材料和试剂

移液器和移液器技巧
1.5 ml Eppendorf离心管
载玻片小号
6孔组织培养板，经组织培养处理，平底（Fablab ，目录号：FL7105）
HEK 293T细胞（< 10代）（ATCC，目录号：CRL-3216）
没有丙酮酸钠的DMEM高葡萄糖（Gibco，目录号：11965092）
青霉素/链霉素（Gibco，目录号：15140122）
热灭活胎牛血清（Gibco，目录号：10438034）
Lipofectamine 2000（Invitrogen，目录号：11668030）
Opti-MEM降低血清培养基（Gibco，目录号：31985070）
GFP-PAK4，ftn-PA K4和inka-PAK4质粒
HEPES缓冲液，1 M，pH 7.2-7.5（G ibco，目录号：15630130）
NP-40（Sigma，目录号：I8896，也称为Igepal CA-630）
脱氧核糖核酸酶I（DN a se）（沃辛顿，目录号：LS002007）
厄尔平衡盐溶液（EBSS）（生命技术，目录号：14155-063）
六水合硫酸亚铁铵（Sigma- Aldritch ，目录号：FX0245）
D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M4125）
浓盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144-500）
三水合亚铁氰化钾（MP Biomedicals，目录号：0215256080）
裂解缓冲液（请参见食谱）
DNase储备溶液（请参阅配方）
铁装载储备溶液（请参阅食谱）
普鲁士蓝染色（请参阅食谱）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5804）
跷板（VWR Scientific Rocking Platform，Model 100）
带有明场和荧光成像的显微镜（Leica ，型号：DMI 6000B）

程序

转染
准备细胞
在6孔培养板中以大约60％的融合度接种HEK293T细胞。转染前，确保细胞未传代超过10次。

注意：只要在转染时密度为60％，就可以在转染之前的任何时间（包括立即进行）接种细胞。

转染
根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000转染HEK293T细胞。

使用2 微克总质粒和6 微升的脂质体2000每孔，对于一个1：3的质粒试剂比率。
为了产生FTN-PAK4，使用1 微克FTN-PAK4质粒和1 微克英卡-PAK4质粒。为了产生英卡-PAK4，使用2 微克英卡-PAK4质粒。质粒的浓度并不重要，而只是DNA的总质量。
在通过荧光显微镜晶体可视化助剂，包括0.2 微克质粒混合GFP-PAK4质粒。不需要增加Lipofectamine的使用量。
等待晶体生长
转染后24 h，第一个晶体应出现。尽管Inka-PAK4晶体应立即可见，但ftn-PAK4晶体在24小时后可能不明显。到m aximize晶体产量和尺寸，保持在培养物中的细胞进行转染后72小时分离之前（图URE 1）。

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图1.转染72小时后，含有ftn-PAK4和inka-PAK4晶体以及GFP-PAK4的HEK293T细胞。这些晶体准备隔离。

PAK4隔离
裂解细胞
从细胞中取出培养基，并用1 ml室温无菌去离子水轻轻冲洗一次。加入500 微升裂解缓冲液和10 微升DNA酶直接溶液到细胞培养物井，并且安置在摇臂50个倾斜/分钟，在室温下40分钟。

裂解缓冲液中DNase的存在对于高产量至关重要。如果没有DNA酶，则裂解细胞的DNA会形成粘稠的沉淀，这将捕获大多数晶体（图2）。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1903042--1433边小翠837307 \无花果jpg \ Fig2.jpg

图2. 不带DNase和带DNase的ftn-PAK4隔离。在DN 为无硒条件下，许多晶体被捕获在粘性颗粒中，从而大大降低了游离晶体的浓度。

离心机
摇动后，将裂解的细胞溶液转移至1.5 ml Eppendorf离心管中。在摆动桶式离心机中以400 rcf的速度离心1分钟。弃上清，重悬沉淀在500 微升的0.1M HEPES缓冲液中。

注意：上清液仍将包含晶体，可通过第二次离心收集。

验证隔离
通过将几微升悬浮液点滴到盖玻片上并在显微镜下观察，检查晶体产量。在明场和GFP照明下，使用10倍物镜，通过目镜可以看到隔离的晶体。

铁装载和测定
加铁
在无菌去离子水中制备FAS（50 mM，100x）和甘露醇（500 mM，100x）的溶液。将1μl 的每种原液添加到100μl的等分悬浮液中。在室温下孵育15分钟。

