材料和试剂

1. 25 cm2细胞培养瓶（Sigma-Aldrich，目录号：SIAL0168），储存：室温

2. 盖玻片：18 x 18 mm厚0.13-0.17 mm（Amscope，目录号：CS-S18-100，储存：室温

3. U937人单核细胞系细胞（ATCC，目录号：TIB-202），储存：液氮

4. APC-VDR二级抗体，克隆小鼠（Invitrogem，目录号：Z25151），储存：8°C

5. CD14-FITC抗人单克隆抗体，克隆61D3（eBioscience，目录号：11014942），保存时间：8°C

6. RPMI 1640培养基，pH 7.4（Sigma-Aldrich，目录号：R4130），储存：8°C

7. 100毫升链球菌液（青霉素链霉素）（Gibco by Life Technologies，目录号：15140-122），储存温度：-20°C

8. PMA（佛波醇12肉豆蔻酯13醋酸酯）（Sigma-Aldrich，目录号：P1585），储存温度：-20°C

9. PBS（磷酸盐缓冲盐水pH 7.4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3744-1 PAK），储存：室温

10. 胰蛋白酶EDTA溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T4049），储存温度：-20°C

11. FBS（胎牛血清）（Sigma-Aldrich，目录号：12103C），储存温度：-20°C

12. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T8154），储存：室温

13. 25（OH）D（25羟基维生素D3溶液50µg/ml乙醇）（Sigma-Aldrich，目录号：739642），储存温度：-20°C

14. TLR4-PE抗人单克隆抗体，克隆HTA125（eBioscience，目录号：12991742），保存时间：8°C

15. VDR抗人单克隆抗体，克隆H1512（圣克鲁斯，目录号：SC13133），保存时间：8°C

16. CYP27B1抗人单克隆抗体，克隆K2911（圣克鲁斯，目录号：SC49642），储存温度：8°C

17. Alexa Fluor 647-CYP27B1二级抗体，克隆山羊（Invitrogem，目录号：Z25608），贮藏：8°C

18. CYP24抗人单克隆抗体，克隆D0811（圣克鲁斯，目录号：SC66851），储存：8°C

19. Alexa Fluor 488-CYP24二级抗体，克隆兔（Invitrogem，目录号：Z5302），储存：8°C

20. 固定/通透性缓冲细胞固定/细胞周期（1x）（BD Pharmingen，目录号：554722），储存：8°C–

21. 含皂素洗涤液-烫发/洗涤液（BD Pharmingen，目录号：554723），储存温度：8°C

22. 二甲基亚砜（二甲亚砜）（合成，目录号：01D1011.01.BJ），储存：室温

23. 叠氮化钠（Merckmillipore，目录号：247-852-1），储存：室温

24. 抗凝剂EDTA（乙二胺四乙酸二钠）（Sigma-Aldrich，目录号：ED2SS-100g），储存：室温

25. 叠氮钠（Sigma-Aldrich，目录号：S2002-100g），储存：室温

26. PMA（PhorboI12肉豆蔻酸13酯）（见配方）

27. 500 ng/ml 25（OH）D（见配方）

28. 1%叠氮PBS溶液（见配方）

设备

1. -80°C冷冻机

2. 血细胞仪/Neubauer室（Microyntech，目录号：MT-BCC-BL，储存：室温）

3. 流量计：Fascanto I四参数（BD Biosciences，San Diego，USA）

4. 二氧化碳培养箱4110（美国赛默飞世尔科技公司）

5. 离心机5804 R（德国埃彭多夫）

软件

1. BD FACSDivaTM（BD Biosciences，圣地亚哥，美国；www.bdbiosciences.com网站)

2. SPSS版本22统计软件（SPSS，芝加哥，美国）

程序

A、健康尿毒症人血清库的研制
1. 健康血清池：取20名健康志愿者的血液样本（20毫升），置于装有抗凝剂的试管中，以500×g的速度离心10分钟，4分钟。摄氏度

注意：上清液应等分分离，放入一在立式冷藏箱中储存-80摄氏度.

