材料和试剂

1.5米升Ç entrifuge管（赛默飞世尔科技，产品目录号：05-408-129）
K 30 MWCO Ce Ntricon 过滤器（MilliporeSigma ，目录号：UFC903008）
生物素化抗Bw6（Thermo Fisher Scientific，One Lambda Inc.，目录号：BiH0038，商店4 °C）
生物素化抗Bw4（Thermo Fisher Scientific，One Lambda Inc.，目录号：BiH0007，在4 °C下储存）。
使用蛋白G色谱柱（GE Lifesciences，目录号：17040401，在4 °C下于20％乙醇中储存）从杂交瘤细胞系ATCC HB-95的纯化或腹水中纯化的W6 / 32 （Springer，2001 ）从商业来源（例如，Bio X Cell，目录号：BE0079）
EZ-Link NHS-PEG 4- 生物素（Thermo Fisher Scientific，目录号21330，储存在-20 °C ）
Labscreen 单一抗原HLA-I类组合磁珠悬浮液阵列，包含来自单个细胞系的97个常见的HLA -A，-B和-C结合磁珠，一个阳性对照磁珠样品和一个阴性对照磁珠样品，每个磁珠的特征在于基于荧光强度读数（赛默飞世尔科技，一个拉姆达公司，Labscreen ® ，目录号：类-I-LS1A04NC，储存在4 ℃下）。
注意：对于基于流式细胞仪的实验，请使用FlowPRA 单一抗原珠子，该珠子总共包含32个珠子（8个HLA-1和一个阴性对照珠子样品，分为4组，其中9个珠子用不同量的荧光团标记，可在可以使用流式细胞仪的PE通道），并在需要时补充其他试剂盒（Thermo Fisher Scientific，One Lambda Inc.，目录号：FL1HD在4 °C下储存）。

10X LabScreen 洗涤缓冲液（赛默飞世尔科技，一个拉姆达公司，Labscreen ® ，目录号：LSPWABUF，在-65商店℃，或降低直至打开，然后在4存储 下长达三个月）
PE缀合的链亲和素（赛默飞世尔科技公司，一个拉姆达公司，Labscreen ® ，目录号：LT-SAPE，储存在4 ℃下）
FITC共轭链霉亲和素（Biolegend ，目录号：405201，储存在4 °C ）
1 x PBS缓冲液（Life Technologies Corporation，Gibco，目录号：10010-023）

设备

至2 0.2 Myu L 移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：FBE00002）
至20 2 Myu L 移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：FBE00020）
至200 20 Myu L 移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：FBE00200）
至110 ，000 MYU 大号移液器（赛默飞世尔科技，产品目录号：FBE01000）
Eppendorf 离心机5425 （VWR ，目录号：5405000441 ）。
Eppendorf 离心机5810R （VWR ，目录号：022628187）
LabScan 100流动分析仪（Luminex公司，Luminex分析仪，Luminex 100/200 System ）或流式细胞仪，例如BD LSRFortessa （Becton，Dickinson and Company，流式细胞仪，LSRFortessa ）

软件

HLA融合软件（Thermo Fisher Scientific Inc.，One Lambda Inc. ，https ：//www.onelambda.com/en/product/hla-fusion.html ）的FlowJo或（碧迪公司，用Flowjo ，Https://Www.Flowjo.Com）

程序

W6 / 32的生物素化
W6 / 32的缓冲液交换（通过在centricon 过滤器中进行渗析）到PBS缓冲液中。
注意：W6 / 32可以纯化形式购买，也可以从杂交瘤细胞系（ATCC，HB-95）衍生的腹水或细胞上清液中纯化。

在即将使用之前，将170μl 超纯水添加到2 mg NHS-PEG 4- 生物素中以制备20 mM储备液。
添加13 微升的NHS-PEG的4 -生物素溶液至1毫升纯化W6 / 32在2毫克/毫升。
在冰上或在4 °C下孵育反应2小时。
使用15 M L 30 K MWCO Centricon 过滤器进行广泛的透析（将6-10轮稀释至最大体积，然后浓缩至最小指定体积），不去除N反应的NHS-PEG 4- 生物素。
将抗体储存在4 °C下。

