材料和试剂

24 - 孔板（Sarstedt的，目录号：83.1836）
Fisher Superfrost Plus显微镜载玻片（Fisher Scientific ，目录号：12-550-15）
记号笔超细点标记（Amazon.com ，ç atalog数：37001）
金封＃3317 22×50 mm＃1盖玻片（VWR ，目录号：48404-053）
纸巾盒（Fisher Scientific ，目录号：15-200-403E）
底模，15×15 mm，一次性（Fisher Scientific ，目录号：22-363-553）
巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20D）
金刚石玻璃刀（金刚石刀）（EMS，目录号：EMS 70038）
科普林染色缸（热，目录号：E94）
生物测定皿中，正方形245毫米（康宁，目录号：431111）
Whatman 1级圆形滤纸，直径18.5厘米（GE Health c are，目录号：1001185 ）
0.2 µm过滤器（Thermo ，目录号：565-0020）
Whatman 3 MM色谱纸，25平方厘米（Fisher ，目录号：05-716-6B）
显微镜载玻片盒（EMS ，目录号：71470-W）
NZM2328小鼠（产地烯丙基自Jackson 大号aboratories;目前保持在内部）
OCT化合物（Tissue-Tek OCT）（樱花，目录号：4583）
不含DAPI的Everbrite硬固安装介质（Biotium ，目录号：23003）
多克隆抗体山羊 Ab：
甲NTI小鼠去氧肾上腺素（R＆d系统，目录号：AF3159）
甲NTI小鼠整联α 8（ITGα 8 ）（R＆d系统，目录号：AF4076）
甲NTI小鼠CD31（R＆d系统，目录号：AF3628 ）
单克隆抗小鼠抗体：
R 在mAb处：Alexa Fluor（A）-488-抗小鼠ICAM-2 [ CD102，克隆3C4（MIC2 / 4）] （Biolegend ，目录号：105609）
大鼠mAb ：A-647-抗小鼠VCAM-1（CD106，克隆429 ）（Biolegend ，目录号：105712）
H amster mAb ：BV421抗小鼠ICAM-1（CD54克隆3E2 ）（BD，货号：564704）
R at mAb ：抗小鼠CD16 / CD32（克隆2.4G2 ）（Bio-X-Cell，目录号：BE-0307）
抗人类抗体
抗HLA-DR 单抗PL8是博杜邦博士（纪念斯隆-凯特琳癌症中心，NY）和礼品共轭与FL uorescein 硫氰酸（FITC）
藻红蛋白缀合的抗人CD13（WM15; BD Biosciences，目录号：555394 ）
羊抗人去氧肾上腺素（R＆d系统，Ç atalog号：AF4269）
单克隆抗体为升标记试剂盒安倍灵未缀合的Ab：
Alexa的福陆公司TM 488抗体标记试剂盒（Thermo Fisher，Invitrogen，目录号：A20181）
Alexa的福陆TM 555抗体标记试剂盒（Thermo Fisher， Invitrogen，货号：A2018 7 ）
的Alexa 氟TM 647抗体标记试剂盒（赛默飞世，Invitrogen，目录号：A20186）
太平洋蓝TM 抗体标记试剂盒（ Thermo Fisher，PacBlue ，目录号：P30013）
磷酸盐缓冲的福尔马林（10％; Fisher Scientific ，目录号：22-110-869）
DAPI（Sigma ，目录号：10236276001）
HCl（MP Biomedical，目录号：194697）
海卫一X-100（Sigma ，目录号：X100-500ML）
马血清（Gibco，目录号：16050）
鸡血清（Gibco，目录号16110-082）
HEPES（f ree acid ）（ICN，目录号：101926）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DME M ; Gibco ，目录号11965-092）
蔗糖（Sigma ，目录号：S0389）
氯胺酮（Ketaset ; Zoetis，目录号：EA2489-564，100 mg / ml）
赛拉嗪（AnaSed ; Akorn ，目录号：59399-110-20，NADA＃139-236，20 mg / ml）
肝素（Elkins-Sinn，目录号：6505-00-153-9740，1,000单位/ ml）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 · H 2 O）（贝克，目录号：3818-5）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 · 7H 2 O）（USB，目录号：20232）
NaCl（Fisher，目录号：S271-1）
KH 2 PO 4 （贝克，目录号：3246-5）
KCl （贝克，目录号：3040-05）
EDTA · H 2 O（贝克，目录号：4040-04）
盐酸赖氨酸（MP Biomedical，目录号：194697）
对甲醛（Fisher，目录号：04042-500）
间高碘酸钠（Sigma，目录号：S-1147）
不含Ca 2+ 和Mg 2+ （PBS）的Dulbecco磷酸盐缓冲液：用双蒸馏水（dd）H 2 O 稀释10×PBS（请参阅食谱）
磷酸钠缓冲液，1 M，pH 7.4（1 M磷酸盐缓冲液）（请参见配方）
磷酸钠缓冲液，0.375 M，pH 7.4 （参见配方）
10×PBS（请参阅食谱）
NaOH，10 N（请参阅食谱）
HEPES，1 M，pH 7.4（请参阅食谱）
EDTA，0.5 M，pH 8.0（请参见配方）
pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中的4％对甲醛
磷酸赖氨酸（参见食谱）
对甲醛-赖氨酸-高碘酸钠（2％PLP）（请参阅食谱）
在pH 7.4的50 mM磷酸盐缓冲液中的蔗糖（30％）（请参见食谱）
NaN 3 （10％）（请参阅食谱）
清洁剂组织提取液（请参见食谱）
组织阻塞解决方案（请参阅食谱）
麻醉混合（请参阅食谱）
DAPI库存和工作解决方案（请参阅食谱）

