材料和试剂

A、细胞系

1. hESC WA01和WA09（威斯康星州威斯康星州麦迪逊市威斯康星州威斯康星州）

2. 无转基因IPSC，DF-19-9-7T和4-3-7T33（WICBank，WiCell，麦迪逊，WI）

3. 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs，WiCell，Madison，WI）

4. 非人类灵长类PSCs（NHP iPSCs）、RhF5 iPS 19.1、Cy.F 3L iPS和Cy0669#1 iPS（D'Souza等人，2016）

5. OP9小鼠骨髓基质细胞系（日本大阪大学中野博士提供）

6. Lenti XTM 293T细胞系（克隆泰克，目录号：632180）

B、试剂

1. α-MEM基本培养基，粉末（Life Technologies，目录号：12000-022）

2. DMEM/营养混合物F-12，粉末（生命技术，目录号：12400-024）

3. DMEM粉末（生命科技，目录号：12100-046）

4. Iscove改良Dulbecco培养基（IMDEM），粉末（生命技术，目录号：122-00036）

5. 火腿F-12营养混合物（F12），粉末（Life Technologies，目录号：217-00075）

6. 化学定义的浓缩脂质（CDLC）（生命科技，目录号：119-050-31）

7. 谷氨酰胺（Life Technologies，产品目录号：35050-061）

8. 非必需氨基酸（NEAA）（生命技术，目录号：11140-076）

9. DPBS粉末状，不含钙和镁（Life Technologies，目录号：21600-044）

10. EDTA 0.5 M，pH 8.0（生命科技，目录号：15575-038）

11. hPSCs的敲除序列更换（KOSR）（生命技术，目录号：10828-023）

12. TRPLE Select（生命科技，目录号：12563-029）

13. IV型胶原酶（Life Technologies，目录号：17104-019）

14. 嘌呤霉素（生命技术，目录号：A1113803）

15. 灵长类动物细胞培养基（repocell，目录号：RCHEMD001）

16. mTeSR1定义的无馈线介质（StemCell Technologies，目录号：05850）

17. TeSR-E8（E8）培养基（干细胞技术，目录号：05990）

18. 维创宁XFTM（VTN）（干细胞技术，目录号：07180）

19. 亚硒酸钠（微孔西格玛，目录号：S5261）

20. Tenascin C（密孔西格玛，目录号：CC065）

21. IV型胶原（CollV）（微孔西格玛，目录号：C5533）

22. 醋酸（密理博西格玛，目录号：537020）

23. 全转铁蛋白（milipore Sigma，目录号：T0665）

24. 氯化锂（Millipore Sigma，目录号：L9659）

25. 7-氨基放线菌素D（7-AAD；微孔西格玛，目录号：A9400）

26. 人胰岛素（milipore Sigma，目录号：19278）

27. 单硫甘油（MTG）（密理孔西格玛，目录号：S5261）

28. HEPES（微孔西格玛，目录号：H4034）

29. 葡萄糖（微孔西格玛，产品编号：G8270）

30. 2-巯基乙醇（微孔西格玛，目录号：M7522）

31. A型猪皮明胶（Millipore Sigma，目录号：G-1890）

32. 六甲基溴化铵，聚布伦（Millipore Sigma，目录号：H9268）

33. 胎牛血清，定义（HyClone，目录号：SH30070.03）

34. 胰蛋白酶0.05%/EDTA 0.5 mM（HyClone，目录号：SH30236.02）

35. 重组人Flt3配体（Peprotech，目录号：300-19）

36. 重组人FGF碱性（Peprotech，目录编号：100-18B)

