材料和试剂

注：材料和试剂可从不同的供应商购买。在这里，我们展示了一个列表，其中列出了我们用来开发该方案的所有试剂和材料。

材料

1. 吸管头（例如，VWR，目录号：613-0340、613-0360、613-1068）

2. PCR微管（例如，Sarstedt，目录号：72.737）

3. 1.5毫升微管（Deltalab，目录号：200400P）

4. 50ml离心管（康宁，目录号：352070）

5. 刻度吸管10毫升（品牌，目录号：27011）

6. 培养皿（Thermo Scientific，目录号：11309283）

7. 显微镜载玻片（例如，VWR，目录号：630-2099）

8. 封面幻灯片（例如，VWR，目录号：631-0125）

9. 0.4cm电穿孔反应杯（Bio-Rad，目录号：1652088）

10. 注射器50毫升（Omnifix，目录号：4616502F）

11. 带0.45μm醋酸纤维素膜的无菌注射器过滤器（VWR，目录号：28145-481）

12. 滤纸

试剂

1. PCR引物（试管），脱盐，标准25-50 nmol标度

2. 大肠杆菌DH5型α（赛默飞世尔科学公司，目录号：18265017）

3. 一水葡萄糖（Acros有机物，目录号：450740050）

4. D（+）-蔗糖（PanReac AppliChem，目录号：131621.1211）

5. 蛋白胨（康达拉布，目录号：1616.05）

6. 胰蛋白胨（Condalab，目录号：1612.05）

7. 酵母抽提物（康达拉布，目录号：1702.05）

8. 麦芽提取物（VWRJ873-500G）

9. 肌醇99%（Sigma-Aldrich，CAS编号：87-89-8）

10. 大豆油（圣克鲁斯生物技术公司，目录号：8001-22-7）

11. 玉米浆（Sigma-Aldrich，中国科学院编号：66071-94-1）

12. 欧洲细菌学琼脂（Condalab，目录号：1800.05）

13. Tris碱（Fisher生物制剂，目录号：BP152-500）

14. 硼酸（PanReac AppliChem，目录号：131015）

15. 乙二胺四乙酸二钠盐（PANRAC AppliChem，目录号：131669）

16. 六水氯化镁·

17. 氯化钠（NaCl）（PanReac AppliChem，目录号：131659.1214）

18. 磷酸二氢钾（KH2PO4）（费希尔生物制剂，化学文摘社编号：7778-77-0）

19. 磷酸二氢钾（K2HPO4）（费希尔生物制剂，化学文摘社编号：7758-11-4）

20. 无水碳酸钠（Na2CO3）（PANRAC AppliChem，目录号：131648.1211）

21. 碳酸氢钠（NaHCO3）（PANRAC AppliChem，目录号：141638.1210）

22. Triton X-100（Acros有机物，目录号：215680010）

23. DTT（二硫苏糖醇）（热科学，目录号：R0861）

24. 聚乙烯吡咯烷酮

25. 吐温20（PanReac AppliChem，目录号：142312.1611）

26. 牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，CAS编号：9048-46-8）

27. G-418二磺酸（西格玛·奥尔德里奇，化学文摘社编号：108321-42-2）

28. 硫酸卡那霉素

29. 氨苄西林钠盐

30. 发酵酶，20T（Nacalai Tesque，目录号：07663-91）

31. FavorPrep质粒提取小试剂盒（Favorgen，目录号：FADPE 300）

32. DreamTaq Green PCR Master Mix（2x）（赛默飞世尔科技，目录号：K1082）

33. 红安核酸染色液（内含子生物技术，目录号：21141）

34. 琼脂糖D1低EEO（Condalab，目录号：8010.01）

35. LB培养基（见配方）

36. MA2培养基（见配方）

37. SPA介质（见配方）

38. STM缓冲区（见配方）

39. 20倍（见配方）

40. DNA提取缓冲液（见配方）

41. 转换缓冲区（参见配方）

42. 磷酸钾缓冲液（见配方）

设备

1. 移液管P2、P20、P200和P1000（例如Gilson、PIPETMAN ClassicTM、产品编号：F144801、F144056M、F144058M、F144059M）