设备

1 L烧杯
1 L锥形瓶
搅拌棒
通风柜
水浴
解剖盘（Carolina Biological Supply，目录号：629005）
低温恒温器（Leica Biosystems，型号：Leica CM1850 UV ）
蔡司激光扫描共聚焦显微镜系统（卡尔·蔡司，型号：LSM 700）：
405 nm，488 nm，555 nm和639 nm激光激发离子线
EC计划-Neofluar 10×/ 0.3。M27 物镜
复消色差计划20×/ 0.8 M27 物镜
EC Plan- Neofluar 40×/ 1.30石油物镜
Plan-Apochroma t 63×/ 1.4油DIC M27物镜
Revco创世纪II -70 °C冰柜（Thermo Scienti fic，型号： ULT-2186-9-A）
恒压灌注组件，带有“马里奥特瓶”配置的储液器：
如图2A所示构造一个恒压储罐组件。它由60毫升注射器组成，注射器的入口由＃6橡胶塞和修剪过的5毫升吸管组成（图2B）。注射器储液罐通过1/8“内径硅胶管（Cole-Parmer，目录号：EW-95886-03）通过1/16”内径Luer 接头适配器（Cole-Parmer ，目录号：GH41507-62）连接并调节通过三通旋塞阀（Cole-Parmer ，目录号：30600-08）。排水出口由一个40”硅树脂管（3/32”的ID，Cole-Parmer公司，目录号：EW-96201-84 ），在一端具有16号针（修剪针尖）连接到路厄氏滑动三通阀的出口和另一端的鲁尔锁接头（Cole-Parmer ，目录号：GH41507-62）与21号蝶形真空阀（BD，目录号：367296）连接以进行灌注。修整真空吸尘器针头的针头护套以露出针头，并安装在针头上，以防止针头过度刺入（图2C）。的静水压力被设定在32” H 2 O.

