材料和试剂

Eppendorf安全锁管（Eppendorf，目录号：022363204）
黑色实心96孔板（Corning，目录号：07-200-336）或384孔板（Corning，目录号：09-761-21）
塑料板密封件（Excel Scientific，目录号：100-SEAl-PLT）
Econo -Pac重力流色谱柱（Bio-Rad，目录号：732-1010）
聚碳酸酯膜（0.05 µm，Avanti Polar Lipids，Inc.，目录号：610003）
汉密尔顿玻璃注射器（Avanti Polar Lipids，Inc.，目录号：610036）
玻璃小瓶（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，目录号：27023）
圆底玻璃烧瓶（Fisher Scientific，目录号：10-060-4A）
一次性塑料试管
0.22 微米的膜
卵磷脂酰甘油（egg PG）（Avanti Polar Lipids，Inc.，目录号：841138）
卵磷脂酰胆碱（卵PC）（95％）（Avanti Polar Lipids，Inc.，目录号：131601）
钙黄绿素（Sigma-Aldrich公司，Millipore公司Sigma，目录号：C0875）
Sephadex G-50超细粉（GE Healthcare，Life Sciences，目录号：17004101或17004103）
氮气（印第安那州氧气，目录号：23-150224）
NaOH固体（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma ，目录号：221465）
HCl溶液，1 N（Fisher Scientific，目录号：SA48-500）
氯化钠
知识联盟
在2 HPO 4上
KH 2 PO 4
氯仿（Sigma-Aldrich，Millipore Sigma ，目录号：C2432）
碳涂层铜栅格（电子显微镜科学，目录号：CF400CU）
Nalgene快速流动无菌一次性过滤器装置（Fisher Scientific，目录号：09-740-43B）
去离子H 2 O中20％（v / v）乙醇（Fisher Scientific，目录号：A962S-4 ）
0.02％（w / v）NaN 3 （ACROS O rganic，目录号：AC190380050 ）在去离子H 2 O中
在去离子H 2 O中含1％（w / v）的磷钨酸（PTA）（电子显微镜科学，目录号：12501-23-4 ）
双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒（Pierce，目录号：23227）
1x PBS溶液（由10x PBS储备液制备，请参见食谱）
2 N NaOH溶液（请参阅食谱）

设备

小烧杯
小型挤出机（Avanti Polar Lipids，Inc.，目录号：610020）
过滤器支持（Avanti Polar Lipids，Inc.，目录号：610014）
干燥器（Fisher Scientific，目录号：08-642-7）
Fisherbrand 模拟涡旋混合器（Fisher Scientific，目录号：02-215-414）
TECAN Infinite 200 Pro（TECAN，目录号：INF-FPLEX）
OsmoPro 多样品微渗压计（Fisher Scientific，目录号：22-046-680）
FEI Tecnai G2 20透射离子电子显微镜（Thermo Fisher Scientific；Tecnai ）
Delsa纳米亚微米粒度和Zeta 电位分析仪（Beckmann Coulter，目录号：A54412AC）
化学通风柜
-20°C冰柜

软件

I- control TM 或Magellan TM Standard （用于钙黄绿素荧光数据采集）
Gatan 数字显微照片（Gatan 显微镜套件）（用于电子显微照片采集）
Delsa TM Nano UI（用于动态光散射数据采集）

程序

脂质/ 钙黄绿素溶液的制备
注意：此过程使用氯仿，应在化学通风橱中处理。有关适当的PPE的信息，请查阅氯仿安全数据表，请记住，氯仿对眼睛，皮肤和呼吸道有刺激性，并已被分类为潜在/可能的人类致癌物。

依次用以下溶液冲洗一个25/50 ml的圆底烧瓶（对于每种脂质体制剂）：肥皂水，去离子H 2 O，丙酮和氯仿。将氯仿废物丢弃在适当的容器中。烤箱干燥烧瓶1-2小时或在25°C下干燥过夜。
注意：如果烧瓶看起来很脏，请使用强力的玻璃清洁剂。

以1：1的摩尔比混合磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰胆碱（PC）脂质，以使脂质的最终（总）浓度为5-10 mg / ml（或根据需要以不同的摩尔比）。脂质为氯仿溶液或粉末而获得，并应被存储为等分试样在-20℃的冰箱（200 微升25毫克/米的升蛋PG的原液或卵PC在每个小瓶中）。始终将氯仿-脂质溶液存储在与氯仿兼容的玻璃小瓶中）。
用氯仿冲洗除去玻璃瓶中的残留脂质；将冲洗液转移到圆底烧瓶中。
注意：用于漂洗的氯仿的确切量并不重要，因为在后续步骤中将通过蒸发除去氯仿。