2. 尿毒症血清池：在第二周开始前用抗凝管采集30例血液透析患者的血样。在4°C下以500 x g离心10分钟。将上清液储存在-80°C的冷冻室中。

排除标准：有任何类型的感染，使用过任何免疫抑制药物，补充维生素D，或患有糖尿病或肿瘤的患者。

B、 U937（人单核细胞系）培养试验

1. 在25 cm细胞培养瓶（Sigma）中培养1 x 105 U937细胞（人类单核细胞系），培养基为10 ml RPMI 1640培养基，pH值为7.4，并辅以100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Gibco、BRL、Life Technologies）和10%FBS（胎牛血清）。然后在37°C、5%CO2的培养箱中培养。每24小时更换培养基（RPMI 1640），直到培养物汇合。

2. 从细胞培养瓶中取出旧的RPMI，并添加10 ml新鲜培养基RPMI和5µM/ml PMA（向10 ml新鲜RPMI 1640培养基中添加10µl 5 mM/ml PMA储备溶液）。在5%CO2培养箱中37℃培养24小时，直至U937细胞分化为单核细胞。

3. 分化后，用10ml PBS（Sigma）冲洗细胞，去除PMA。然后在室温下在5ml 0.5%胰蛋白酶中孵育3分钟，以便将细胞从细胞培养瓶表面分离，获得均匀的细胞悬浮液。

4. 然后用5 ml RPMI 1640培养基洗涤，以进行胰蛋白酶中和。将细胞从细胞培养瓶转移到15 ml试管中，并在500 x g，4°C下离心5分钟。

5. 去除上清液并添加10毫升新鲜的RPMI 1640，用台盼蓝测试细胞活力。

C、台盼蓝活力测定

1清洁血细胞仪。1清洁血细胞仪。

图1。将5或10µl细胞悬液注入血细胞仪室的两侧

2. 用水或呼气弄湿被单。用轻微的压力在试验箱上来回滑动盖套，直到牛顿的折射环出现（牛顿的折射环被视为盖玻片下面的彩虹状环）。

3. 在无菌条件下，取出100-200µl细胞悬液，转移到微管中，用等体积的台盼蓝溶液（稀释系数=2）染色，并用温和的移液管混合。台盼蓝染色的最长时间为30秒（图1）。

4. 用细胞悬浮液（约5-10µl）（图1）填充培养箱两侧，并在20倍放大倍率的倒置相差显微镜下观察。

5. 计算活细胞（被视为明亮细胞）和不存活细胞（蓝色染色）的数量。理想情况下，应计数>100个细胞，以提高细胞计数的准确性（见下文注释）（图2）。

注：计算方格数以获得>100的计数。

图2。血细胞仪设计。A、倒置相位分析法从血细胞仪获得的图像。B、在四个正方形（左上+右+左下+右）上计数活细胞（亮/透明细胞）和死细胞（蓝色）()，但不是右上下边框()而不是左上下边界(). C、血细胞仪区

6. 使用以下示例和如上所示计算活细胞和非活细胞的浓度以及活细胞的百分比：

容量血细胞仪=1×1×0.1=0.1 mm3

计算每毫升活细胞和不活细胞的浓度。

例如：血细胞仪上有120个活细胞或不活细胞，那么

每毫升活细胞浓度=120个细胞/0.1mm3×2×1000mm3/1mL=2.4×106cells/ml

其中2为稀释因子（V细胞悬液/V台盼蓝）；

1ml相当于1000mm3。

D、使用或不使用25（OH）D和使用或不使用尿毒症池血清检测的治疗

计算存活率（必须在95%左右）后，使用15 ml的试管，在RPMI中加入细胞悬浮液（用于计算存活率），并将每种条件下的1 x 106个细胞转移到所述的细胞培养瓶中：（为了使1×106细胞适应下述治疗条件，需要用血细胞仪进行细胞计数）。

