材料和试剂

1. Falcon®试管（50毫升）*2（每个类似尺寸的型号都可以）

2. 2毫升Eppendorf®试管（每个类似版本都可以）

3. 米拉布（8 cm x 8 cm）（微孔，目录号：475855-1R）

4. 拟南芥Col-0，wildtype和shrk1 x shrk2[shrk1公司x shrk2产生多叶吸器的频率高于野生型（里德等人，2019年）]

5. 高功率放大器Noco2（Col-0对Hpa株Noco2敏感）

6. 尖头牙签（见图1）

7. 一张白纸（A5尺寸，ISO 216）

8. 几盆6.5厘米x 7厘米x 7厘米的土盆

9. 带透明盖的塑料托盘[38 cm x 24 cm x 18 cm（高度包括盖）]

注：我们用的那个已经不生产了。康奈克斯室内温室，FLOR79045，是一个类似的版本。园艺供应商提供的每一个类似大小的带透明盖子的盒子都应该是合适的。

10. 土壤（Stender GmbH，A210）

11. 肥料（WUXAL®Super 8-8-6）

12. 计数室（血细胞仪）（Marienfeld，目录号：0640110）

13. 喷雾瓶

注：化妆品商店提供的一个小（20-30毫升）喷雾瓶，可以产生喷雾/气溶胶适合接种。重要！在所有实验中使用相同的类型，并使用相同的距离和喷洒时间在每个实验中应用相似的孢子数。这对于在每个独立的生物重复中施加相似的感染压力可能是至关重要的。

14. 乙醇70%（用于灭菌，技术级乙醇即可）

15. 无菌水

16. 苯酚（Roth，目录号：0040.1，任何品牌都可以）

17. 乳酸（Roth，目录号：8460.1，任何品牌都可以）

18. 台盼蓝（Sigma，目录号：T6146，任何品牌都可以）

19. 35%（v/v）甘油/水（Roth，目录号：7530.4，任何品牌均可）

20. 0.01%台盼蓝溶液（见配方）

21. 水合氯醛饱和溶液（2.5g/ml，见配方）

设备

1. 小而尖的剪刀（Hammacher，HSB 544-09，任何类似的版本都应该适合剪下被感染的叶子）。

2. 漩涡（漩涡精灵2，功能相似的一个）

3. 生长室（粘合剂，型号：KBWF 720）

4. Eppendorf热混合器C（或其他品牌。任何带加热功能的温控Eppendorf®振动筛都可以）

5. VHX-6000数字显微镜（日本大阪凯恩斯）

注：使用VHX数字的优势显微镜是通过将x、y和z方向上的个别图片拼接在一起来记录大面积的样品s公司. 任何其他带有10倍物镜的明亮视野显微镜也适用于此项特殊任务，但可能不太舒适。

软件

1. 斐济（Schindelin等人，2012，https://imagej.net/斐济)

2. Cell counter（斐济软件的插件，Kurt De Vos，https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html)

程序

A、拟南芥的生长

1. 拟南芥幼苗的多叶吸器观察

a、收获种子后，将所有测试种子在4°C下隔夜分层。

注：分层可以使植物生长同步。

b、把你需要的种子撒在白纸上（一盆5-9粒）（图1A）。

c、将牙签的顶端浸入水中使其湿润（图1B）。

d、将5-9粒种子均匀地分布在一个6.5 cm x 7 x 7 cm的罐子中，罐子上有粘性的牙签尖，以便每次都能捡到一粒种子（图1C-1D）。

笔记：

一。不要在这个花盆里种超过12株植物。拥挤的花盆会导致不均匀的感染，因为重叠的叶子会互相覆盖。

二。不要用土覆盖种子！把种子直接放在土壤表面。

e、在22°C，16h光照（100mol/m2/s）/8h黑暗，60%相对湿度下生长2周。这些植物每周用1/1000稀释肥料浇水两次。图1F显示了在所示条件和盆栽大小下生长的2周龄植物。μ

图1。拟南芥生长和感染的过程。 A、把种子均匀地撒在白纸上。B、把牙签尖弄湿。C、用湿尖一次捡起一粒种子。D、把种子放在土壤表面。E、用食指捡起种子。F、 2周大的拟南芥。G、两周大的拟南芥的叶子上均匀地充满了水滴。比例尺=0.8 cm。H、 7dpi-Hpa感染拟南芥。箭头显示要收集的第一对树叶。比例尺=0.8 cm。s公司