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1402--2003103孙尚成491422 \ Figs jpg \ Fig2 .jpg

图2.鼠标灌注组件。灌注组件（A）由2个连接的60毫升马里奥特瓶配置注射器组成。针筒a in （B ）装有三通阀以调节流量。排水管出口与21 G真空容器连接。将针头护套切成一定大小以露出针尖（C），并留在原处以防止心脏过度穿透。用止血钳夹紧，阻止通过真空器的灌注。

软件

1。 ZEN 2.3 SP1 FP3（黑色）进行数据采集的64位程序（蔡司，可用此处）

2. ZEN Lite用于数据分析（Zeiss，可在此处获得）

3. Adobe Photoshop版本20.0.4 20190227.r.76 （在此处可用）

程序

小鼠组织的收集和固定
注意：由于本报告中使用的大多数抗体是单克隆抗体，因此，由抗体识别的单个表位通常会被苛刻的固定破坏。因此，使用了反应时间有限的温和固色方法。该固定方法还改善了多克隆抗体对组织的染色。

1. 分别用PBS和2％PLP 填充灌注组件中的容器a和b（图2B）。首先打开三通限位器，使2％的PLP流入真空容器，以排出气泡。切换阀位置以允许PBS冲洗灌注管线并停止2％PLP流动。确保清除所有气泡。用止血钳夹住真空管。

2. 注入ip 小鼠。用0.225 ml麻醉混合物（配方14）。等待3-5分钟，直到鼠标失去脚捏反射。引脚上的解剖托盘乙烯基夹层垫鼠标（图URE 2A;图URE 3 甲）

3. 手术过程示于图URE 3. 打开皮肤通过首先在腹部的后端在中线（图制作切口URE 3A）。将闭合的剪刀刀片插入皮肤下方，朝向胸腔的前端（图3B）。打开刀片（图3C ）并向后滑动，以使皮肤与腹壁和胸壁分离。

4. 沿中线切开皮肤（图3D ），并将皮肤固定在侧面，以保持肋骨保持裸露（图3E ）。

5. 用一把剪刀切开腹壁（图3F ）。将尖头的刀片插入开口处，并切开腹膜，使腹膜短。切开侧面以打开腹部。

6. 抬起隔膜处的肋骨，确定心脏的位置。用剪刀的尖头刀片朝心脏轻轻穿过隔膜，将空气释放到肋骨中。这将在胸腔中创造空间并促进切口，而不会损害心脏和肺部（图3G ）。

7. 沿中线切开肋骨直到喉部（图3H）。从侧面切除胸廓暴露心脏（图小号3I和3J ）。

8. 打开一把小剪刀的刀片，然后向下按压心脏以将右心房的伸出部分置于刀片之间（图3K）。切除心房段以创建灌注出口。

9. 用一对＃3镊子抓住心脏（图3L ），然后将真空容器的针头插入左心室的心尖（图3M ）。松开真空夹具，开始PBS冲洗。确保没有气泡排入心脏。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-7-5 \ 3663--2003103--1402 Sun-sang Sung 491422 \ Figs jpg \ Fig3 .jpg

图3.肾脏通过左心室灌注。该方法的详细信息在步骤A2-A9中进行了描述。

10. 用20 ml PBS冲洗后，转动阀门用20 ml 2％PLP冲洗。

11. 夹紧真空管。

12. 用＃3镊子在肾门上抓住胶囊，取下肾脏胶囊。用一把细剪刀小心地刺破胶囊。插入刀片并向上和向外推以移动胶囊。消费肾脏。用剃须刀切割1毫米的横切面。

注意：选择横断中线附近的中央肾脏切片，使每个切片中都包含皮质，髓质和乳头区域。将两个这样的肾脏切片固定在2％PLP中以进行免疫荧光染色，将两个切片固定在10％磷酸盐缓冲的福尔马林（Fisher）中以进行组织学染色。两个附加的片侧翼在每一侧的中心切片相结合，与所述2 中心件为2％PLP固定为增加肾小球评分。通常，将一个肾脏切成薄片进行免疫荧光和组织学染色，将另一个肾脏切成两半，在液氮中速冻并保存用于生化分析。