1. 用健康池血清治疗：将1 x 106细胞转移到25 cm2细胞培养瓶中，培养瓶中含有2.5 ml RPMI 1640和2.5 ml健康血清。在37°C下用5%的CO2培养24小时。

2. 用25（OH）D和健康池血清处理：将1 x 106细胞转移到25 cm2细胞培养瓶中，其中含有2.5 ml RPMI 1640和2.5 ml健康池血清，并添加50 ng/ml 25（OH）D。在37°C下，5%CO2孵育24 h。

3. 尿毒症池血清治疗：将1 x 106细胞转移到25 cm2细胞培养瓶中，其中含有2.5 ml RPMI 1640和2.5 ml尿毒症池血清。在37°C温度下，5%CO2培养24小时。

4. 用25（OH）D和尿毒症池血清治疗：将1 x 106细胞转移到25 cm2细胞培养瓶中，其中含有2.5 ml RPMI 1640和2.5 ml尿毒症池血清，并添加50 ng/ml 25（OH）D。在37℃下，5%CO2孵育24 h。

E、人源性单克隆抗体TLR4、VDR、CYP27和CYP24的检测

1. 在每种条件下培养后，转移上述25（OH）D或不含25（OH）D的各处理条件下的细胞，在4℃下离心10 min，500 x g。丢弃上清液，并将1 ml PBS加入颗粒中。

2. 对于使用或不使用25（OH）D和健康池血清或尿毒症患者血清的每个治疗条件，在3（三）个试管中分别添加3 x 105/100µl PBS，用抗体染色。按表1加入各单克隆抗体。

表1单克隆抗体方案

管子

单克隆抗体

数量

荧光团

1

-

-

-

2

CD14型

5微升

FITC公司

TLR-4型

5微升

体育课

VDR

1微升（VDR）

3µl（抗体二级）

空气污染指数

3

CYP24型

1微升（CYP24）

3µl（抗体二级）

亚历山福禄488

CYP27型

1微升（CYP27）

3µl（抗体二级）

亚历山福陆647

3. 试管1:3 x 105细胞+100µl PBS。准备在流式细胞仪中分析。

4. 试管2:3 x 105细胞+100µl PBS+5µl CD14+5µl TLR4，在室温下黑暗中培养15分钟。之后，在4°C下离心5 min，500 x g。去除上清液并使用固定/渗透缓冲液添加1 ml 20 min。之后，添加1µl浓度为1μg/ml的VDR抗体（美国圣迭戈圣克鲁斯），并在冰箱（2-8°C）中孵育30分钟。之后，用含有皂甙的洗涤液-烫发液/洗涤液洗涤3次，并在冰箱（2-8°C）离心机中与3μg/ml各自的次级抗体（APC结合的抗人VDR）培养15分钟，并丢弃上清液。添加300µl 1%叠氮化物PBS溶液。准备在流式细胞仪中分析。

5. 试管3:3 x 105细胞+100µl PBS，添加1 ml带固定/渗透缓冲液20分钟。之后，添加1µl CYP27B1+1µl CYP24抗体，浓度为1μg/ml（美国圣克鲁斯，圣地亚哥），并在冰箱（2-8°C）中孵育30分钟。之后，用含皂甙的洗涤液-烫发液/洗涤液洗涤3次，并用3μg/ml的相应二级抗体（Alexa-Fluor 647结合抗人CYP27B1和Alexa-Fluor 488结合抗人CYP24）在冰箱（2-8°C）中培养15分钟。离心并丢弃上清液。添加300µl 1%叠氮化物PBS溶液。准备在流式细胞仪中分析。

注：如果你有一个可以检测五个或更多荧光参数的流式细胞仪，这个协议可能会被简化。为此，你可以把3×105细胞放在一个试管中，用所有单克隆抗体与不同的荧光结合染色，在每个检测通道用流式细胞仪检测。

