材料和试剂

1. 35毫米带有玻璃底部的CELLview TM 碟形容器（Greiner，目录号：627871）

2. 2 ml圆底微管（Watson，目录号：132-620C）

3. 癌症研究所（ICR）怀孕小鼠（日本SLC，Slc：ICR ）

4. 不含酚红的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（4.5 g / L葡萄糖）（Nacalai Tesque，目录号：08489-45）

5. 胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12483）

6. 青霉素-链霉素混合溶液（Nacalai Tesque，目录号：26253-84）

7. 含钙，镁，无酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS）（Nacalai Tesque，目录号：09735-75）

8. Triton X-100（Nacalai Tesque，目录号：35501-15）

9. 4％多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲溶液（Nacalai Tesque，目录号：09154-85）

10. 正常山羊血清（Abcam，目录号：ab156046）

11. 兔抗E-钙粘蛋白（24E10）单克隆抗体（Cell Signaling Technology，目录号：3195）

12. 山羊抗兔IgG（H + L）高度交叉吸附的二抗，Alexa Fluor 546偶联物（Thermo Fisher Scientific，目录号：A-11035）

13. 琼脂糖（日本基因，目录号：316-01191）

14. Cellmatrix IA型胶原（3 mg / ml，pH 3.0）（Nitta明胶，目录号：637-00653）

15. 基质胶生长因子降低（Corning，目录号：356231）

16. 组织清洁剂CUBIC-R +（东京化学工业，目录号：T3741）

17. 文化媒体（请参阅食谱）

18. PBST（请参阅食谱）

设备

镊子（精细科学工具，目录号：11251-30）
尖头和尖头剪刀（精细科学工具，目录号：14084-08）
聚二甲基硅氧烷（PDMS）拉伸室（STREX，目录号：STB-CH-04）
手动单轴拉伸装置（STREX，目录号：STB-100）
等离子清洁设备（STREX，目录号：PC-40）
管旋转器（WakenBtech ，型号：WKN-2210）
CO 2 培养箱（三洋，型号：MCO-18AIC）
摇床（WakenBtech ，型号：WKN-2240）
共聚焦显微镜（Leica，型号：TCS SP8）

软件

ImageJ（美国国立卫生研究院，https://imagej.nih.gov/ij/）

程序

组织解剖
根据与动物获取，护理和使用有关的所有相关国际和机构法规，在期望的妊娠日期牺牲小鼠。
笔记：

我们通常使用ICR小鼠，但可以使用任何小鼠品系。
对于附睾压缩，胚胎天（E）1 4.5或E15.5是合适的，因为附睾小管相对笔直，因此可以适当确定压缩方向。
使用剪刀或镊子仔细收集胚胎，并在室温下将附睾与睾丸一起切除于HBSS缓冲液中。有关详细信息，请参见视频1。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003119--1456平岛刚843998 \ video 1.jpg

视频1.在E15.5处解剖胚胎的附睾。除去四肢，尾巴和颈部上方的上层组织。胚胎位于其脸部，其前部朝左。

从切除的组织中取出睾丸并分离附睾（图1）。

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图1.附睾和睾丸的分离。A.分离前在E15.5解剖睾丸附睾。B.分离之后。左为附睾，右为睾丸。比例尺：300 µm。

在冰上的培养皿中将分离的附睾与HBSS孵育。
注意：Ť 他样品应被用于在1个小时内将组织压缩。

组织压缩
注：牛逼他的实验，可以进行外组织培养罩。

使用等离子清洗设备将PDMS拉伸室亲水化10秒钟。
注意：Ť 他的过程增强了腔室和其中附睾嵌入但不是必需的水凝胶之间的粘合性。

在单轴拉伸设备中插入PDMS拉伸室（图2A），并根据制造商的建议使用该设备手动拉伸室（图2B）。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003119--1456平岛刚843998 \ Figs jpg \ fig 2.jpg

图2.带有PDMS腔室的手动单轴拉伸设备。A.伸展之前。B.伸展后。

将分离的附睾二酰亚胺转移到腔室内，并通过移液尽可能除去样品周围的HBSS缓冲液痕迹。
用1 ml胶原蛋白凝胶或Matrigel填充房间，不加任何稀释。
笔记：

关于水凝胶，胶原凝胶或基质胶都不错，尽管根据凝胶类型对生物组织的化学刺激尚不清楚。
水凝胶应在4 °C 下预融化，并根据制造商的建议将温度一直保持到组织插入为止。
使用镊子根据目标压缩方向对齐附睾的方向（图3）。

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图3 。组织压缩的方向。附睾的纵轴沿压缩方向排列。A.纵向压缩。B.侧向压缩。