13. 将组织切片放入组织盒中，在冰上的2％PLP中固定3小时。

14. 除去对甲醛，并在蔗糖中平衡组织，以通过在PBS中洗涤组织两次，然后在4°C下浸泡在5％蔗糖中过夜来保存。

注意：通过将低百分比的蔗糖浸泡至少几个小时来除去对甲醛是至关重要的。残留的对甲醛会导致高背景，尤其是在较短的波长下。然后使用分级百分比的蔗糖溶液使组织中的蔗糖含量达到30％，以最大程度地减少冷冻过程中冰晶的形成，从而更好地保存组织结构并提取水以减少膨胀。避免长时间浸泡在30％的蔗糖中，因为高渗透压会使小管收缩。最后将组织短暂浸入OCT化合物的4个连续孔中，然后包埋以去除表面蔗糖，以便更容易在低温恒温器上切片。

15. 更换溶液并将组织在15％蔗糖中平衡2小时，然后在30％蔗糖中平衡3小时。

16. 浸组织切片在24 OCT的4个连续的孔简要- 孔板涂覆TIS 告片，用OCT彻底。沉浸在组织在OCT底模无线个切断面朝下。P RESS组织下来，对组织块的切片面。在干冰上冷冻。

17. 储存在-70°C的冰柜中。

组织染色
1. 切成5 µm的切片，放在Superfrost plus玻片上，每片2个切片。

2. 使用Sharpie标记笔在磨砂表面上滑动标签。

3. 用金刚石刀刻蚀载玻片下面，以包围组织，以方便在显微镜检查过程中进行组织定位。

4. 将载玻片放入Coplin 染色罐中，用PBS 洗涤2次，每次5分钟。

5. 添加去污剂提取介质，并在室温（RT）下孵育30分钟。

6. 用PBS 洗涤2 次，每次5分钟。

7. 在室温下用封闭溶液封闭非特异性结合2小时。

8. 使用2 µg / ml的每种Ab和最多4种分别用BV421，A-488，A-555和A-647荧光染料标记的Ab制备Ab混合物。在封闭介质中稀释抗体。

笔记：

可以使用DAPI进行核定位，而不是使用结合BV421的Ab（请参阅使用DAPI的食谱）。
避免使用次级抗体进行肾脏染色。若要直接用纯化的未结合的Ab染色，请使用供应商所述的Thermo Fisher（Invitrogen）mAb 标记试剂盒标记Ab 。
9. 用PBS 清洗玻片2 次，每次5分钟。用巴斯德吸管吸出组织切片周围的液体，并将载玻片放在24.5 cm×24.5 cm生物测定皿中，该皿底部衬有方形的＃3 Whatman滤纸。不要让肾脏组织变干。

10.用移液管吸取50 µl Ab混合液，并用移液管吸头将溶液摊开以覆盖组织的所有区域。

11. 在黑暗中于4°C孵育2小时至过夜。

12. 在Ab染色结束时，将其纵向垂直滑动，并在纸巾上轻拍以沥干染色溶液。

13. 放入PBS。洗4 次，每次5分钟。

14. 吸出液体，并在组织切片上滴一滴固定介质。将＃1 盖玻片放在顶部。倒置幻灯片并向下压纸巾以展开安装介质。

15. 放置在幻灯片框中。

影像撷取
1. 使用“智能设置”设置共聚焦显微镜。使用3条磁道激励捕获图像：磁道1，PacB1 ，A-647，T-PMT；音轨2，A-488；曲目3，A-555。其他设置为：图像尺寸1,024×1,024；扫描速度为7；扫描模式，帧平均2帧平均8位; 增益为750。其他参数为默认设置或通过“智能设置”自动设置。大多数图像是使用20倍物镜拍摄的。