使用氮气或氩气气流蒸发烧瓶中的氯仿，同时连续旋转以形成薄脂膜。
注意：如果无法连续摇动烧瓶，则会导致脂质在烧瓶内壁上的分布不均。

氯仿蒸发后，将烧瓶转移至干燥器最少1小时。
要制备钙黄绿素包裹的囊泡（染料浓度为103 mM），请在1.5 ml微量离心管中将70 mg 钙黄绿素添加到865 del去离子的H 2 O + 135μl2 N NaOH中。涡旋该溶液，直至所有的的钙黄绿素溶解。将所得的〜1 ml 钙黄绿素溶液与干燥的脂质一起加入圆底烧瓶中。
注意：如果钙黄绿素不溶解，则可以逐滴添加2 N NaOH（在两滴之间涡旋）直至完全溶解。溶液体积可以根据需要按比例缩小以增加脂质体浓度。重量克分子渗透压浓度必须保持相同（即，〜280 毫渗透摩尔浓度/千克）两者的内和外的脂质体在所有阶段的解决方案和可以使用标准微渗透压计来监测。

在1小时内每5分钟将烧瓶旋转30秒钟，以确保来自烧瓶内壁的所有脂质均落入溶液中。
注意：在脂质体制备过程中，脂质悬浮液应保持在脂质混合物的相变温度以上（根据供应商的指导原则确定，在这种情况下为Avanti决定）。1：1（mol / mol）PG：PC 可接受的温度为25°C 。在该步骤中，可以准备柱色谱法（参见步骤D1 ）。

挤出机总成
将4个过滤器支架和1个聚碳酸酯膜浸入一个小容量的去离子H 2 O 烧杯中。
将2个内部膜片支架（图2）放在O形圈朝上的平面上。
在聚四氟乙烯孔口上放置2个浸透的过滤器支架。过滤器支架应粘附在O形圈内径内的特氟龙孔上。
将内部膜片支架和过滤器支架以O形圈朝上的方式插入挤出机的外壳中。
在挤出机外壳中的过滤器支架和O形圈上方放置1个聚碳酸酯膜。聚碳酸酯膜是薄而有光泽的圆盘。请勿安装用于分隔聚碳酸酯膜的蓝色纸盘之一。根据所需的脂质体直径，可以使用孔径不同于0.05的膜。μ米在材料部分中提到的孔径。
注意：聚碳酸酯膜和过滤器支架旨在用于单个脂质体制剂，不应重复使用。

将剩下的2个浸透的过滤器支架放在剩余的内部膜支架的孔口上。
小心地将第二个内部膜片支架放到外壳中（O形圈朝下），当它与聚碳酸酯膜片接触时，请小心不要扭曲膜片支架。
将聚四氟乙烯轴承放入固定螺母。
将固定螺母放在挤出机外壳的螺纹端上，并用手拧紧，直到用手将固定螺母拧紧；请勿使用扳手或其他拧紧工具。
将微型挤出机组件固定到挤出机支架上，并使固定螺母的顶点朝上。
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图2. 挤出机系统的组装。（顶部）挤出机组件的示意图（根据Avanti进行了修改）。A.挤出机外铸件。B.内部膜支持。C. O形圈通道。D.过滤器支持。E. O型圈。F.聚碳酸酯膜。G.内部膜支持。H.铁氟龙轴承。I.固定螺母。（底部）带挤出机的注射器组件。

对硫磷脂质体
用约1 ml的脂质/ 钙黄绿素溶液填充干净的Hamilton g 激光注射器。
小心地将已填充的注射器放入微型挤出机的一端。
小心地将一个空注射器插入微型挤出机的另一端。空注射器的柱塞应完全压入注射器针筒。
注意：2个注射器应彼此对齐，并平行于挤出机支架。

缓慢按下已填充注射器的柱塞，使脂质/ 钙黄绿素溶液通过膜并支持过滤器。挤出机支架应固定在适当的位置，以防止弯曲并保持注射器排成一直线。
注意：请注意转移到先前为空的注射器中的体积。该体积应比起始体积小约100小，但在随后的从一个注射器到另一个注射器的整个通道中应保持恒定。体积进一步减小表示由于装配不当而导致的泄漏。

继续将脂质/ 钙黄绿素溶液从一个注射器转移到另一个注射器约21次。通过的次数应始终为奇数，以使溶液收集在最初为空的注射器中。
经过约21次后，将脂质/ 钙黄绿素溶液转移到1.5 ml微量离心管中。