37. 重组人干细胞因子（SCF）（Peprotech，目录号：300-07）

38. 重组人激活素A（ActA）（Peprotech，目录号：120-14E）

39. 重组人白细胞介素3（IL-3）（Peprotech，目录号：200-03）

40. 重组人血小板生成素（TPO）（Peprotech，目录号：300-18）

41. 重组人白细胞介素6（IL6）（Peprotech，目录号：200-06）

42. 重组人骨形态发生蛋白4（BMP4）（Peprotech，目录号：120-05ET）

43. 重组人血管内皮生长因子（VEGF）（Peprotech，目录号：100-20）

44. 重组人白细胞介素7（IL7）（Peprotech，目录号：200-07）

45. （目录号：44GSTOCRIS-99023）

46. 岩石抑制剂（Tocris，目录号：1254）

47. 人胚胎干细胞合格基质凝胶（康宁，目录号：354277）

48. 氯化钙（CaCl2）（Alfa Aesar，目录号：33296）

49. 氯化钾（KCl）（Fisher ScientificTM，目录号：BP366-1）

50. 氯化钠（NaCl）（Fisher ScientificTM，目录号：S642-212）

51. 碳酸氢钠（Fisher ScientificTM，目录号：S233-500）

52. 叠氮化钠，NaN3（Fisher ScientificTM，目录号：BP922-500）

53. BSA组分V（Fisher ScientificTM，目录号：BP1600-100）

54. 无水磷酸二氢钠（Na2HPO4）（Fisher ScientificTM，目录号：BP332-1）

55. 聚乙烯醇（PVA）（MP Biomedicals，目录号：151-941-83）

56. 强力霉素（DOX）（MP Biomedicals，目录号：198955）

57. 抗体（表1）

表1。所用抗体列表

抗原

荧光铬

克隆

单位

猫。不。

种

CD3型

FITC公司

SK7型

BD生物科学

349201

人类

CD3型

空气污染指数

S4.1

卡尔塔格因维托根

MHCD0305公司

人类

CD3型

体育课

SP34型

BD生物科学

552127

NHP公司

CD4细胞

空气污染指数

RPA-T4型

BD生物科学

555449

人类

CD4细胞

体育课

L200个

BD生物科学

550630

NHP公司

CD5型

体育课

UCHT2型

BD生物科学

555353

人类

CD5型

空气污染指数

UCHT2型

生物传奇

300611

NHP公司

CD7型

FITC公司

M-T701型

BD生物科学

555360

人类

CD7型

体育课

M-T701型

BD生物科学

555361

NHP公司

CD8型

体育课

HIT8a

BD生物科学

555635

人类

CD8型

空气污染指数

SK1型

生物传奇

344721

NHP公司

CD43型

FITC公司

1G10型

BD生物科学

555475

人类

DLL4型

体育课

447506

研发系统

工厂1506P

人类

TCRβα

体育课

T10B9.1A-BD生物科学-31

BD生物科学

555548

人类

TCRαβ

空气污染指数

73兰特

生物传奇

201110

NHP公司

川地34

体育课

563

BD生物科学

550761

NHP公司

CD45型

FITC公司

MB4-6D6型

米尔顿生物技术

130-119-764

NHP公司

C、材料

1. 池式过滤器，40µm（Fisher ScientificTM，目录号：223663547）

2. Fisher，产品目录号：22370µ548M

3. 9〃巴斯德吸管，燧石玻璃（Fisher ScientificTM，目录号：1367820D）

4. 血清学移液管（10 ml，VWR国际，目录号：89130-898）

5. 血清学移液管（95毫升，VWR国际，目录号：89130-896）

6. Nalgene一次性瓶盖过滤器，孔径为0.2µm的聚醚砜膜（Fisher ScientificTM，目录号：595-4520）

7. 0.5 ml微型离心管，可高压灭菌（Fisher ScientificTM，目录号：05-408-120）

8. 血清移液管，1ml非致热原（Fisher ScientificTM，目录号：13-678-11B）

9. 5毫升硼硅酸盐玻璃吸管（Fisher ScientificTM，目录号：1367827F）

10. 5ml聚苯乙烯圆底管，12×75mm，非无菌（BD Bioscience，目录号：352008

11. MACS分离柱，LS（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）

12. MACS Multistand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）

13. 带30µm尼龙网的预分离过滤器（Miltenyi Biotec，目录号：130-041-407）

14. 组织培养皿，聚苯乙烯100×20 mm（Thermo Scientific，目录号：130182）

15. 组织培养6孔板，聚苯乙烯平底（Thermo Scientific，目录号：130184）

16. 15ml聚丙烯锥形管（Thermo Scientific Nunc，目录号：339650）

17. 50毫升聚丙烯锥形管（Thermo Scientific，目录号：339652）

18. Steriflip过滤装置，50 ml真空过滤系统，具有0.22µm孔径的膜（微孔西格玛，目录号：SCGP00525）

19. 血清学移液管，5 ml非热原性（VWR，目录号：89130-896）

20. 血清学移液管，10 ml非热原性（VWR，目录号：89130-898）

21. 标准丁腈xtra无粉检查手套（金佰利克拉克，目录号：53139）

D、介质和溶液

1. 人PSC生长培养基（见配方）

2. MEF生长培养基（见配方）

3. NHP iPSC灵长类PSCs培养基（见配方）

4. 小鼠OP9/OP9-DLL4骨髓基质细胞培养基（见配方）

5. 人类造血分化（OP9共培养系统）培养基（见配方）

6. NHP分化培养基（见配方）

7. IF4S储备培养基（见配方）

8. 5x聚乙烯醇原液（见配方）

9. IF9S培养基（见配方）

10. T淋巴细胞分化培养基（见配方）

11. HBS盐水溶液（2x）（见配方）

12. CaCl2溶液（2 M）（见配方）

13. 明胶溶液（0.1%（重量/体积）（见配方）

14. 磁电池分选（MACS）缓冲区（见配方）

15. 流式细胞仪缓冲液（见配方）

16. 细胞因子重组（见处方）

17. 胶原酶溶液（1mg/ml）（见配方）

18. 强力霉素（1毫克/毫升）（见处方）

设备

1. MACSQuant分析仪（米尔顿生物技术公司，目录号：130-096-343）

2. CellometerR Auto 2000细胞活力计数器（Nexcelom Bioscience，型号：2000）

3. 血液细胞仪，Reichert Bright Line计数室（Fisher ScientificTM，目录号：02-671-5）

4. MACSmix管旋转器（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-753）

5. 水浴（Fisher Scientific，产品目录号：16-462-10）

6. Thermo IEC Centra CL2离心机（Thermo Scientific，型号：4992）

7. 微型离心机（Eppendorf，型号：5418）

8. Centricon Plus-70离心过滤器（微孔西格玛，目录号：UFC701008）

9. 无菌生物安全柜（贝克公司，型号：SG603）

10. 37°C/5%二氧化碳培养箱（Thermo-Scientific，型号：MCO-19A1）

11. 缺氧培养箱（Thermo-Scientific，型号：MCO-19M-PA）

12. 带4x、10x和20x物镜的倒置显微镜（Olympus，型号：IX71）

13. 物像标记，倒置显微镜用细胞斑点（尼康，目录号：MBW10020）

14. 天平（丹佛仪器，型号：APX60）

15. Milli-Q净水系统（Millipore，Billerica，MA，USA）

16. 助吸管，填充器/分配器（Drummond，型号：4-000-300）

17. 抽吸废液处理系统

18. Beckman Optima XL-A分析型超离心机（Beckman Coulter，目录号：369005）

19. 明场显微镜（奥林巴斯，型号：CKX31SF）

软件

1FlowJoTM软件（v10.6.1）（BD Biosci英语https://www.flowjo.com/1FlowJoTM软件（v10.6.1）（BD Biosci英语https://www.flowjo.com/, )