2. 拟南芥Hpa育苗的研究

a、收获种子后，将所有测试种子在4°C下隔夜分层。

b、把你需要的种子撒在白纸上（一盆大约50-100粒种子）。

c、用食指把种子收集起来，像在食物上撒盐一样均匀地撒在土壤上（图1E）。

注意：不要用泥土覆盖种子！把种子直接放在土壤表面。

d、在22°C，16h光照（100μmol/m2/s）/8h黑暗，60%相对湿度下生长2周。

B、繁殖与保存高功率放大器

1. 高功率放大器传播

a、用70%乙醇消毒剪刀。

b、先用肥皂（洗涤剂）清洗塑料托盘和盖子，然后用70%乙醇清洗。在进一步使用前让它们干燥。

c、将步骤A2中准备好的锅放入塑料托盘中，并在每个托盘中加入250毫升消毒水，以保持湿度，以备后续步骤使用。

d、小心打开7 dpi Hpa感染植物的托盘，在Hpa感染的指定区域缓慢提起盖子。尽量减少植物周围的空气流动。

注：如果你是第一次在实验室感染Hpa，Hpa的来源可以是7 dpi拟南芥或供应商提供的冷冻材料（见步骤B2）。

e、将被孢子覆盖的受感染植物的地上部分（图2A）采集到50毫升的Falcon®试管中。

注：受感染的拟南芥幼苗应松散地放在试管中，以使孢子容易释放到灭菌水中（见Asai等人，2015年，图1B）。通常使用2-3整盆受感染的拟南芥。

f、在Falcon®试管中加入15毫升无菌水，以全速（3200转/分）旋转10秒。

g、用一层薄纱过滤悬浮液。

h、用计数室（血细胞仪）测定悬浮液中分生孢子的浓度。将浓度调整为105孢子/ml水。如果孢子不够，对其余材料重复步骤B1d-B1f。

i、用过滤后的悬浮液喷洒2周大的拟南芥，直到叶面均匀地充满水滴（图1G）。

j、用透明盖盖住塑料托盘，并用透明胶带密封开口，以保持高湿度（90%-100%）。

k、将受感染的植物在18°C、16h光照（80μmol/m2/s*、70μmol/m2/s透明盖下）的生长室内培养6或7天。

笔记：

答。*这是粘合剂室的实际测量值。植物生长在光照强度为100的步入式室内μmol/m2/s，但已在粘合剂室中进行培养。

乙。为了繁殖和收集新鲜的分生孢子，在拟南芥上应保持6-7天的Hpa。换言之，每6或7天感染一次。通常，Hpa在5dpi时开始孢子形成。6dpi或7dpi是孢子收集的较好时期。

2. 高功率放大器保存与再生

a、按照步骤B1a-B1e将受感染的植物收集到50毫升的Falcon®试管中。

b、将受感染的植物保存在-80°C下。

注：Hpa分生孢子可在此条件下保存至少1年或更长时间。

c、为了再生，从-80°c温度下取出保存好的感染叶片，将试管放在冰上10分钟。

d、 10分钟后，在Falcon®试管中加入15毫升无菌水，全速涡流10秒。

e、用一层薄纱过滤悬浮液。

f、用过滤后的悬浮液喷洒拟南芥（从步骤A2制备），直到叶表面均匀地充满液滴（图1G）。

注：由于冷冻分生孢子的活力较低，我们不调整（稀释）再生浓度。

C、接种和培养高功率放大器

1. 接种

a、将从步骤A1制备的不同基因型的拟南芥盆随机放置在托盘中。

b、按照步骤B1感染植物。

2. 孵化

将受感染的植物在18°C、16h光照（80μmol/m2/s，70μmol/m2/s，透明盖下）的生长室内培养/8h，直到收集日。

注：在这些条件下，拟南芥Col-0x Hpa-Noco2相互作用中，多叶吸器开始在5dpi上积累（图3）野生型和shrk1×shrk2突变体在感染后期（7dpi-8dpi）均达到较高比例。