F、流式细胞术分析

1. 使用前向散射图与侧散射图绘制CD14+（单核细胞细胞）的门并排除碎片（图3A-3D）。使用点图分析CD14+（图3E）、CD14+TLR4+（图3F）和CD14+VDR+（图3G）。

2. 使用点图分析CD14+（图4A），使用直方图分析CYP27+（图4D）和CYP24+（图4E）。将结果描述为平均荧光强度（MFI），MFI越高，这些受体的表达就越大。对于每个样本，获取30000个事件/单元。

图3。单核细胞CD14+、TRL4和VDR表达的流式细胞术门控策略。 A、根据单核细胞的大小（前向散射FSC）和内部复杂度（侧面散射-SSC）的特点，在P1门处选择单核细胞。B-D.在检测通道中调节单核细胞的自体荧光，分别用荧光色素FITC，PE和APC标记。E、 II P3=单核细胞中CD14 FITC+的表达。F、 Q2-2=TLR4 PE+和CD14-FITC+在单核细胞中的表达。G、 Q2-3=VDR-APC+和CD14-FITC+在单核细胞中的表达。–

图4。单核细胞CYP27和CYP24的流式细胞术策略。 A、门ⅡP3=单核细胞CD14+是根据先前的实验选择的。创建直方图类型的图形（细胞数量与检测到的荧光强度相关）。B和C。分别与荧光色素结合的单克隆抗体检测通道的细胞自体荧光调节：Alexa fluor647在APC流式细胞术通道中检测，Alexa fluor488在FITC流式细胞术通道中检测。在P3和P2象限分别显示CYP27和CYP24表达阳性的D和E单核细胞。

数据分析

在每个实验中使用二十（20）个重复。每组（健康、尿毒症、补充25维生素D和不补充25维生素D）的结果用中位数表示（最小值和最大值），用Kruskal-Wallis检验差异。自变量之间的关系在整个组中进行。用Kolmogorov-Smirnov检验检验数据的正态性。我们使用皮尔逊或斯皮尔曼相关系数，视情况而定。P<0.05为统计学意义。分析使用SPSS（统计软件包社会科学）软件版本22.0 for Windows进行。这些分析已经出现在原文中（Brito等人，2020年）。

食谱

1PMA（佛波12肉豆蔻酸13醋酸酯）；5 mg；FW 616.81PMA（佛波12肉豆蔻酸13醋酸酯）；5 mg；FW 616.8

1 M稀释=616 mg/ml

5 x 10-3 M稀释液（5 mM）=5 mg于1.62 ml二甲基亚砜中

a、为了制备5 mM稀释度的PMA储备，将5 mg稀释在1.62 ml二甲基亚砜中

b、由于PMA对光敏感，所以在制备过程中要进行光保护

c、在-20°c下储存在10µl小份（约160 Eppendorfs）中直到使用（保质期：6个月）

d、对于该方案，在RPMI中进一步稀释10-3份，以实现5µM的最终稀释，然后在实验中使用）

2. 500纳克/毫升25（OH）D

以1:100的比例在乙醇（Sigma-Aldrich，50µg/ml）中稀释购买的溶液。例如：在5 ml乙醇中稀释50µl储备溶液。在-20°C下储存在120µl小份（约40 Eppendorfs）中，直到使用

注：对于本方案，直接在带有RPMI的细胞培养瓶中进一步稀释10-1倍，以达到50 ng/ml的最终稀释度，然后将其用于25（OH）D处理的实验中。

3. 1%叠氮PBS溶液（2-8°C冰箱储存）

将1g叠氮钠溶于10ml PBS中

致谢

作者感谢在开展这项工作期间提供必要技术支持的所有专业人员。这项工作得到了FAPESP圣保罗宪法保障基金会（批准号：2014-14192-1）的支持。

数据收集、方案分析、流式细胞术数据采集、分析、解释和文章最终版本的批准：Rebello J.F.；Brito，R.；和Grabulosa，C.C.。文章最终版本的解释和重要的智力见解和审查和批准：Elias，R.M.和Moysés，R.M.研究设计，数据分析、解释、知识见解、手稿写作、审查和批准文章的最终版本，批准文章的最终版本：Dalboni，M.A。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