2. GraphPad棱镜7（GraphPad，）www.graphpad.com网站

程序

A、基体涂层

1. 通过添加无菌明胶溶液并使明胶溶液覆盖整个塑料表面，制备涂有明胶的10cm培养皿（10ml/皿）或6孔板（2ml/孔）。将塑料器皿在37°C的培养箱中培养至少3小时。明胶涂层皿/板用于培养OP9/OP9-DLL4/MEFs。

2. 通过向6孔板的每个孔中添加2 ml涂层溶液，制备VTN或基质凝胶涂层的6孔板，并在4°C下培养过夜。涂层板可在4°C下储存长达1个月。VTN/基质凝胶包被板用于PSCs的无饲养条件下的培养。

3. 通过向6孔板的每个孔中添加2ml涂层溶液来制备TenC或CollV涂层溶液，并在4℃下培养过夜。涂层板可在4°C下储存长达1个月。TenC/CollV涂层板用于无饲养条件下PSCs的造血分化。

B、在饲养细胞（MEFs）上培养hPSCs/NHP-PSCs

1. 在预热（37°C）的MEF生长培养基中以2×105个细胞/毫升的速度重新培养灭活的MEF（由WiCell提供）。

2. 加入2ml/孔的预热MEF生长培养基，然后将MEF悬浮液分配到涂有明胶的6孔板（1ml/孔）上，并均匀地分布MEF，使平板来回移动。

3. 在添加hPSCs或NHP PSCs之前，在37°C的5%CO2培养箱中培养MEF板至少24小时。

4. 从hPSCs或NHP-PSCs的6孔板的1孔中吸取培养基。

5. 加入2ml/孔的胶原酶IV溶液（1mg/ml）并在37°C的CO2培养箱中培养，直到hPSCs或NHP PSCs菌落的边缘开始分离（hPSCs大约7-10min，NHP-PSCs大约4-5min）。

6. 吸取胶原酶，加入2ml生长培养基，轻轻移液几次，使菌落分散成小细胞团，直至所有细胞悬浮。

7. 将细胞转移到15ml锥形管中，在室温下以300×g离心3分钟。

8. 轻轻吸取培养基，在4-6毫升的培养基中重新培养细胞，并用玻璃吸管将hPSC或NHP-PSC集落破碎成小团。

9. 从步骤B3将细胞悬浮液置于MEF生长的6孔板上（hPSCs的分裂比为1:6，NHP-PSCs的分裂比为1:4）。

C、在无饲养条件下培养hPSCs或iETS1-hPSCs

1. 从每个孔中吸取VTN或Matrigel涂层溶液，如果是VTN板，则添加1 ml TeSR-E8（E8），对于基质凝胶板，添加mTeSR1。

2. 通过PSCs时，从一口PSCs培养板中吸取废培养基并加入EDTA-PBS溶液（2mL/孔）。

3. 将培养皿在37°C和5%CO2中培养3-4分钟。

4. 小心地吸取EDTA-PBS溶液，并添加1mL E8或mTeSR1。

5. 用移液管轻轻移走细胞并收集到一个15毫升的锥形管中。

6. 用E8或mTeSR1将体积调节到6毫升。

7. 混合均匀，并将细胞悬浮液（1毫升/孔6孔板）添加到VTN或基质凝胶涂层板中。

8. 此后，每天将用过的介质更换为新鲜的E8或mTeSR1介质。

D、人类DLL4慢病毒的产生

1. 在转染前一天将293T细胞传代至60-70%融合度，在9毫升DMEM培养基中，每100毫米培养皿含10%FBS。

2. 第0天早上进行磷酸钙（CaPO4）转染293T细胞。对于CaPO4转染，对于每个培养皿，制备含有10μg含hDLL4（pSIN4-EF1α-hDLL4 IRES Puro）的表达慢病毒载体、10μg包装载体、7.5μg包膜载体、62μl 2 M CaCl2的混合物，并用去离子高压水将体积增加至500μl。