D、植物组织染色观察病原菌

1. 从每株幼苗中采集一对受感染的第一对真叶（每个基因型5-8个生物学重复=5-8株）（图1H）。

注：对于其他卵菌科植物的病理系统，叶子的选择可能会有所不同。如果没有其他问题，选择最年轻的感染叶，因为它们通常是最小和最容易染色。

2. 将它们在台盼蓝溶液中培养3-10分钟，台盼蓝溶液在95°C的2毫升Eppendorf®试管中覆盖叶子，或直到组织完全吸收溶液并在室温下培养过夜。

笔记：

答。为避免烹调样品时台盼蓝的分裂，不要将超过1毫升的台盼蓝溶液放入2毫升Eppendorf®中。

乙。加热时间不要超过30分钟，否则组织将变得太软，无法继续进行下一步。但是，如果组织染色不够，室温过夜过程可以延长。将Eppendorf试管稍微转动一点，看看组织是否被台盼蓝浸透。准备好的组织应该是深蓝色（图2B）。

c。对于其他卵菌病理系统，加热并培养样品，直到组织完全吸收溶液。所需的培养时间可能随着叶片和细胞壁厚度的增加而增加。

3. 用饱和水合氯醛溶液代替溶液，过夜，直到组织看起来清晰为止（图2C）。

注意：如果组织还不清楚，用新鲜的等分液替换水合氯醛上清液，并孵化，直到组织变得清楚。

4. 用35%甘油代替水合氯醛。

注：样品可在35%甘油中长期保存（至少3个月）。

5. 将组织置于35%甘油的显微镜载玻片上，在Keyence VHX数字显微镜下进一步观察。使用盖玻片防止样品干燥。

图2。Hpa感染拟南芥和台盼蓝染色叶片。 A、未感染的模拟叶（左）和7dpi-Hpa感染的叶（右）。比例尺=2 mm。B、台盼蓝在去染色前染色。比例尺=1 mm。C、去染色的台盼蓝处理过的叶子。菌丝在显微镜下或肉眼都能清楚地看到。比例尺=1 mm。

图3。Col-0和shrk1 x shrk2叶中的Hpa吸器。用VHX数码显微镜，用1000x物镜从5dpi叶片上拍摄。星号表示多叶吸器。比例尺=25微米。

E、介绍用于感兴趣结构量化的Keyence VHX显微镜和ImageJ的Fiji插件

1. Keyence-VHX数字显微镜的应用

a、打开显微镜，按照软件的说明将样品对焦。

注意：对于下面显示的示例，我们使用丁用500倍物镜观察样品。

b、使用软件中的“缝合”功能获取包含较大区域的图片。

c、使用“缝合”窗口中的“XY长度”功能设置要在一张图片中包括它们的区域（图4，X方向1000μm，Y方向1000μm）。黄色的正方形也会显示区域显微镜这次会记录。

注：X方向1000μm和Y方向1000μm是建议的面积大小，适用于指示dpi处的拟南芥叶片。你可以根据生物系统的要求改变面积，但在同一个实验中要始终保持一个一致的大小。