2. 电动吸管填充器（例如，Eppendorf，目录号：443000018）

3. 森蒂诺磁过滤漏斗（Pall，目录号：4273）

4. 无菌玻璃手柄或玻璃珠

5. Erlenmeyer烧瓶500毫升（VWR，目录号：10536-926）

6. 过滤瓶250 ml（Simax，目录号：PJH006）

7. 基因脉冲发生器（Bio-Rad，型号：微脉冲发生器）

8. 加热块（例如，Eppendorf，目录号：5355 000.011）

9. 热循环器（例如Bio-Rad，产品目录号：170-6700）

10. 微型离心机（例如，Thermo Scientific，产品目录号：10236249）

11. 离心机（如Eppendorf，产品目录号：5703000010，型号：5702R）

12. 电源（VWR，目录号：700-0115，型号：250V）

13. Gel Doc EZ系统（Bio-Rad，产品目录号：1708270）

14. 光学显微镜

15. 真空泵

16. 微流垂直层流工作站

17. 28 摄氏度我导管

18. 振动培养箱28°C

19. 高压灭菌器

软件

1. 图像labTM软件6.0.1。（Bio-Rad，目录号：1709690）

程序

以下协议可分为三个不同的部分（工作流示意图见图2）：

•CRISPR/Cas9质粒的分离。CRISPR/Cas9质粒的设计和组装先前已在Jiménez，2019中描述过。合成gRNA-dDNA的示意设计见图3A。等。

•转变。在这一节中，我们提供了一个详细的棉籽蛋白转化方法。棉蚜

•分离和筛选工程化的同核菌株。阳性克隆的筛选方法取决于相应基因组版本产生的表型。颜色菌丝体等表型可通过视觉观察直接观察（Jiménez等人，2019年）。或者，基因组版本可以通过分析性PCR（关于典型的三引物PCR策略，参见图3B）对每个修饰使用相应的引物对进行确认（Jiménez等人，2019）。

图2。棉花CRISPR/Cas9基因版的工作流程

图3。CRISPR/Cas9设计与分析。A、合成gRNA-dDNA的方案设计。B、分析性三引物PCR策略。

注：在层流无菌环境下进行微生物培养的所有步骤。

A、从大肠杆菌中分离CRISPR/Cas9质粒

1. 将携带CRISPR/Cas9质粒的相应大肠杆菌接种于4 ml LB加50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素中。

2. 在37℃的摇瓶培养箱中培养过夜。

3. 收集细胞，使用FavorPrep质粒提取小试剂盒提取质粒DNA。

B、转变棉蚜

注意：严格在冰上执行步骤B8至B20。

1. 在装有100毫升液体MA2培养基的烧瓶中接种750微升棉蚜目标菌株的孢子（约108个孢子）。

注：计数室如Neubauer/Thoma可用于计算孢子数。

2. 在28℃下以180转/分的速度培养10-12小时。

3. 之后，在显微镜下检查孢子的状态。孢子必须处于一种被称为“细菌”的萌发状态才能获得最佳转化效率（图4A）（Jiménez等人，2005）。

4. 用无菌纸过滤器真空过滤收集孢子。

注：使用高压灭菌器消毒sentino磁性过滤漏斗。

5. 准备转换缓冲区（请参阅配方）。

6. 介绍了一种利用转化缓冲液对孢子进行管内过滤，并用倒置法对孢子进行再培养的方法。

注意：在重新消耗孢子后，请移除纸过滤器。

7. 用孢子悬浮液在28℃下孵育试管30分钟，以180转/分搅拌。

注：在冰上预冷液体MA2介质、STM缓冲液、电穿孔反应杯和Eppendorf管。

8. 在3000 x g、4℃下离心10分钟。

9. 小心地丢弃上清液，不要使孢子再散开。

10. 用20毫升冰冻STM缓冲液轻轻清洗孢子。

11. 重复步骤B8-B10。

12. 在3000 x g、4℃下离心10分钟。

13. 在2毫升冷STM缓冲液中重新培养孢子，并在Eppendorf试管中等分孢子。

14. 在17000 x g、4°C下离心1分钟。

15. 弃去上清液，用冷冻STM缓冲液将孢子重新培养至400微升的最终体积。

16. 将190微升孢子悬浮液和5-10微克DNA（约15-20微升）混合在电穿孔反应杯中。

笔记：

答。用切好的吸管头避免孢子悬浮液堵塞.