笔记：

的最终浓度是500 μM FAS和5 mM的甘露糖醇。甘露醇降低铁的自氧化。
FAS储备溶液必须在使用前立即制备，因为Fe 2+ 会迅速氧化成不溶性Fe 3+ 。
最终的铁负载悬浮液可以是浅黄色/橙色。该颜色越深，则沉淀的Fe 3+ 越多。
洗铁
在旋转桶式离心机中以400 rcf的速度离心样品1分钟。弃上清，重悬沉淀100 微升HEPES缓冲液中。

笔记：

重要的是使洗涤缓冲液的体积与原始悬浮液的体积相匹配。如果一个较大的体积，如500 微升，被使用时，FTN-PAK4悬浮液可能不会在离心期间沉淀，虽然WT-PAK4会。
常见故障：如果所得沉淀为黄色/橙色，则铁的孵育步骤可能太长，并且由于存在Fe 3+ 沉淀而使分析混乱。
准备普鲁士蓝（PB）染色
准备5％浓HCl v / v和1％亚铁氰化钾w / v的水溶液。

注意：在使用前立即准备PB染料非常重要，因为随着时间的推移，Fe 2+ 会氧化并产生普鲁士蓝。尽管该氧化溶液仍可工作约48小时，但其中将包含大量的普鲁士蓝颗粒悬浮液。

添加PB染色
为了验证铁的负载量，将10μl 的铁负载的PAK4晶体滴液吸移到载玻片或盖玻片上，并添加1μl 的PB污渍。液滴可以在明场光学显微镜立即检查（图URE 3）。

注意：如果成功进行铁沉积，则ftn-PAK4晶体的中心应为深蓝色。Inka-PAK4晶体可能是淡蓝色，具体取决于显微镜的光学器件。

D：\重新格式化\ 2020-5-6 \ 1903042--1433边小翠837307 \图jpg \图3-word.jpg

图3.铁负载和PB染色后，ftn-PAK4和inka-PAK4晶体的理想颜色

记事簿

所用晶胞的通过次数是晶体产率和纯度的关键变量。高通行细胞将生长更少，更小的晶体，而高通行细胞的晶体悬浮液将包含更多的碎片。
装铁后，如果在PB染色之前未从溶液中除去甘露醇，它将在几分钟内与PB染色反应产生沉淀。简短的检查结果表明，该沉淀物不会干扰染色，但会干扰干净的成像。
在对PB染色的晶体成像时，重要的是要使用明场显微镜而不是相衬，因为相衬会扭曲颜色。
一些变量比其他变量更重要。
以下变量对变化高度敏感：细胞传代数，离心速度和时间，铁负载量浓度和铁负载持续时间。
以下变量对变化不太敏感：裂解时间和摇摆速度，以及PB染色剂浓度和持续时间。
尽管甘露醇的存在有助于获得更清洁的结果，但它的存在对于实现ftn-PAK4的铁负载并不是必需的。

菜谱

裂解缓冲液
0.1 M HEPES缓冲液

1％v / v NP-40

室温保存

DNase储备溶液
12,500单位/毫升

溶于EBSS

存放在-20 °C

铁装载原液
1毫升MilliQ 水

19.6毫克硫酸亚铁铵（500 mM库存）

91毫克甘露醇（500毫米库存）

注意：请勿存放-每次都新鲜。

普鲁士蓝染色
1毫升MilliQ 水

50 μ升浓盐酸

5毫克亚铁氰化钾

注：d O不可存储- 做出新的每次。

致谢

协议w 基于Nano Letters 2019中的“工程改造遗传编码的磁性蛋白晶体” （Li 等人，2019）。这项工作得到了斯坦福大学跨学科研究生奖学金，吴仔神经科学研究所（TLL），帕卡德奖学金和工程学（BC）和NIH 1R 01GM125737 （BC）的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或利益冲突。

参考资料

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Li，TL，Wang，Z.，You，H.，Ong，Q.，Varanasi，VJ，Dong，M.，Lu，B.，Pasca ，SP and Cui，B.（2019年）。工程化遗传编码的磁性蛋白质晶体。纳米Lett 19（10）：6955-6963。
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