试剂小号等行动
用蒸馏水将10x洗涤缓冲液稀释至1x。
轻轻混匀Labscreen 单个抗原HLA类- 我结合珠阵列悬浮液。

样品制备
注：˚F Ollow程序作为DESCR IBED通过OneLambda 包插入。

混合20 微升生物素化的抗BW4的，生物素化抗BW6，或生物素化在多个稀释范围从1/50到内部（W6 / 32例制备的原液浓度纯化生物素化的抗体的1/200 W6 / 32; 2毫克/毫升）或通过商业来源（用5抗BW4和抗BW6）微升Labscreen 单个抗原HLA I类结合珠阵列悬浮液。
在室温下孵育30分钟。
加入1毫升1x洗涤缓冲液，轻轻混合。
将离心管在9,300 xg下离心2分钟。
吸取样品丢弃吸引物。
重复步骤C3-C5两次。
直接从试管中用1：100链霉亲和素-PE重悬珠（用1x洗涤缓冲液制成）。
在室温下孵育30分钟。
重复步骤C3-C5两次。
用80重悬珠子微升1×洗涤缓冲液（前进到步骤d或储存在4 ℃下长达24小时）。

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1.图Labscreen 单一抗原免疫亲和方案Labscreen 单一抗原HLA I类混合珠（每个均标有可识别的荧光染料和HLA-I）悬浮阵列已与生物素化抗体连续孵育，洗涤，与链霉亲和素-PE孵育，洗涤和最终在Labscreen 流量分析仪上进行了测量。

数据一收购LABSCAN
注：˚F Ollow程序作为DESCR IBED通过OneLambda 包插入。

需要获取模板，可从OneLambda 网站https://www.onelambda.com/en/product/labscan.html下载。
为要运行的样本创建一个文件名。
确认模板设置。
样品体积50 微升

采样超时80秒

双鉴频器下限8,000

双鉴频器上限16,000

珠子的编号和ID

每个磁珠收集的最小事件数为100

输入样品编号。
将板装到平台上。
单击开始按钮启动。
将数据输出保存为.csv文件并导出。
打开Fusion OL软件。
选择适当的输出.csv文件。
选择适当的目录ID文件。
选择阴性对照。
单击导入，然后分析每个样本。

替代方法：流式细胞仪
分析也将使用上执行流式细胞仪FlowPRA 单抗原珠代替邻˚F Labscreen 单抗原HLA I类组合球阵列悬浮液。

试剂设置
用蒸馏水将10x洗涤缓冲液稀释至1x。
轻轻混合FlowPRA 单一抗原微珠。
样品制备（遵循OneLambda 数据包插入所述的步骤）
混合20 微升生物素化的抗BW4的，生物素化抗BW6，或在多个稀释液（未稀释，1:25，1:50和1：100）的生物素化W6 / 32，用5 微升FlowPRA 单抗原珠子为每个组和抗体分别。
注意：可以使用荧光标记的抗体代替生物素化抗体。

在室温下孵育30分钟。
加入1毫升1x洗涤缓冲液，轻轻混合。
以9,000 xg离心2分钟。
吸取样品丢弃吸引物。
重复步骤E2c至E2e两次。
用1：200 st reptavidin-FITC（用1x洗涤缓冲液制成）重悬珠。
在室温下孵育30分钟。
重复步骤E2c至E2e两次。
重悬珠子用100 微升1×洗涤缓冲液（转移到步骤E3或储存在4 ℃下固定样品后长达24小时）。
使用具有至少两个通道（PE通道和FITC通道）的流式细胞仪获取每组的测量值。
注意：采集方法取决于所使用的流式细胞仪。

每个珠子群体上的门（如分组插入中所述，组中每个HLA-I-珠子的已知PE通道荧光强度）。
链霉亲和素-FITC几何平均荧光强度的测量直方图。

数据分析

遵循如由过程OneLambda 用于Luminex公司分组插入LABSCAN .Briefly ，数据也进行同样的分析，以流式细胞仪分析，其中的每个池HLA-I珠具有多种HLA-I-珠缀合物，其中的每一个被唯一地识别基于珠的荧光强度（Luminex xMAP 技术，图1 ）。通过首先校正与阴性对照珠（作为Labscreen 的组成部分）的非特异性抗体结合来评估抗体的相对结合（PE信号）单一抗原HLA I类组合磁珠悬浮液阵列（图2中的示例结果）。