3. 使用另一支1毫升移液管，滴加500微升2x HBS到混合物中。

4. 将混合物再鼓泡5-10秒。在室温下培养15-20分钟。

5. 将混合物逐滴加入293T试管中，同时不断旋转培养皿。

6. 将培养皿放入37℃的5%二氧化碳培养箱中6-8小时。

7. 培养8小时后吸出培养基。

8. 在盘子中加入8毫升新鲜培养基，继续培养2天。

9. 第3天，将含有病毒的培养基收获到50毫升试管中。

10. 在室温下以700 x g离心上清液10分钟。

11. 含有病毒的上清液可在-70°C下储存或使用环氧乙烷灭菌的Centricon Plus-70或Amicon Ultra-15离心过滤装置进行浓缩。

12. 计算每毫升病毒浓缩物的感染单位数（IFU），用病毒转染HeLa细胞，用嘌呤霉素（1μg/ml）筛选。

E、人DLL4表达小鼠OP9基质细胞的建立

1. 从培养皿中吸取明胶溶液。不要让盘子晾干。

2. 在37°C水浴中快速解冻OP9细胞。

3. 用移液管缓慢吸取细胞悬液，并将内容物转移到含有5 ml培养基的15 ml试管中。

4. 将细胞在300 x g下在4℃下离心5分钟，并在10 ml OP9培养基中重新悬浮细胞。

5. 将再悬浮细胞移入10 cm培养皿中，并将培养皿置于37°C、含5%CO2的培养箱中。

6. 对于病毒转导，在培养基中加入聚布伦（6μg/ml）。

7. 将hDLL4慢病毒以10%的MOI加入细胞中，培养皿在37℃和5%的CO2中培养24小时。

8. 如E7-E8所述，重复一次病毒转导。

9. 在培养基中加入20 ng/ml嘌呤霉素，筛选转染的OP9-DLL4细胞。

10. 为确认hDLL4转化为OP9，将细胞重新置于100μl FACS缓冲液中，在室温下用人DLL4抗体染色20分钟（表1）。

11. 用流式细胞仪缓冲液冲洗染色细胞并进行流式细胞术。

F、 OP9/OP9-DLL4细胞的维护

1. 传代细胞时，吸取OP9生长培养基，用10ml PBS冲洗OP9/OP9-DLL4细胞两次。

2. 添加5ml胰蛋白酶/EDTA[0.05%（wt/vol）]溶液，并在37℃下在5%二氧化碳培养箱中培养10分钟。

3. 加入5毫升OP9生长培养基，上下吸管收集细胞，直至形成单细胞悬浮液。

4. 将细胞悬浮液移入15ml锥形管中，在室温下以300×g离心5分钟。

5. 吸取上清液，在1ml的OP9培养基中重新培养细胞。

6. 将100μl细胞悬浮液加入10 ml OP9生长培养基中，并将平板细胞置于10 cm明胶涂层培养皿中。

7. 当文化汇合时，分开一个盘子来维持。

8. 8-9天龄的OP9培养皿应用于人胚胎干细胞的造血分化，5-6天龄的OP9培养皿应用于NHP-iPSCs的造血分化。

9. 3-4天大的OP9-DLL4应用于后续方案，即T淋巴细胞分化。

G、造血分化

OP9上的人体PSC

1. 从6孔hPSC板的1孔中，吸入hESC生长培养基。加入2ml胶原酶IV溶液（1mg/ml），在37°C下培养细胞10分钟（图1）。

图1。示意图显示了人多能干细胞在无血清化学定义的无饲养条件下，在OP9共培养体系中的培养和造血分化。利用OP9共培养系统中富含MACS的祖细胞和无饲养系统的漂浮细胞进行T淋巴细胞分化。