注意：可以改变共聚焦显微镜的设置，以优化收集时间，分辨率和光漂白衰减。

2. 在定位模式下，使用10 倍物镜定位感兴趣的场并使用明场或单个红色或绿色荧光通道近似聚焦。

3. 切换到20 ×镜头。找到感兴趣和关注的领域。

4. 在“获取”模式下，将“扫描区域”设置为最大。打开一台激光器，然后关闭其他激光器。增加激光功率以实现图像可视化。单击“实时”以使用精细的聚焦旋钮设置焦点，并通过激光功率设置图像亮度。打开激光功率调节器中的“范围指示器”，以最小化水垢荧光。

5. 对所有设定的亮度通过在一个时间调节激光功率的一个色彩通道（见图URE 小号4A - 4C 以获得最佳曝光）。

6. 打开所有3台激光器，并用“实时”进行扫描，以确保最佳的色彩强度。

7. 使用“捕捉”捕获图像。

8. 以LSM或CZI格式保存图像。

9. 使用“尺寸”选项卡下的“裁剪”按钮放大捕获图像中的子区域或结构。

10. 使用Snap收集1个周期的图像捕获以进行亮度调整。使用“捕捉”收集最终裁剪的图像并保存。

共焦图像分析
1. 打开ZEN Lite blue的图像文件，可从Zeiss网站免费下载。

2. 使用直方图面板中的滑块调整每个通道的亮度和背景。避免超出标度一个在1.0 djustment并保持伽马（小号EE图URE 4为最佳设置）。

3. 为每个通道设置伪色。对于共聚焦图像，请将单色限制为红色，绿色和蓝色，以便于共定位。共定位颜色是：绿色和红色，黄色；绿色和蓝色，青色；红色和蓝色，洋红色；绿色，红色和蓝色，白色。

4. 在图像中放置比例尺。

5. 将单色和共焦图像导出为TIFF文件。

6. 使用Photoshop修剪图像，编辑合成图形和标签面板。

7. 使用LZW和ZIP分别保存合成图像以进行图像和图层压缩。

8. 合并图层，调整图像大小，并另存为TIFF文件以供发布。

C：\ Users \ Bio-Dandan \ Dropbox \ Refomatting \ 2020-7-5 \ 3663--2003103--1402 Sun-sang Sung 491422 \ Figs jpg \ Fig4 .jpg

图4. 在共焦图像中设置通道亮度。使用Zeiss Zen Lite软件中直方图面板中的滑块调节亮度和背景强度。亮度增加，直到红色区域，其指定超出标度的Intensi TY勉强显示（面板甲- Ç ）。刻度尺b 在面板AR ģ 等于10 μ 米。

数据分析

类似于图5的结果已在Sung 等人的图5中发表。（2017年）。

1. 在NZM2328狼疮易感小鼠非发炎的肾脏，通过抗CD31染色（图识别肾小球内皮细胞小号5A-A，B，d，蓝）表示ICAM-2（图小号5A-A，E，绿色），但小的ICAM-1（图小号5A-A，b，C，红色）。VCAM-1染色仅限于肾小球间质区域（图s 5A-b，f）。由肾素和整联蛋白α8 鉴定的足细胞和系膜细胞分别表达很少的ICAM-1和ICAM-2（未显示）。结果表明，在稳态中，PMN和单核细胞通过CD11b与肾小球内皮细胞的黏附在很大程度上取决于Mac-1 / ICAM-2，而不取决于Mac-1 / ICAM-1的相互作用。该结果还表明，β 1点整联蛋白如VLA-4（α 4 β 结合VCAM-1在播放在肾小球髓细胞粘附的作用可忽略不计1）。