在流式细胞仪上收集FlowPRA 单抗原珠结合数据，其中根据PE通道中不同的荧光强度（如图3所示）识别单个HLA-1珠，并在FITC通道中识别配体。与上述方案类似，相对配体信号（FITC）用阴性对照珠粒（图3，珠粒8，深青色）以及同种型对照进行校正.FlowPRA 必须对此实验进行补偿。单个抗原珠子分为四个组（涵盖常见的HLA-A和HLA-B同种型）。要筛选更广泛的HLA-1，必须包括其他珠子组。

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图2. Labscreen 单一抗原免疫亲和力样品数据显示了结合指定的HLA-W6 / 32（泛型抗HLA I类抗体[ Barnstable 等，1978和Raghavan 等，2019 ] ）的代表性数据。我珠子

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FIGUR C 3. FlowPRA 单抗原珠的样本数据。FlowPRA 单抗原珠来作为四组，每组包含8个HLA-I珠和阴性对照珠（无HLA-I标记8和颜色埃德蒂尔在散点图）是反复孵育和洗涤磁珠：生物素化抗体，缓冲液，链霉亲和素-FITC，缓冲液，然后在流式细胞仪上进行测量。点图来自代表性实验，其中同种型对照IgG2a （左图）或W6 / 32（右图）与FlowPRA 第1组单抗原珠子一起收集。

可以通过获取结合某些HLA-1分子的抗Bw4或抗Bw6的背景校正值来执行其他归一化方法（Yarzabek et al。，2018），并将信号计算为相对于W6 / 32的比率信号，一种已知可结合所有HLA-1变体的抗体（Raghavan 等人，2019）（图2）。这种放射线测定方法可解决Labscreen Single Antigen HLA I类组合磁珠悬浮液阵列上HLA-1水平的潜在变化。。

致谢

作者承认NIH赠款（R01 AI044115（MR），R21 AI126054（MR），T32 AI007528（用于支持AZ），T32 AI007413（用于支持AZ）），该协议是根据先前的工作改编而成的，请参见Yarzabek 等。（2018 ）下方。

利益争夺

作者没有任何竞争利益。

参考文献

Barnstable，CJ，Bodmer ，WF，Brown，G.，Galfre ，G。，Milstein，C.，Williams，AF和Ziegler，A.（1978）。生产A组红细胞，HLA和其他人类细胞表面的单克隆抗体抗原-遗传分析的新工具，细胞14（1）：9-20。
Beltran-Garcia，WF，H O Lzemer ，A.，Martrus ，G.，Chung，AW，Pacheco，Y.，Simoneau ，CR，Rucevic ，M.，Lamothe-Molina，PA，Pertel ，T.，Kim，TE ，Dugan，H.，Alter，G.，Dechanet-Merville ，J.，Jost ，S.，Carrington，M。和Altfeld ，M。（2016）。HLA -F的开放构象异构体是活化的高亲和力配体。 NK细胞受体KIR3DS1。Nat Immunol 17（9）：1067-1074。
Ilca ，FT，Drexhage ，LZ，Brewin，G.，Peacock，S。和Boyle，LH（2019）.HLA I类分子中的明显多态性决定了其对TAPBPR进行肽编辑的敏感性.Cell Rep 29（6）：1621- 1632.e1623。
Lachmann ，N。，Todorova，K.，Schulze，H.，andSchönemann ，C。（2013）。的Luminex ® 和它的应用为实体器官移植，hemoatopoteic 干细胞移植，和输血。 Transfus 医学Hemother 40（3）：182-189。
M Events Discounts Forum Login Register Ller，CA，Engler-Blum，G.，Gekeler ，V.，Steiert ，I.，Weiss，E. and Schmidt，H.（1989）。超典型HLA-B基因座特异性Bw4和的遗传和血清学异质性。BW6免疫遗传学30（3）：200-207。
Raghavan，M.，Yarzabek ，B。，Zaitouna，AJ，Krishnakumar，S.和Ramon，DS（2019）。测量HLA I类同种异型表达水平和半衰期的策略。Hum Immunol 80（4）： 221-227。
Springer，TA （2001 ）。免疫亲和色谱。见：蛋白质科学中的当前规程。第9章，第9.5节。
Yarzabek ，B.，Zaitouna，AJ，Olson，E.，Silva，GN，Geng ，J。，Geretz ，A。，Thomas，R.Krishnakumar ，S.，Ramon，DS和Raghavan，M.（2018）。HLA-B细胞表面表达，半衰期和细胞外抗原接受性的变化， Elife 7：34961。