2. 吸取胶原酶IV溶液，将每孔生长培养基直接加入2毫升，轻轻移液，将菌落分解成小细胞聚集体。将细胞移入15ml锥形管中。

3. 在室温下，在300 x g下离心5分钟。在不干扰颗粒的情况下，轻轻吸入培养基。

4. 再将包衣细胞放入10ml分化培养基中。

5. 共培养时，从过度生长的OP9培养皿中吸取OP9生长培养基。

6. 在OP9培养皿中加入10毫升步骤4中的细胞悬浮液。

7. 通过前后移动培养皿和左右移动两次，将细胞均匀地分散在OP9单层上，并在5%二氧化碳培养箱中保持37°C。

8. 第1天吸取所有培养基，并用10毫升分化培养基代替。

9. 在第4天和第6天，吸取5ml废培养基并添加5ml新鲜分化培养基。

10. 在第9天，吸取所有培养基并向每盘共培养皿中添加5 ml胶原酶溶液，并在37°C的CO2培养箱中培养20分钟。

11. 取出胶原酶溶液，置于50毫升锥形管中冰保存。

12. 向培养皿中添加5ml胰蛋白酶/EDTA溶液[0.05%（wt/vol）]，并在37℃下在5%二氧化碳培养箱中培养10分钟。

13. 每盘MACS缓冲液加5ml，用移液管悬浮共培养细胞，从第11步开始转移到收集管中。

14. 在室温下以300 x g离心分离细胞悬浮液5分钟。

15. 用5 ml的MACS缓冲液重新悬浮颗粒细胞，并在室温下以300 x g离心5分钟。

16. 在0.5-1 ml的MACS缓冲液中再悬浮细胞。

17. 用抗人CD43-FITC抗体染色。

18. 将试管放在MACS混合器上，在4°C下培养20-25分钟。

19. 如步骤15所述，用冰冷的MACS缓冲液清洗电池。

20. 再放入80μl的MACS缓冲液中，加入抗FITC磁珠。

21. 重复步骤18。

22. 如步骤15所述，用冰冷的MACS缓冲液清洗细胞，并在2ml MACS缓冲液中重新悬浮。

23. 通过30μm预分离过滤器过滤电池。

24. 按照制造商的说明组装MACS-LS分离装置。

25. 用2ml MACS缓冲液冲洗色谱柱。

26. 为了纯化CD43+多能干祖细胞，将步骤22中的细胞悬浮液涂在LS柱中，让细胞完全通过柱进入收集管。

27. 用2ml MACS缓冲液冲洗色谱柱，并将其收集在同一收集管中。

28. 丢弃收集管中的细胞悬浮液。

29. 从磁铁上取下色谱柱，并将其放在一个15毫升的空试管上。

30. 使用色谱柱随附的柱塞，用5ml MACS缓冲液冲洗CD43+细胞。

31. 在4°C下，在300 x g下离心5分钟。

32. 在0.2 ml的MACS缓冲液中再悬浮细胞。

33. 富含MACS的CD43+多能造血祖细胞可用于T淋巴细胞分化。

在规定的血清和无饲养系统中的人PSCs或iETS1 PSCs

1. 用色氨酸选择法制备人胚胎干细胞单细胞悬液。向80%汇合的ESC板中加入1ml/孔的胰蛋白酶溶液，并在37°C和5%CO2下培养4 min（图1）。

2. 用1ml胰蛋白酶溶液收获细胞，并将其收集到15ml锥形管和9ml E8培养基中。

3. 在室温下将300 x g离心5分钟。

4. 将包衣细胞重新置于6ml新鲜E8培养基中，计数细胞。

5. 从涂层板的每个孔中吸取TenC或CollV涂层溶液。

6. 在涂层板的每个孔中添加1 ml E8培养基和10μM岩石抑制剂。

7. 将步骤F4中优化数量的细胞转移到新的15 ml锥形管中，并将体积调节到6 ml。

8. 在10-C涂层板的每个孔中添加1 ml含有ESC的E8。

9. 在37°C、5%CO2中培养过夜。

10. 第0天，吸取E8培养基，加入2mL/孔的分化培养基（IF9S），其中包括激活素A（18 ng/ml）、BMP4（50 ng/ml）、bFGF2（50 ng/ml）、LiCl（2 mM）和岩石抑制剂（1μM）。

11. 在缺氧培养箱（5%O2）中放置细胞。在接下来的两天里，不要将培养皿从培养箱中取出。

12. 在第2天，吸取用过的分化培养基，并加入2ml/孔的新鲜分化培养基，加入VEGF（50ng/ml）和bFGF2（50ng/ml）。用多西环素（2μg/ml）处理iETS1-PSCs鉴别板。

13. 将细胞放回缺氧培养箱，即37°C和5%CO2。

14. 在第4天，吸取用过的分化培养基，加入2ml/孔的新鲜分化培养基，包括SCF（50ng/ml）、VEGF（50ng/ml）、TPO（50ng/ml）、IL6（50ng/ml）、IL3（10ng/ml）和FLT3-L（10ng/ml）。用多西环素（2μg/ml）处理iETS1-PSCs鉴别板。

15. 将细胞置于常氧培养箱中。

16. 在第6天，添加1ml/孔的新鲜分化培养基和步骤14中的细胞因子。

17. 在第8-9天，通过70μm过滤器收集漂浮的多能HPs，用于进一步的淋巴分化。

OP9上的非人灵长类PSCs

1. 从6孔NHP-PSC板的1孔中，抽吸NHP-PSC生长培养基。加入2ml胶原酶IV溶液（1mg/ml），在37°C下培养5分钟。

2. 吸取胶原酶IV溶液，将每孔生长培养基直接加入2毫升，轻轻移液，将菌落分解成小细胞聚集体。将细胞移入15ml锥形管中。

3. 在室温下，在300 x g下离心5分钟。在不干扰颗粒的情况下，轻轻吸入培养基。

4. 再将包衣细胞放入10ml灵长类分化培养基中。

5. 从培养箱中取出6-7天龄的OP9培养皿，吸取OP9培养基（图2）。

图2。NHP IPSC中胚层和血液形成诱导分化方案示意图。在GSK3b抑制剂存在下，与OP9共培养，诱导NHP-PSCs的造血分化。用漂浮的CD34+CD45+细胞进行T淋巴细胞分化。

6. 将第4步中的细胞添加到OP9培养皿中，来回移动培养皿，使细胞在OP9单层（第0天）上均匀分布。

7. 在共培养的第1天，吸取培养基并添加10 ml灵长类分化培养基，其中4μM的CHR99021和50 ng/ml的VEGF。

8. 在第3天，吸取培养基，并添加新鲜的10毫升新鲜灵长类分化培养基和50纳克/毫升的血管内皮生长因子。

9. 第6天，在灵长类分化培养基中加入含有50 ng/ml VEGF、50 ng/ml SCF、20 ng/ml TPO、20 ng/ml IL-3和20 ng/ml IL-6的造血细胞因子混合物。

10. 第8天重复第9步。

11. 共培养第10天，收集漂浮的多能HPs，通过70μm过滤器收集，用于进一步的淋巴分化。

H、 OP9-DLL4共培养系统的淋巴分化

1. 通过每孔接种0.5 x 105个OP9-DLL4细胞制备含有6孔板的OP9-DLL4细胞（图3）。

图3。示意图显示不同来源HPs的T淋巴细胞分化。从OP9/hPSC或OP9/NHP-PSCs或无饲养系统收集HPs并计数，在OP9-DLL4上培养诱导T细胞分化。

2. 在37°C和5%的CO2中培养3-4天或直到形成单层细胞。

3. 一旦OP9-DLL4平板准备好共培养，用T细胞培养基（含20%FBS的OP9培养基与FLT3-L（5ng/ml）、IL-7（5ng/ml）和SCF（10ng/ml））将来自不同来源的HPs细胞（1 x 105-3 x 105细胞/孔6孔板）接种在OP9-DLL4上。

