。

单引物测序PCR失败。尝试在带有“正常”聚合酶（如OneTaq）的质粒上使用成对的测序引物，以确保反应在55°C下工作。

询问测序设施的经理以了解情况。

步骤D：故障排除

台阶

问题

可能的解决方案

转染

没有明显的报告蛋白或细胞不能存活药物选择

人为错误是最常见的问题。特别是质粒DNA的移液。

使用新的培养基和一批新的PEI。

细胞密度过高。

转染

转染或选择后无存活

药物剂量过高。

人为错误是最常见的问题。特别是质粒DNA的移液。

转染

药物选择7天后，种群没有扩大。

药物剂量过高。

将媒体中FBS的百分比提高到15-20%。

蛋白质表达

不表达所需蛋白质的选定细胞群。

如果报告者和POI都没有被表达，那么检查表达式向量构造以确保ORF没有早期停止密码子。同时也证实了表达载体测序的准确性和完善性。

有些蛋白质会因为未知的原因而失效。对于像IFN-γ这样特性良好的蛋白质，我们期望这个系统在95%以上的时间内起作用。对于尚未在哺乳动物细胞中重组产生的poi，失败率可能为10-20%。

蛋白质纯化。

低蛋白表达/收集/纯化。

细胞在培养过程中没有迅速分裂。

蛋白质在上清液中迅速降解。

步骤E：故障排除

台阶

问题

可能的解决方案

没有信号

蛋白质快速降解

未添加氯喹或氯化铵。

受体介导的内吞作用可以激活蛋白酶体降解。如果文献表明这条通路是活跃的，就试试蛋白酶体阻断剂。

食谱

参见相关配方电子表格，其中包括调整体积和浓度的计算。

致谢

我们感谢与本方案相关的手稿的共同作者：Chrissie.B.Ong，Alana De Luca，A.Bruce Lyons，Gregory M.Woods。我们要感谢金妮·拉尔夫一直以来对塔斯马尼亚魔鬼的照顾，感谢博诺龙野生动物保护区为塔斯马尼亚魔鬼提供了通道，感谢露丝·派伊为恶魔提供护理和采集血样。我们要感谢Mahalia Kingsley和Nirdesh Poudel构建质粒。

资金来源：ARC DECRA赠款（DE180100484）、ARC连锁赠款（LP0989727）、ARC发现赠款（DP130100715）、莫里斯动物基金会援助赠款D14ZO-410、塔斯马尼亚大学基金会（University of Tasmania Foundation）博士埃里克·吉勒（Eric Guiler）通过拯救塔斯马尼亚恶魔呼吁（Save the Tasmanian Devil）筹集的资金（2013、2015、2017和2018年），以及与Nexvet Australia Pty合作的企业家计划研究联系补助金。皇家霍巴特医院研究基金会孵化器拨款RC50680。

相互竞争的利益

作者获得了Nexvet Australia Pty的资助。进行相关研究。

工具书类

1. Benson，D.A.，Cavanaugh，M.，Clark，K.，Karsch Mizrachi，I.，Lipman，D.J.，Ostell，J.和Sayers，E.W.（2013年）。GenBank公司。核酸研究41（数据库问题）：D36-D42。

2. 联合体，T.U.（2018年）。UniProt：全球蛋白质知识中心。核酸研究47（D1）：D506-D515。

3. Flies，A.S.，Darby，J.M.，Lennard，P.R.，Murphy，P.R.，Ong，C.E.B.，Pinfold，T.L.，Lyons，A.B.，Woods，G.M.和Patchett，A.L.（2020年）。一个绘制蛋白质相互作用的新系统揭示了遗传性癌症进化上保守的免疫逃避途径。科学进步。预印本可从bioRxiv:831404获取。

4. Gibson，D.G.，Young，L.，Chuang，R.-Y.，Venter，J.C.，Hutchison，C.A.和Smith，H.O.（2009年）。酶法组装高达几百千碱基的DNA分子。自然方法6（5）：343-345。

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6. Qureshi，O.S.，Zheng，Y.，Nakamura，K.，Attridge，K.，Manzotti，C.，Schmidt，E.M.，Baker，J.，Jeffery，L.E.，Kaur，S.，Briggs，Z.，Hou，T.Z.，Futter，C.E.，Anderson，G.，Walker，L.S.和Sansom，D.M.（2011年）。CD80和CD86的反式内吞作用：CTLA-4细胞外功能的分子基础。科学332（6029）：600-603。

Zerbino, D. R., Achuthan, P., Akanni, W., Amode, M. R., Barrell, D., Bhai, J., Billis, K., Cummins, C., Gall, A., Giron, C. G., Gil, L., Gordon, L., Haggerty, L., Haskell, E., Hourlier, T., Izuogu, O. G., Janacek, S. H., Juettemann, T., To, J. K., Laird, M. R., Lavidas, I., Liu, Z., Loveland, J. E., Maurel, T., McLaren, W., Moore, B., Mudge, J., Murphy, D. N., Newman, V., Nuhn, M., Ogeh, D., Ong, C. K., Parker, A., Patricio, M., Riat, H. S., Schuilenburg, H., Sheppard, D., Sparrow, H., Taylor, K., Thormann, A., Vullo, A., Walts, B., Zadissa, A., Frankish, A., Hunt, S. E., Kostadima, M., Langridge, N., Martin, F. J., Muffato, M., Perry, E., Ruffier, M., Staines, D. M., Trevanion, S. J., Aken, B. L., Cunningham, F., Yates, A. and Flicek, P. (2018). Ensembl 2018年。核酸研究46（D1）：D754-D761。