在37 °C下孵育10分钟以进行胶凝。
将1 ml 在37 °C下预热的培养基（配方1 ）加到室内的凝胶上。
通过以恒定速度（例如〜0.2 mm / s）旋转拉伸设备的螺钉，从拉伸状态释放腔室。
笔记：

记住设置阴性对照。一种是不进行压迫治疗。
如果压缩程度较大（例如〜33 ％），则可以通过肉眼确认组织的压缩情况。
在37 °C 下于5 ％CO 2 下孵育，直到进行分析的时间为止。
注意：约10分钟的压缩会导致组织尺度的变形，但不会引起细胞重排。但是，较长的压缩可能导致细胞重排，这可能是由于外部机械刺激产生的主动细胞力所致。

E-钙黏着蛋白的整装染色，光学清除和成像
通过加入2固定样品米升4％PFA的进入腔室并孵育在4℃下过夜。
用力从凝胶中取出附睾，并将它们转移到装有1 ml PBST的2 ml微管中（配方2 ）。在微管中进行以下过程和反应。通过移液吸出PBST。
在PBST中加入200 µl 10％的正常山羊血清，并在37°C 下孵育3小时以进行封闭。
轻轻地将样品清洗两次。E 在PBST中两次洗涤中非常之一应在室温下用旋转器持续5分钟。
加入50 µl用PBST（1：200）稀释的抗E-Cadherin抗体（一抗），并在4 °C 下孵育过夜。
轻轻洗样品小号三次和所述洗涤三次中的每一个在PBST 应持续1 ħ 在室温下用旋转器。
加入50 µl 与PBST（1：1,000）稀释的Alexa Fluor 546（二抗）偶联的抗兔抗体，在4 ℃ 或室温下孵育3小时。
注意：使用更长波长的共轭荧光染料进行体积组织成像。

在室温下每隔1小时用旋转器在PBST中轻轻洗涤3次。
将样品转移到玻璃底盘上，通过移液除去周围的液体。
下降5 微升的1％琼脂糖的PBS的熔点为80℃至样品和传播混合以形成凝胶，因而粘在样品和玻璃物理固定。
琼脂糖凝胶化后，用PBS覆盖样品。
光学清理
吸出PBS，将预混合的光学清除试剂CUBIC-R +加入PBS（1：1）中，并在37°C 下温育30分钟，同时用摇床轻轻摇动。
吸出CUBIC-R + / PBS，添加CUBIC-R +溶液，并在37°C 温和摇动孵育2小时。
注意：根据您的样品和目的选择清算解决方案。请参阅理查德森和里奇曼（2015年），喜rashima和足立（2015），并须崎上田（2016）为解决方案的选择。

在共聚焦显微镜下采集堆叠图像，然后使用ImageJ打开它们。图4显示了在示例中沿不同方向压缩10分钟的附睾中染色的E-钙粘蛋白的图像。使用ImageJ的“图像→ 堆栈→ 正交视图”在不同横截面s中进行可视化。

D：\ Reformatting \ 2020-6-1 \ 2003119--1456平岛刚843998 \ Figs jpg \ fig 4.jpg

图4.压缩的附睾中的组织和细胞形态。上皮细胞用E-钙粘蛋白抗体染色。将样品压缩〜33％（从150％拉伸状态释放到100％）10分钟。上排：控制（无压缩），中排：纵向压缩，下排：横向压缩。A.在管中心平面的XY视图。注意，附睾小管由于在组织尺度上的纵向压缩而弯曲（绿色箭头）。比例尺= 10 µm。B. 在管的横截面处的YZ视图。黄色虚线表示管的外围。横向压缩使管各向同性变细，而纵向压缩使管的弯曲点稍厚。比例尺= 10 µm。C. 在上皮细胞中心平面（apico 基轴的中点）的XY视图。注意，单元格变形根据单轴压缩的方向而变形。比例尺= 10 µm。

笔记

该协议侧重于组织压缩和基于图像的分析，用于发展附睾。

但是，我们证实，该协议可应用于解剖至少E12.5至E14.5的无鼠间充质肺上皮细胞和解剖至少E12.5的鼠气管。而且，不仅可以压缩组织而且可以拉伸组织，只要稍作修改即可，例如，跳过将设备从预拉伸状态释放的步骤。

菜谱

文化传媒
含有10％FBS和1％青霉素-链霉素混合溶液的DMEM

PBST
PBS中的0.1％Triton X-100

致谢

我要感谢仓田雄（Yu Kurata）的技术助理，以及太极足立（Taiji Adachi）对实验室设施的使用。这项工作得到了JSPS KAKENHI资助17KT0107和JST PRESTO资助JPMJPR1949的支持。该协议对应于Hirashima和Adachi （2019）。

伦理

所有动物实验均经过当地动物实验伦理委员会（MedKyo 19090 ）的批准，并遵守京都大学关于实验动物的护理和使用指南。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考资料

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