4. 培养皿在37°C和5%CO2下培养3-4周，每周传代一次。

5. 第3天，加入1ml新鲜的T细胞分化培养基，并制备新的OP9-DLL4平板，用于第6-7天的细胞转移。

6. 在第6-7天，通过强力移液管移走祖细胞，并将细胞收集到一个15毫升的锥形管中（图3）。

7. 使用40μm过滤器过滤电池。

8. 在室温下以300 x g离心5分钟。

9. 吸取上清液并在2ml T细胞培养基中重新悬浮细胞，并转移到新鲜的OP9-DLL4单层上（图3）。

10. 第10天，加入1ml新鲜的T细胞分化培养基，并准备一个新的OP9-DLL4平板，用于第13-14天的细胞转移。

11. 在第13-14天，重复步骤H6-H10。

12. 第18天，加入1ml新鲜的T细胞分化培养基，并准备一个新的OP9-DLL4平板，用于第20-21天的细胞转移。

13. 在第20-21天，重复步骤H6-H10。

14. 第24天，加入1ml新鲜的T细胞分化培养基，并制备新的OP9-DLL4平板用于细胞转移。

15. 在第27天，通过大力吸管和滤入15毫升的锥形管来收获细胞。

16. 在室温下以300 x g离心5分钟。吸取上清液并在1 ml流式细胞仪缓冲液中重新悬浮细胞。

17. 使用MACSQuant分析仪10（图4）通过流式细胞术分析T细胞标记物（CD5、CD7、CD8、CD4、CD3和TCRαβ）（表1）评估T细胞分化。

图4。HPs的T细胞电位。A、在OP9-DLL4上培养3周后产生的T细胞的流式细胞仪分析，这些细胞是在OP9上分化8/9天的。B、 iETS1 PSC产生的T细胞的流式细胞仪分析。在化学定义的无饲养系统中，用强力霉素或不添加强力霉素诱导iETS1细胞分化9天，第9天收集漂浮细胞。C、用流式细胞术分析NHP PSC在OP9-DLL4上培养CD34+CD45+3周后产生的T细胞。

数据分析

1流式细胞术数据用FlowJo软件（v10.6.1）进行分析。根据7AAD群体对活细胞进行门控，去除死亡细胞。1流式细胞术数据用FlowJo软件（v10.6.1）进行分析。根据7AAD群体对活细胞进行门控，去除死亡细胞。

2. 平均值之间差异的显著性通过单因素方差分析确定，然后使用GraphPad Prism软件（加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad）进行Tukey事后检验。

笔记

1. 在MEFs上培养的hPSCs需要每6-7天分裂一次，而NHP-PSCs则需要每4天分裂一次。

2. 用于培养psc的生长培养基取决于用于培养的喂料器/基质的类型。对于在vitronectin上生长的hPSCs，使用E8，而对于在基质凝胶上生长的hPSCs，使用mTeSR1。在MEFs上生长的hPSCs使用PSC生长培养基，而在MEFs上生长的NHP-PSC使用NHP-PSC培养基。

3. 胶原酶处理后，hPSCs/NHP-PSCs菌落松散附着，可通过温和的移液管收集。不要使用过度的机械力或刮擦，这会引起自发分化。

4. 如果hPSCs/NHP-iPSCs发生自发分化，在维持过程中应剔除分化后的菌落，每天更换培养基前观察PSCs。在倒置显微镜下用客观标记物标记已分化的菌落，并用玻璃巴斯德吸管吸出标记区域，同时用新鲜培养基喂养PSC。

5. 基质凝胶对温度敏感，在处理过程中应放在冰上。建议为四个6孔板制备200μl等分试样，并在-20°C下储存，以避免冻融循环。具体的等分体积因批次而异。迅速将各等分试样溶解在48 ml冷PBS中，然后向6孔板的每个孔中添加2 ml。在室温下孵育至少1小时，或在4℃下储存过夜，直到可以使用。基体凝胶涂层板可在4°C下保存数周。

6. 维生素C对温度不敏感，可在室温下解冻。在1x PBS中稀释维生素C，使其最终浓度达到10μg/ml（2mL Vitronectin/50mL 1x PBS），并通过移液管轻轻混合。在1毫升/孔的6孔组织培养板上涂上稀释的维生素C。使用前在室温下培养至少1小时。如果不立即使用，则必须密封涂层培养板，并在4°C下保存1周。保存时，必须在细胞传代前将涂层培养板置于室温下30分钟。

7. hPSCs可在无馈线条件下维持。对于OP9共培养系统，我们总是倾向于使用维持在MEFs上的hPSCs或NHP-iPSCs。在无饲养条件下维持的hPSCs用于化学定义的无饲养条件下的造血分化。我们观察到维持在MEFs或OP9共培养系统中的hPSCs/NHP-iPSCs的造血分化效率存在显著差异。

8. 我们发现工程化iETS1-hPSCs在基质凝胶涂层板上保持未分化形态和有效的造血分化潜能。与此相反，在涂有vitronectin的平板上培养，iETS1细胞的形态不均匀，不能有效地分化。