2. 在用抗肾小球基小鼠膜诱导肾炎，在ICAM-1，ICAM-2和VCAM-1的定位来自对照小鼠的小变化被发现（图5B）。

3. 在来自未患病小鼠的患有慢性GN的NZM2328小鼠中，ICAM-1表达发生了显着变化（参见图s 5C，5A，a，b，c）。在患病的小鼠中，ICAM-1 高度表达并主要发生在肾小球。ICAM-1 与表达CD31的内皮细胞共定位（图5C，图a，b，c），而不是像对照小鼠那样位于肾小球周围（图5A，图a，b，c）。这种ICAM-1上调可能在慢性GN小鼠的肾小球巨噬细胞浸润中发挥重要作用（Sung 等人，2017，图5 ）。慢性GN（网络连接的小鼠的肾小球ICAM-2表达克URE 5C，小图A，E）是相似的的非患病小鼠（图5A，图A，E）。由于巨噬细胞的肾小球浸润与肾小球中的ICAM-1相关而不与ICAM-2的表达相关，因此很可能ICAM-2在cGN 中的巨噬细胞肾小球迁移中起着次要的或微不足道的作用。出于同样的原因，VCAM-1表达保持extraglomerular（图小号5C-B，F），指示VLA-4小的戏剧或巨噬细胞肾小球移民没有作用在小鼠中有严重GN。

D：\ Reformatting \ 2020-4-7 \ 1402--2003103孙尚成491422 \ Figs jpg \ Fig5 .jpg

图5. 肾小球细胞表达ICAM-1，ICAM-2和VCAM-1。将NZM2328小鼠的肾脏固定在2％PLP中，并用BV421-抗-ICAM-1，A-488-抗-ICAM-2，A-555-抗CD31和A-647-抗VCAM-1染色。显微照片在LSM700共聚焦显微镜上捕获。显示了同一字段的合并和单色通道。在图g中，显示了苏木精和eos 染色的肾小球。A.3个月大的对照小鼠未经治疗。B.用抗GBM肾毒性血清治疗3个月大的小鼠后的第8天。C. 7个月大的NZM小鼠，患有自发性慢性GN和重度e蛋白尿（用试纸检测3+）。在多个实验中的多只小鼠中发现了相似的结果。肾小球被包围。刻度尺b ARS = 10微米图b和20 μ 米在面板克。

配方小号

1. 磷酸钠缓冲液，1 M，pH 7.4（1 M磷酸盐缓冲液）

制成1 M磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 · H 2 O，137.99 g / L）和1 M磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4 · 7H 2 O，268.07 g / L）
混合190 ml 1 M NaH 2 PO 4 和810 ml 1 M Na 2 HPO 4
室温保存
注意：磷溶液不会变质。在冷藏条件下，可能会形成磷酸钠晶体。在37之间的水浴温热溶液℃和50 ℃至- [R edissolve 使用前晶体。或者，在微波炉中加热至约50 °C，不时混合以溶解晶体。

2. 磷酸钠缓冲液，0.375 M，pH 7.4

稀375毫升的每一个的的1M的NaH 2 PO 4 和1 2M的Na 2 HPO 4 （来自配方1）到1L d d ħ 2 O操作使0.375中号的NaH 2 PO 4 和0.375 2M的Na 2 HPO 4 分别
混合190 ml 0.375 M NaH 2 PO 4 和810 ml 0.375 M Na 2 HPO 4 以制成1 L 0.375 M磷酸钠缓冲液，pH 7.4
室温保存
3. 10×PBS

添加80克氯化钠，25.6克Na 2 HPO 4 · 7H 2 O，2.4克KH 2 PO 4 ，2 克的KCl 至800毫升DD ħ 2 O操作溶解
用dd H 2 O 制成1 L
在121 °C下以液体循环高压灭菌40分钟
存放在室温下。无菌稀释以保持原液无菌
4. NaOH，10 N

在搅拌下将dd 40 g NaOH加到90 ml dd H 2 O
冷却至100毫升
5. HEPES，1 M，pH 7.4

溶解23.8克HEPES（的˚F 在60ml REE酸）DD ħ 2 ö
用10 N NaOH滴定至pH 7.4
调至100 ml，并用0.2 µm过滤器（Thermo）消毒
储存在4°C
6. EDTA，0.5 M，pH 8.0