钙黄绿素负载脂质体与游离染料的分离
在一个小烧杯中，将1 g Sephadex G-50珠子（或类似物）重悬于8-10 ml去离子H 2 O中，以确保珠子被完全覆盖。
连续涡旋混合珠子，并转移到带有底部过滤器的适当尺寸的重力流色谱柱中。使树脂沉降，并继续添加珠子直到床达到7厘米的高度。适当的色谱柱高度对于最佳分离和流速至关重要。挖掘塔以除去任何气泡，并允许珠来结算。将过滤器放在珠子的顶部。存放在4℃，直到准备使用。色谱柱可以存储在20％（v / v）的乙醇（或短时间内0.02％（w / v）的NaN 3 ）中并重复使用。
注意：使用前，在交换到所需的流动相之前，用数倍于柱体积（CV）的去离子H 2 O 冲洗色谱柱。用> 2 CV的1 x PBS / 0.02％（w / v）NaN 3 平衡色谱柱。监控流量以防止色谱柱干燥。

吸取〜300-500 µl脂质/ 钙黄绿素溶液（步骤C 6 ）到柱床的顶部，并监测钙黄绿素条带的分离（图3）。钙黄绿素脂质体中应该是橙色/黄色较淡，而游离钙黄绿应该是红色。
注意：上样量取决于色谱柱的上样量和分离量。在将样品首先应用于色谱柱后，请等待溶液完全进入色谱柱。然后，添加相同体积的流动相，并使其完全进入。接下来，应用较大体积的流动相，并进行分离，直到所有可见的带都从色谱柱上洗脱下来。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1902708--1445 SeemaMattoo 861630 \图jpg \图3.jpg

图3. 使用Sephadex G-50色谱柱将钙黄绿素负载的脂质体与游离染料分离。将装有钙黄绿素的脂质体和未包封的染料的混合物缓慢添加至分离柱的顶部，并留出一定时间进入分离床。将缓冲溶液缓慢添加到床顶部，以将脂质体驱入色谱柱。脂质体在未封装的染料（红色）之前以明显的浅橙色带出现。

收集含有脂质体的级分，该级分将在游离钙黄绿素染料之前洗脱。根据输入和输出量，计算脂质体的稀释度和最终浓度（以mM为单位）。
注意：使用过量的缓冲液或去离子H 2 O 洗涤色谱柱，直到所有游离染料都被除去。至关重要的是，洗涤溶液的pH值应为7.0或更高，以确保完全去除染料。将色谱柱存储在20％（v / v）乙醇中，直至进一步使用。

将脂质体储存在4 °C 直至可以使用。通过动态光散射（DLS）来测量脂质体的大小分布以及脂质体溶液的荧光，从而监测脂质体的稳定性。脂质体的稳定性（以及确保稳定性的最佳储存条件）可能因其组成而异。

脂质体表征
脂质体的形态可以通过负染色透射电子显微镜（TEM）和DLS分析。

TEM负染色成像：

使用辉光放电仪对格栅放电（遵循仪器特定的协议）。
将3μl脂质体溶液（稀释至0.5 mg / ml）添加到排出的网格中，并在25°C 下孵育1分钟。
用去离子水H 2 O 洗涤样品（不允许网格完全干燥）。
通过用滤网拍打网格除去多余的H 2 O ，并用1％（w / v）PTA溶液（3 µl）染色30 s至1分钟。
用滤纸吸干多余的溶液。
图像使用透射电子显微镜的样品（例如，FEI TECNAI G2 20）操作在200kV。

DLS：

将脂质体溶液用1 x PBS（终浓度0.5 mg / ml）稀释，然后转移到可重复使用的石英比色皿或一次性塑料比色皿中，具体取决于仪器。检查的体积将取决于比色杯的性质（例如，对于图4中所示的实验，将80毫升的稀释脂质体溶液转移到石英比色杯中）。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1902708--1445 SeemaMattoo 861630 \图jpg \图4.jpg

图4.通过DLS和阴性染色TEM表征脂质体。在脂质体中的A.代表强度分布1 X 使用测量PBS 德尔萨纳米仪器指示脂质体具有83.1纳米的平均直径的均匀分布。B.脂质体的代表性电子显微照片显示预期的双层形态。比例尺代表100 nm。光盘。手动缩放单个脂质体。