乙。对于阴性对照，用相同体积的水代替DNA。

17. 在基因脉冲发生器中使用以下设置：1500 V、200 W和25 mF。

18. 脉冲混合物和立即添加1毫升冰冷的MA2培养基，以恢复孢子。把孢子转移到一个新的Eppendorf。

19. 在17000 x g、4°C下离心1分钟。

20. 丢弃1毫升上清液，并将200微升孢子置于MA2琼脂板上。

注意：用无菌玻璃柄将孢子盘化。

21. 28℃孵育6h，孢子再生。

22. 在这段时间之后，转换板必须被含有G418的上层琼脂糖层覆盖。加入6毫升0.4%琼脂糖，先前在95℃下融化并冷却至42℃，在50微克/毫升（原料浓度）下加入200微升G418。

23. 将培养板在28℃下培养2天。

C、原代异核生物转化子的分离与筛选

1. 用新鲜的MA2-G418板从转化板上分离出抗G418的杂核克隆（图4B和4C）。将异核转化子在28℃下培养2天。

图4。A、棉型病菌和转化株。 A、棉球病菌的显微照片。B、转换板。C、分离的异核转化子。

2. 提取基因组DNA用于异核克隆的PCR分析：

a、制备DNA提取缓冲液（配方6）。

b、从分离的抗G418的异核克隆中提取约2平方毫米的菌丝体，放入20微升的DNA提取缓冲液中。

c、在100℃下孵育10分钟。

d、在17000 x g下离心2分钟。

e、保持上清液在4°C下进行分析PCR。小球可以丢弃。

笔记：

答。对每个原代异核生物转化子进行反应。

乙。如有可能，应遵循三引物PCR（TP-PCR）策略（图3B）（Jiménez等人，2019年）：设计一对引物，用于在编辑和未编辑的细胞核/基因组/DNA中扩增同一区域。另外，设计一个第三个引物，专门与编辑好的基因组模板对齐，用于扩增编辑好的扩增子。

3. 分析PCR。

a、使用PCR微管设置以下反应：

15微升DreamTaq绿色PCR主混合物（2倍）

每个PCR引物1微升（10微米）

1微升DNA提取上清液（50-100 ng/微升）

高达30微升的双氧水

b、在热循环器中设置以下条件：

在95℃下变性3分钟

35周期：

变性：95℃30秒。

退火：50-65°C（调整至底漆Tm）30秒。

延伸率：72°C，持续1分钟（调整至放大管长度1 kb/min）。

72°C下的最终延伸步骤，持续10分钟。

储存于4°C。

4. 用红安（0.5微克/毫升）进行0.8%琼脂糖凝胶电泳。

a、使用5微升的PCR产物。

b、从TBE 20x缓冲液（配方5）中制备TBE 1x缓冲液。

c、将琼脂糖凝胶暴露在紫外线透照仪下（例如，gel Doc EZ系统、Bio-Rad）。

D、原代异核菌阳性转化子的产孢

注：棉铃虫菌丝体为多核细胞，沿菌丝间隔排列。每个合胞体中只有有限数量的细胞核是转化DNA的受体。原代异核生物转化子的产孢是分离来源于无核孢子的同核克隆的必要步骤。

1. 将阳性G418抗性克隆的菌丝体铺在缺乏G418的SPA平板上，在28℃下培养2天。这一步骤促进了CRISPR/Cas9质粒的丢失，因为棉铃虫的上位性质粒并不完全稳定。