伦理学

这项研究得到了圣保罗联邦大学制度审查委员会的批准（#0727/10）。

根据赫尔辛基宣言和当地法规，在获得参与者或法定代表人书面知情同意后，获取健康和尿毒症血清样本。

工具书类

1. 阿拉诺，C.（2011年）。维生素D和免疫系统。投资医学杂志59（6）：881-886。

2. Bhalla，A.K.，Amento，E.P.，Clemens，T.L.，Holick，M.F.和Krane，S.M.（1983年）。人外周血单个核细胞中1,25-二羟维生素D3的特异性高亲和力受体：单核细胞中的存在和活化后T淋巴细胞的诱导。临床内分泌代谢杂志57（6）：1308-1310。

3. Bolati，D.，清水，H.，Yisireyili，M.，Nishijima，F.和Niwa，T.（2013年）。硫酸吲哚，一种尿毒症毒素，通过激活NF-κB下调肾Nrf2的表达。BMC肾14:56。

4. 博尔赫斯，N.A.，Barros，A.F.，Nakao，L.S.，Dolenga，C.J.，Fouke，D.和Mafra，D.（2016年）。慢性肾脏疾病肠道菌群蛋白结合性尿毒毒素和炎症标志物。《营养学杂志》26（6）：396-400。

5. Brito，R.B.O.，Rebello，J.F.，Grabulosa，C.C.，Pinto，W.，Morales，A.，Jr.，Elias，R.M.，Moyses，R.M.A.和Dalboni，M.A.（2020年）。25维生素D减少尿毒症环境中的炎症。科学报告10（1）：128。

6. Carmona，A.，Guerrero，F.，Buendia，P.，Obrero，T.，Aljama，P.和Carracedo，J.（2017年）。硫酸吲哚酯处理的内皮细胞产生的微泡诱导内皮祖细胞功能障碍。前生理科8:666。

7. Carvalho，J.T.G.，Schneider，M.，Cuppari，L.，Grabulosa，C.C.，D，T.A.，BM，Q.R.，M，C.B.，Cendoroglo，M.，Maria Moyses，R.和Dalboni，M.A.（2017年）。胆钙化醇在尿毒症环境中减少炎症并改善淋巴细胞中维生素D调节酶：一项随机对照试验。公共科学图书馆一号12（6）：e0179540。

8. Chang，E.和Kim，Y.（2019年）。维生素D通过AMPK/SIRT1活性改善C2C12骨骼肌细胞的脂肪堆积。营养素11（11）：2806。

9. Chang，E.（2019年）。1,25-二羟维生素D降低叔丁基过氧化氢诱导的氧化应激，增加C2C12肌细胞AMPK/SIRT1活性。分子24（21）：3903。

10. Cross，H.S.，Bareis，P.，Hofer，H.，Bischof，M.G.，Bajna，E.，Kriwanek，S.，Bonner，E.和Peterlik，M.（2001年）。人结肠黏膜25-羟基维生素D3-1α-羟化酶和维生素D受体基因表达在早期癌变过程中升高。类固醇66（3-5）：287-292。