9. 在明胶涂层板上培养OP9/OP9-DLL4以防止自发性脂肪生成。

10. OP9共培养体系中人类造血分化倾向于OP9融合培养（8-9天），而NHP-iPSCs在OP9共培养体系上的造血分化倾向于6-7天龄的OP9培养。

11. 在化学条件下，人类造血分化需要特定的电镀密度，以获得最佳的血内皮分化。人类胚胎干细胞需要电镀大约7500个细胞/cm2。在Ten-C或CollV板上采集、计数和播种hPSCs应迅速进行，因为奇点hPSCs在与岩石抑制剂混合和电镀之前不能很好地存活。

12. OP9-DLL4细胞应每3-4天分裂一次，以进行维护/扩展。正确维持OP9-DLL4是T细胞分化最关键的步骤。我们的实验室严格使用规定的FBS，没有热灭活。热灭活不利于培养，反而对OP9/OP9-DLL4产生更高的成脂作用。

13. 我们发现，不同数量的杂合子定义的FBS对OP9-DLL4的维持和T细胞分化提供了相对一致的影响，而没有实质性的脂肪生成。其他供应商的结果则更具变数。

14. OP9-DLL4细胞不应过度融合，因为它降低了T细胞的分化能力。因此，在细胞汇合之前进行传代是非常重要的，通常在合适的血清中培养3-4天。

15. HPs/OP9-DLL4共培养的细胞密度可能影响下游分化。高数量的HPs可导致NK细胞的快速发育，这可能导致OP9-DLL4喂食者的快速死亡，并损害T细胞的发育。

16. 在OP9-DLL4上分化HPs可在第二周或更早达到高密度。如果出现这种情况，将细胞分裂到新鲜的OP9-DLL4板上。大约1×105个T细胞祖细胞/孔的6孔板适合在第二周或随后几周分化。高密度培养可导致T细胞分化效率降低。

17. T细胞分化过程中没有严格的周传代规律。如果分化细胞呈高密度，建议尽快将其传代到新鲜的OP9-DLL4上。

18. 与其他系统、细胞类型和来源相比，在多西环素处理和未处理条件下，从iETS1 hESCs获得的1 x 104 CD43+细胞产生的T细胞总数要高得多（图5）。

图5。条形图显示了在多西环素处理和未处理条件下，野生型NHP-iPSCs和hPSCs中从iETS1-hESCs获得的104个HPs生成的T细胞总数。 iETS1 PSC产生的T细胞总数高于不同方法和不同来源产生的总HPs。