使用DLS仪器（例如，Delsa纳米亚微米粒径和Zeta电位分析仪）分析样品。

监测钙黄绿素泄漏
计算建立最终体积为50或100 µl的分析所需的1 x PBS，脂质体溶液和αSyn 储备液的体积。脂质体和αSyn的终浓度分别为800 µM和40 µM。如前所述（Ysselstein 等人，2015和2017），从大肠杆菌表达系统中纯化用于该测定的αSyn 蛋白，并使用双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒确定αSyn 储备溶液的浓度。
将测定成分直接添加到96或384孔黑色实心板的孔中，最后添加蛋白质。轻轻移液至最终体积的一半，上下混合3至5次。
用塑料板密封垫盖住板，然后将板转移到酶标仪中。
将酶标仪的激发和发射波长分别设置为485 nm和530 nm。以定义的时间间隔（例如，每15或30分钟；图5 A ）收集荧光数据。

数据分析

血脂浓度计算：

鸡蛋PG：5毫克，鸡蛋PC ：5毫克（混合并添加到1毫升钙黄绿素溶液中）

与游离染料分离之前的浓度，C 0：10 mg / ml

样品加载到Sephadex G-50色谱柱上：0.4毫升

色谱柱输出量：1.2 ml

色谱柱稀释系数（DF）：1.2 ml / 0.4 ml = 3

假设脂质体体积没有损失，则脂质体/ 钙黄绿素的浓度可计算如下：

鸡蛋PG和鸡蛋PC的平均分子量：782克/摩尔（来自Avanti产品说明书）。含钙黄绿素的脂质体溶液中脂质的摩尔浓度计算如下：

3.33 g / L x 1 mol / 782 g = 4.26 x 10 -3 mol / L = 4.26 mM

通透性计算：

分数通透性的计算公式如下：

其中，I t 是在时间t 的荧光发射强度，I 0 是在时间0的强度，I max 是去污剂裂解囊泡后确定的最大强度。

泄漏动力学，通透性分数和实验持续时间取决于脂质体组成和所测试的生物分子。由于脂质批次和脂质体制剂之间的差异，结果可能会有大约10％到20％的差异。

图5中显示了代表αSyn 依赖性钙黄绿素泄漏动力学的代表性曲线。这些数据来自钙黄绿素泄漏测定法，该测定法用于确定HYPE依赖性腺苷酸化/ AMPylation 对αSyn 介导的囊泡破坏的影响，如前所述（Sanyal 等人，2019年）。该测定表明，腺苷酰化作用导致αSyn- 膜无相互作用的扰动，进而导致膜透化减少，这是由12小时后钙黄绿素荧光降低所证实的（图5）。

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图5 。腺苷酸化降低αSyn 破坏脂质体的能力。A. 代表性图显示染料从钙黄绿素包裹的脂质体（PG：PC，1：1 mol / mol）与人野生型（WT）αSyn孵育36小时后泄漏的动力学。乙。钙黄绿素-loaded脂质体与孵育腺苷酰化αSyn （具有组成型活性E234G-HYPE预孵育）或非腺苷酰化αSyn （不与预孵育HYPE，或者与HYPE的无活性形式温育）在和检查增加钙黄绿素fluidityle 激励（485 nm和530 nm）（Sanyal 等，2015和2019）。该数据表示为12小时后的相对膜通透性，相对于非归一化腺苷酰化WT αSyn 控制。均值±SEM，n = 4个独立的生物学重复（每个重复3个技术重复）；**** P <0.0001 ，E234G-HYPE与其他各组的比较，事后检验后采用单向方差分析与Tukey的多次比较。

菜谱

10x PBS溶液（最终体积，1 L）
80克氯化钠

2克氯化钾

14.4克Na 2 HPO 4

2.4克KH 2 PO 4

通过加入1N HCl或2的1N NaOH调节至pH 7.4溶液中，然后通过0.22过滤微米膜。

2 N NaOH溶液（最终体积，0.5 L）
40.0克NaOH

致谢

我们感谢博士。丹尼尔· 伊塞尔斯坦（Daniel Ysselstein ）博士 Anwesha Sanyal博士 Omaima Ali 和Li-Kai Lin在分析开发过程中不同阶段的贡献。我们感谢博士。Rob ert Stahelin 允许在他的实验室中使用DLS仪器。我们还要感谢Jacob Glidden设计了小型挤出机的图形表示。

这项工作的部分资金来自美国国立卫生研究院国立普通医学科学研究所（R01GM10092），印第安纳州临床与转化研究所（CTSI-106564），普渡大学研究基金会（PRF-209104）和普渡大学研究所的炎症，免疫学和传染病核心启动格兰特（PI4D-209263）以SM; 补助小号从NINDS / NIH （R03NS108229 ）和Branfman家庭基金会，以及理查德·F. 博创研究提升奖，以JCR; 普渡大学研究基金会JCR和SD奖学金；以及美国礼来-斯塔克神经科学研究所-CTSI的SD博士前研究金。

利益争夺

作者报告没有利益冲突。

参考资料

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