11. Franca Gois，P.H.，Wolley，M.，Ranganathan，D.和Seguro，A.C.（2018年）。慢性肾脏疾病中维生素D缺乏：近期证据和争议。《国际环境与公共卫生》15（8）。

12. Gombart，A.F.，O'Kelly，J.，Saito，T.和Koeffler，H.P.（2007年）。1,25（OH）2D3对不同组织CAMP基因的调控作用。类固醇生物化学与分子生物学杂志103（3-5）：552-557。

13. 霍利克，M.F.（2012年）。维生素D：骨骼外健康。北美洲大黄38（1）：141-60。

14. 霍利克，M.F.（2007年）。维生素D缺乏。英国医学杂志357（3）：266-281。

15. Kaminski，Lakinski，和Lakinski，2017年）。硫酸吲哚氧基-一种尿毒症毒素，与慢性肾脏病患者的止血系统紊乱和心血管疾病的患病率有关。BMC肾18（1）：35。

16. Kreutz，M.，Andreesen，R.，Krause，S.W.，Szabo，A.，Ritz，E.和Reichel，H.（1993年）。1,25-二羟维生素D3的产生和维生素D3受体的表达在人单核细胞向巨噬细胞分化过程中受到发育调控。血82（4）：1300-1307。

17. Lau，W.L.，Savoj，J.，Nakata，M.B.和Vaziri，N.D.（2018年）。慢性肾脏疾病中微生物组的改变：肠道源性尿毒毒素的全身效应。临床科学（伦敦）132（5）：509-522。

18. Mathieu，C.和Adorini，L.（2002年）。1,25-二羟维生素D3类似物作为免疫调节剂的时代到来。医学趋势8（4）：174-179。

19. Onal，E.M.，Afsar，B.，Covic，A.，北D.Vaziri和M.Kanbay（2019年）。慢性肾脏疾病的肠道菌群和炎症及其在心血管疾病发展中的作用。高血压研究42（2）：123-140。

20. Rossi，M.，Campbell，K.L.，Johnson，D.W.，Stanton，T.，Vesey，D.A.，Coombes，J.S.，Weston，K.S.，Hawley，C.M.，McWhinney，B.C.，Ungerer，J.P.和Isbel，N.（2014年）。蛋白结合性尿毒毒素、炎症和氧化应激：3-4期慢性肾病的横断面研究。医学文献45（4）：309-317。

21. Schwartz，G.G.，Whitlatch，L.W.，Chen，T.C.，Lokeshwar，B.L.和Holick，M.F.（1998年）。人前列腺细胞从25-羟基维生素D3合成1,25-二羟维生素D3。癌症流行病学生物标志物7（5）：391-395。

22. Shimizu，H.，Yisireyili，M.，Higashima，Y.，Nishijima，F.和Niwa，T.（2013年）。硫酸吲哚可通过产生ROS和激活近端肾小管细胞中的NF-kappaB和p53来上调肾脏ICAM-1的表达。生命科学92（2）：143-148。

23. Stockler Pinto，M.B.，Soulage，C.O.，博尔赫斯，N.A.，Cardozo，L.，Dolenga，C.J.，Nakao，L.S.，Pecoits Filho，R.，Fouke，D.和Mafra，D.（2018年）。从实验室到血液透析诊所：蛋白结合的尿毒症毒素调节NF-κB/Nrf2的表达。国际泌尿肾50（2）：347-354。

24. Stumpf，W.E.，Sar，M.，Reid，F.A.，Tanaka，Y.和DeLuca，H.F.（1979年）。肠道、胃、肾、皮肤、垂体和甲状旁腺中1,25-二羟维生素D3的靶细胞。科学206（4423）：1188-1190。

25. Tsoukas，C.D.，Provvedini，D.M.和Manolagas，S.C.（1984年）。1,25-二羟维生素D3：一种新的免疫调节激素。科学224（4656）：1438-1440。

26. Vanholder，R.C.和Glorieux，G.L.（2003年）。尿毒症毒性概述。国际血液透析7（2）：156-161。

27. 邹新瑞、詹立瑞、陈立军、龙庆华、袁杰、王磊、王晓强（2019年）。Klotho/FGF23/Egr1信号通路对糖尿病肾病钙磷代谢的影响及参元颗粒的干预作用。生物调节药物杂志33（6）：1695-1702。