食谱

1. 人PSC生长培养基（表2）

a、根据制造商的说明，从粉末中制备DMEM/F-12储备

b、使用0.22μm薄膜过滤器对过滤器进行消毒，并在2-8°C下储存2个月

c、用此基础培养基制备500毫升完整的人胚胎干细胞培养基

表2。人PSC生长培养基

组成

容量（500毫升）

最终浓度

DMEM/F-12

KO血清置换

NEAA溶液（100倍；10毫米）

L-谷氨酰胺/2-巯基乙醇（100 mM）

碱性FGF-2（100μg/ml）

390毫升

100毫升

5毫升

5毫升

10微升

20%

100 微米

1毫米

4纳克/毫升

2. MEF生长培养基（表3）

a、根据制造商的说明，从粉末中制备DMEM库存

b、使用0.22μm薄膜过滤器对过滤器进行消毒，并在2-8°C下储存2个月

c、使用DMEM储备制备500 ml MEF生长培养基，并在2-8°c下储存3周

表3。MEF生长培养基

组成

容量（500毫升）

最终浓度

DMEM公司

FBS公司

NEAA解决方案

（100倍，10毫米）

445毫升

50毫升

5毫升

10%

100 微米

3. NHP-PSC培养基（表4）

用来自repocell的灵长类ESC培养基制备500ml NHP-PSCs培养基

表4。NHP-PSC培养基

组成

容量（500毫升）

最终浓度

灵长类动物细胞培养基

基本FGF2

500毫升

20微升

4纳克/毫升

4. 小鼠OP9/OP9-DLL4骨髓基质细胞培养基（表5）

a、根据制造商的说明，从粉末中制备新鲜α-MEM

b、使用0.22-μm薄膜过滤器过滤消毒，并在2-8°C下储存2个月

c、使用此基础培养基制备500 ml完整的OP9/OP9-DLL4培养基

表5。OP9/OP9-DLL4介质

组成

音量

最终浓度

α-MEM

Hyclone FBS公司

400毫升

100毫升

20%

5. 人造血分化（OP9共培养系统）培养基（表6）

用α-MEM基础培养基制备人造血分化培养基500ml

表6。OP9共培养基诱导hPSCs分化

组成

音量

最终浓度

α-MEM

Hyclone FBS公司

MTG公司

抗坏血酸

400毫升

100毫升

500微升

500 微升

20%

100微米

50毫克/毫升

6. NHP分化培养基（表7）

用α-MEM基础培养基配制500毫升灵长类分化培养基

表7。NHP-PSC分化培养基

组成

音量

最终浓度

α-MEM

Hyclone FBS公司

2-巯基乙醇

450毫升

50毫升

1.76微升

10%

50微米

7. IF4S储备介质（表8）

使用以下组件准备10x IF4S基本培养基

表8。IF4S储备介质

组成

音量

股票集中度

IMDM公司

12层

二次蒸馏水

碳酸氢钠

抗坏血酸

MTG公司

亚硒酸钠

CDLC

1长x 5

1长x 5

900毫升

21克

640毫克

400微升

120 微升

20毫升

5倍

5倍

21克/升

640毫克/升

400 微升/升

140 微克/升

2倍

8. 5x聚乙烯醇原液（表9）

a、用搅拌棒高压灭菌1L ddH2O。完成后，将其放在加热的磁力搅拌器上

b、以2.5g的增量缓慢添加PVA

c、在添加更多的聚乙烯醇之前，确保其溶解，并且不会在热的ddH2O中聚集

d、加入所有聚乙烯醇后，继续在室温下搅拌过夜

e、第二天再次高压灭菌

f、室温保存1年

表9。聚乙烯醇原液

组成

音量

最终浓度

聚乙烯醇

二次蒸馏水

50克

1升

50克/升

9. IF9S培养基（表10）

a、用IF4S培养基配制人造血分化培养基用IF9S培养基500ml

b、在IF4S中加入以下不含PVA的成分，用0.22μm膜过滤器过滤消毒

c、过滤后加入100毫升5x聚乙烯醇

表10。IF9S中等

组成

音量

股票集中度

IF4S（10倍）

二次蒸馏水

聚乙烯醇

谷氨酰胺（100倍）

NEAA（100倍）

全转铁蛋白

胰岛素

50毫升

340毫升

100毫升

5毫升

5毫升

500 微升

1毫升

10克/升

1倍

1倍

10.6毫克/升

20毫克/升

10. T淋巴细胞分化培养基（表11）

a、用α-MEM基础培养基制备T淋巴细胞分化培养基

b、制备100ml T淋巴细胞分化培养基，在α-MEM基础培养基中加入以下成分，用0.22μm膜过滤器过滤消毒

c、或者，在OP9/OP9-DLL4培养基中加入SCF（10ng/ml）、IL-7（5ng/ml）和FLT3-L（5ng/ml），制成T淋巴细胞分化培养基

表11。T淋巴细胞分化培养基

组成

音量

最终浓度

α-MEM

Hyclone FBS公司

SCF-1型

第七章

飞机三层

80毫升

20毫升

10微升

5 微升

5 微升

20%

10纳克/毫升

5纳克/毫升

5纳克/毫升

11. HBS盐水溶液（2x）

a、通过添加HEPES（50 mM）、KCl（10 mM）、葡萄糖（12 mM）、NaCl（280 mM）和Na2HPO4（1.5 mM）制备100 ml 2x HBS溶液

b、将pH值精确调整到7.05-7.08

c、用0.2μm过滤器过滤溶液

12. CaCl2溶液（2 M）

a、将14.702 g CaCl2溶解于50 ml蒸馏水中，制备50 ml 2 M CaCl2溶液

b、用0.2μm过滤器过滤消毒溶液

13. 明胶溶液[0.1%（wt/vol）]

a、向500 ml无内毒素试剂级蒸馏水中添加500 mg明胶

b、在121°C下通过高压灭菌20分钟溶解和灭菌

c、将溶液在4°c下保存最多6个月

14. 磁电池分选（MACS）缓冲器（表12）

a、准备500ml的MACS缓冲液，如图所示

b、使用0.22µm薄膜过滤器过滤，对MACS缓冲液进行消毒，并在2-8°C下保存6个月

表12。MACS缓冲区

组成

容量（500毫升）

最终浓度

DPBS公司

FBS公司

EDTA（0.5米）

473毫升

25毫升

2毫升

5%

2 毫米

15. 流式细胞仪缓冲液（FACS）缓冲液（表13）

a、准备500ml FACS缓冲液，如图所示

b、使用0.22µm薄膜过滤器过滤缓冲液，并在2-8°C下储存最多6个月

表13。FACS缓冲区

组成

容量（500毫升）

最终浓度

DPBS公司

FBS公司

EDTA（0.5米）

叠氮化钠

488毫升

10毫升

2毫升

0.25克

2%

2 毫米

0.05%

16. 细胞因子重组

a、根据制造商的建议，将所有细胞因子重组并储存在-80°C

b、简单地说，在打开小瓶之前，以最大速度离心1分钟使冻干颗粒沉淀

c、用0.1%BSA/PBS溶液稀释至工作浓度，并在-80°c下储存至需要使用

17. 胶原酶溶液（1mg/ml）

a、在50 ml DMEM/F-12基本培养基中加入50 mg胶原酶，用0.22μm膜过滤器过滤消毒

b、将溶液保持在2-8°C，并使用1周

18. 强力霉素（1毫克/毫升）

a、在ddHO中溶解多西环素至1 mg/ml2

b、在琥珀色1.5-ml微型离心管中制备100μl校准品，用于避光，并在4°C下储存5天或在20°C下储存2个月

致谢

我们感谢Slukvin实验室的许多成员，特别是Maxim Vidyanik博士和Kyung Dal Choi博士，他们多年来在OP9共培养系统上帮助开发和优化了人类造血分化。我们感谢Toru Nakano博士（日本大阪大学）提供了OP9细胞，Mitch Probasco（Morgridge Institute for Research）进行细胞分类，Mathew Raymond（威斯康星州国家灵长类动物研究中心）提供了编辑帮助和细胞分类。这项工作得到了国家卫生研究所（R01 HL132891、RO1 HL142665、R24 OD021322和P51 OD011106）的资助。

本协议改编自先前的工作，Vodyanik等人，2006年；Uenishi等人，2014年；D'Souza等人，2016年Kumar等人，2019b；Park等人，2018b。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

工具书类

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