图4。VHX数字显微镜软件中的拼接功能。黄色的方块向你展示了这一次显微镜将记录的区域。黄色方块中的图片显示了实时图像窗口显示的区域的位置。

d、从一片叶子上的5个不同且不重叠的区域拍照。

注意：使用缝合功能连续拍照。它会显示你刚刚拍摄的区域。本指南有助于避免样本之间的重叠（图5）。

图5。缝合功能有助于避免样本之间的重叠。黄色的正方形向我们展示了刚才的面积。该区域应排除在同一片叶子的额外缝合之外，以避免重叠样本。

2. Fiji插件对多叶圆形吸器的定量：细胞计数器

注：有关如何区分圆形吸器（“正常吸器”）和多叶吸器的指南，请参见：Ried等人，2019年，图2或本协议中由VHX数字显微镜拍摄的图像：图3。

a、使用Fiji包中的“cell counter”插件计算并记录吸器形状。

b、在斐济打开图片，点击图片窗口，然后启动“细胞计数器”插件。按“Initialize”激活要量化的图片（图6）。

图6。斐济包中的插件“cell counter”。初始化图片。比例尺=100μm。

c、在“计数器”处定义名称（上图6，圆形（正常）吸器；多叶吸器）。

d、只需在吸器旁边简单地单击即可标记它们。不同类型的吸器会被标记成不同的颜色（图7，正常吸器为蓝色，多叶吸器为红色）。

图7。使用插件“细胞计数器”标记吸器。只需单击要标记吸器的旁边，即可标记吸器。比例尺=100μm。

注意：请仅标记焦点所在的吸器。忽略那些形状难以判断的。

e、您可以通过点击“选项”（图8）来更改标签颜色。

图8。更改标签颜色。通过右键单击颜色，可以从选项窗口中选择大范围的标签颜色。比例尺=100μm。

f、从一张图片中选取2个或更多分支来计算多叶吸器的比例（图9）。一个生物重复（一片叶子）中至少有10个分枝。

g、可以使用“保存标记”功能保存标签。

图9。吸器的标签。 A、一幅画上的两个树枝。比例尺=100μm。B和C。两个分支的放大倍数。比例尺=50μm.D.吸器用不同颜色标记，绿色：正常吸器，洋红：多叶吸器。比例尺=50微米。

食谱

1. 0.01%台盼蓝溶液10毫升乳酸*10毫升甘油10克苯酚*10毫升无菌水10毫克台盼蓝

注意：在化学罩内小心处理标有星号的材料。台盼蓝对光敏感。溶液应贮存在棕色瓶中，至少可重复使用两次。

2. 水合氯醛溶液（2.5 g/ml）

将40毫升水加入100克水合氯醛的100毫升瓶中

注：100克水合氯醛几乎已经占据了100毫升瓶子的全部空间，因此，不要在100毫升瓶子中放入超过此量的水。

致谢

作者实验室最初建立的Hpa x拟南芥病理系统主要是基于Hpa基因型，并由简·帕克团队提供建议，同时还在诺维奇的塞恩斯伯里实验室工作。本协议中描述的步骤B1和D与Asai等人描述的步骤类似。（2015年）。程序A-D如Ried等人所述。（2019年）。国会议员承认德国科学院（DFG）和欧洲研究理事会（ERC）的资助。

相互竞争的利益

作者没有相互竞争的利益要申报。

工具书类

1. Asai，S.，Shirasu，K.和Jones，J.D.G.（2015年）。拟南芥霜霉病感染试验。生物协议5（20）：e1627。

2. Caillaud，M.C.，Wirthmueller，L.，Sklenar，J.，Findlay，K.，Piquerez，S.J.，Jones，A.M.，Robatzek，S.，Jones，J.D.和Faulkner，C.（2014年）。胞间连丝蛋白PDLP1在霜霉病感染期间定位于吸器相关膜并调节胼胝质沉积。公共科学图书馆病理学10（10）：e1004496。

3. Callan，B.和Carris，L.（2004）。真菌生物多样性：调查和监测方法。爱思唯尔公司，pp:113-114

4. Judelson，H.S.和Ah Fong，A.M.V.（2019年）。影响疾病的植物卵菌界面的交换。植物生理学179（4）：1198-1211。

5. Agrios，N.G.（2005年）。植物病理学。第五版。爱思唯尔公司，第427-433页。

6. Ried，M.K.，Banhara，A.和Hwu，F.Y.，Binder，A.，Gust，A.A.，Hófle，C.，Hückelhoven，R.，Nürnberger，T.，Parniske，M.（2019年）。一组拟南芥基因参与了霜霉病病原菌拟南芥的调节。公共科学图书馆病理学15（7）：e1007747。

7. Schindelin，J.，Arganda Carreras，I.，Frise，E.，Kaynig，V.，Longair，M.，Pietzsch，T.，Preibisch，S.，Rueden，C.，Saalfeld，S.，Schmid，B.，Tinevez，J.Y.，White，D.J.，Hartenstein，V.，Eliceri，K.，Tomancak，P.和Cardona，A.（2012年）。斐济：一个开放源码的生物图像分析平台。Nat方法9（7）：676-682。

8. Wang，W.，Wen，Y.，Berkey，R.和Xiao，S.（2009年）。拟南芥抗性蛋白RPW8.2特异性靶向真菌吸器周围的界面膜，使其具有广谱抗白粉病能力。植物细胞21（9）：2898-2913。