2. 在SPA培养基上放置两天后，在显微镜下确认孢子的存在。

3. 制备1 mg/ml发酵酶-20T缓冲液分离孢子。通过0.45μm过滤器过滤消毒。

4. 收集1平方厘米的菌丝体，用1毫升1毫克/毫升的酶解缓冲液转移到一个Eppendorf试管中。

5. 在37°C下孵育50分钟，以850转/分的速度缓慢搅拌。

6. 之后，在显微镜下检查菌丝体的分解情况。

7. 在17000 x g下离心2分钟。

8. 用移液管小心地丢弃上清液，并用1毫升0.03%Triton X-100清洗孢子。

9. 重复步骤D7和D8。

10. 在17000 x g下离心2分钟。

11. 丢弃上清液，用1毫升MA2重新培养孢子。

12. 最后，对孢子悬浮液进行适当稀释，并将约102个孢子置于缺少G418的MA2固体培养基上。

注意：使用无菌玻璃手柄进行电镀。

13. 在28℃下培养2天。

E、同核转化子的分离和筛选：

1. 用缺乏G418的新鲜MA2板分离同核克隆。将同核转化子在28℃孵育2天。使用MA2平板加G418确认CRISPR/Cas9质粒的丢失。

2. 重复步骤C2、C3和C4，以验证基因组中是否存在设计突变。

3. 用合适的引物对扩增子进行测序，以进一步确认是否存在所需的基因组版本。

数据分析

编辑效率估计为含有编辑细胞核的原代异核生物转化子的频率。为了计算编辑效率，通常需要分析10-30个杂核转化子。平均而言，使用不同的sgRNA-dDNA组合可获得60%的效率。

食谱

1. 磅中等

1%胰蛋白胨

0.5%酵母抽提物

1%氯化钠

1.5%琼脂（固体培养基）

完全溶于蒸馏水，高压灭菌。

笔记：

答。调节pH to 7.2高压灭菌前。

乙。高压灭菌后，加入50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升氨苄西林作为选择性培养基。

2. MA2培养基

2%葡萄糖

2%蛋白胨

0.2%酵母抽提物

0.06%肌醇

2%琼脂（固体培养基）

完全溶于蒸馏水，高压灭菌

笔记：

答。将固体介质的pH值调整到6.8。

乙。高压灭菌后，添加200微克/毫升G418作为选择性介质。

3. SPA介质

2%玉米浆

1%葡萄糖

0.3%大豆油

0.3%酵母抽提物

0.3%麦芽提取物

4%琼脂（用于固体培养基）

完全溶于蒸馏水，高压灭菌

笔记：

答。调节pH值固体介质为6.8。

乙。高压灭菌后，添加200微克/毫升G418作为选择性介质。

4. STM缓冲区

270毫米蔗糖

10毫米Tris碱pH 7.5

1毫米氯化镁

完全溶于蒸馏水，高压灭菌

5. 缓冲液（20倍最终浓度）

90毫米Tris底座

90mm硼酸

2毫米EDTA

完全溶解，高压灭菌

6. 提取缓冲液

2%PVP 40

0.2%牛血清白蛋白

20之间0.05米

0.05 M碳酸钠缓冲液，pH 9.6

注：对于碳酸钠bu当pH值为9.6时，在9.36毫升蒸馏水中加入0.45毫升溶液A和0.182毫升溶液B。

溶液A=碳酸氢钠（NaHCO3）0.1 M（在10 ml dH2O中添加0.84 g）。

溶液B=无水碳酸钠（Na2CO3）0.1 M（在10 ml dH2O中添加1.06 g）。

将DNA提取缓冲液储存在-20摄氏度.

7. 转换缓冲区

0.5毫升DTT 1米

1毫升磷酸钾缓冲液（见下文）

18.5毫升蒸馏水

通过0.45μm过滤器过滤进行混合和消毒

注：为每个转化菌株准备20毫升转化缓冲液。

8. 磷酸钾缓冲液

a、将一元磷酸钾（KH2PO4）1 M与二元磷酸钾（K2HPO4）1 M等体积混合

b、将pH值调整到7.0

c、高压灭菌

致谢

这项工作由西班牙经济与竞争部（BIO2017-88435-R）和卡斯蒂利亚-莱昂军政府（SA016P17）向JLR和AJ提供的赠款资助。GM-F是西班牙经济竞争部10月前的FPI合同的接受者。我们感谢玛莉亚·多洛雷斯·桑切斯和西尔维娅·多明格斯提供的出色技术帮助。

该方案源自以下原始研究论文（Jiménez等人，2019年）。

相互竞争的利益

提交人声明没有财务或商业利益冲突。

工具书类

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3. Horvath，P.和Barrangou，R.（2010年）。CRISPR/Cas，细菌和古细菌的免疫系统。科学327（5962）：167-170。

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