放置186.12 g EDTA二钠·在8 00 ml DD水中加入H 2 O ，并用10 N NaOH滴定至pH 8.0
添加dd H 2 O t o 1 L 并保存在RT中
7. 磷酸赖氨酸，0.375 M赖氨酸和0.1875 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4（5倍磷酸赖氨酸）

将68.48 g赖氨酸HCl溶于dd H 2 O中，最终溶解至500 ml
在装有0.375 M Na 2 HPO 4 （磷酸二氢钠）的1 L烧杯中滴定至pH 7.4
用pH 7.4的0.375 M磷酸钠缓冲液补足1 L
加入2 mM EDTA，pH 8.0进行保存
储存在4 °C
8. pH 7.4的0.1 M磷酸盐缓冲液中的4％对甲醛

称量20克对甲醛，并放入带有搅拌棒的1 L锥形瓶中
加入100 ml dd H 2 O，并在通风橱中加热至70°C
加入1滴10 N NaOH
解决办法是，用＃1 Whatman滤纸（Whatman）过滤
加入250 ml 0.2 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4
中号AKE体积达500毫升DD ħ 2 ö
储存在4°C，每2周变新鲜一次
9. 对甲醛-赖氨酸-高碘酸钠（2％PLP）

混合50 ml 4％对甲醛，20 ml 5x赖氨酸磷酸酯，30 ml dd H 2 O和0.2 g间高碘酸钠
旋转容器以溶解高碘酸钠
储存在冰上
注意：每次使用都准备新鲜。

10. 50 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4中的蔗糖（30％）

称取300 g蔗糖（Sigma）并放入带有搅拌器的1 L烧杯中
加入20 ml pH 7.4的1 M磷酸盐缓冲液，并用ddH 2 O 补足至950 ml 。如有必要，搅拌并温和加热
加入4 ml 0.5 M EDTA保存
使最终体积达到1 L
储存在4°C
用50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）稀释30％蔗糖溶液以制成5％和15％蔗糖溶液
11. 氮化钠3 （10％）

将10 g NaN 3 （Fisher）溶解在dd H 2 O中并补足至100 ml

12. 洗涤剂组织提取液

0.3％Ť 瑞通X-100

10％马血清

25 mM HE PES，pH 7.4

DME M中的0.1％叠氮化钠

储存在4°C

13. 组织封闭液

25 µg / ml抗小鼠CD16 / CD32 mAb

10％马血清

10％鸡血清

25 mM HEPES，pH 7.4

DME M中的0.1％NaN 3

储存在4°C

14. 麻醉混合物

1.4毫升氯胺酮（Ketaset ，Zoet 是100毫克/毫升）

0.7 ml 赛拉嗪（AnaSed ，NDC，Akorn ，20 mg / ml）

9毫升肝素（Elkins-Sinn，1,000单位/毫升）

15. DAPI库存和工作解决方案

准备在dd H 2 O中的25 mg / ml DAPI（25,000 × ）储备液，并分装10 µl
储存在-20°C
使用时，将dd H 2 O 的等分试样稀释至250 µl，以1 µg / ml（1,000×稀释度）
注意：稀释后的溶液可在每次使用时解冻和冷冻。

致谢

作者感谢Jessica Handy提供的技术帮助。该研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助U19-AI083024的部分支持。当前协议的缩写版本已在Sung 等人中发表。，2017年。

利益争夺

作者没有利益冲突。

伦理

遵循弗吉尼亚大学机构动物使用和护理委员会（Protocol＃2483; 1995-2020）批准的协议使用动物。人体组织是通过外科废弃组织的豁免协议从弗吉尼亚生物存储设施联合会获得的。

参考资料

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