材料和试剂

安全锁管（2.0 ml，Eppendorf，目录号：022363352; 1.5 ml，Eppendorf，目录号：022363204）
移液管头（的Rainin ，目录号：17005873，20微升;目录号：17005875，250微升;目录号：17007090，1 ，000微升）
不锈钢珠，5 毫米（Qiagen，目录号：69989），在室温下存储
盐酸Tris，1 mol / L 溶液（pH = 8.0）（Fisher Scientific，目录号：BP1758-500），在室温下保存
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884），在室温下保存
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271-10），在室温下保存
Triton X-100（Integra Chemical Company，目录号：T756.30.30），在室温下存储
cOmplete Mini，不含EDTA的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂（Roche，目录号：11697498001），储存在2-8 °C
可选：如果将检测到磷酸化蛋白，则磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂混合物2：Sigma-Aldrich，目录号：P5726 ；磷酸酶抑制剂混合物3：Sigma-Aldrich，目录号：P0044），存储在-20 °C
Pierce TM BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific，目录号：23225），在室温下保存
液氮
RIPA缓冲区（请参阅食谱）

设备

Qiagen TissueLyser II匀浆器（Qiagen，目录号：85300 ）。
Thermo Scientific微量离心机（冷藏）（Thermo Scientific，型号：Sorvall TM Legend TM Micro 17R，目录号：75002404）

程序

小鼠脂肪组织收获
收获脂肪组织[ 包括腹股沟/皮下白色脂肪垫（sWAT），内脏/附睾白色脂肪垫（eWAT），肩cap间棕色脂肪垫（BAT）等，如图1所示，详细信息请参见文章（Mann 等。，2014）] 并在液氮中速冻。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1392--1902955 YuAn 492083 \ Figs jpg \图1.jpg

1.鼠标脂肪图垫收获不同的位置S. A. 小号Ubcutaneous WAT（SWAT）。B. 我Nterscapular布朗AT（BAT）。C. Ë Pidydimal WAT（EWAT）。

组织匀浆
加入不带Triton X-100的0.5 ml RIPA缓冲液（在带有一个不锈钢珠的2.0 ml管中约100 mg脂肪组织）和蛋白酶抑制剂，并使用TissueLyser II（Qiagen）以最高频率匀浆3-5分钟，直到清除，放在冰上。
在4°C 下以6,000 xg 旋转15分钟。
小心地除去脂肪饼（指的是水层顶部的白色脂质层，如图2所示），然后重新悬浮松散的颗粒。
注意：或者，使用移液器吸头刺穿脂肪饼，并将溶液和沉淀转移到新的1.5毫升试管中。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1392--1902955 YuAn 492083 \ Figs jpg \图2.jpg

图2.不同样品中的脂肪饼。匀浆和离心后，箭头所示的脂肪饼是sWAT，BAT和eWAT样品中水层顶部的白色脂质层。

组织裂解和离心
加入Triton X-100至终浓度为1％（v / v），充分混合，然后放在冰上。
在4°C下孵育30-60分钟。
在4°C下以12,000 xg离心15分钟。
除去脂质的上层，然后将荧光粉转移到新的1.5 ml管中。
可选，但建议使用：重复步骤C3和C4两次以消除最大量的脂质。
将提取的样品储存在-80 °C直至进行进一步的BCA浓度测量（总结在表1中）。

表1. 不同脂肪垫的蛋白质浓度

扑打

样品1

样品2

样品3

平均

浓度（微克/微升）

3.81

3.63

4.96

4.13

电子商务

样品1

样品2

样品3

样品4

平均

浓度（微克/微升）

3.58

3.97

3.59

4.16

3.83

蝙蝠

样品1

样品2

样品3

样品4

平均

浓度（微克/微升）

8.23

8.62

7.48

8.00

8.08

执行Western Blottin g（参见图3）或其他应用程序。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1392--1902955 YuAn 492083 \ Figs jpg \图3.jpg

3.代表西图印迹图像中提取从。蛋白质样品共15个Myug蛋白在每个样品上样一个ň SDS-PAGE凝胶。脂联素的内部控制β-肌动蛋白在SWAT（左），EWAT（粗粉le）和BAT（右）被探测。

笔记

可以将初始体积的RIPA缓冲液添加到0.6 ml / 100 mg组织中。随着裂解缓冲液体积的增加，更容易去除脂质层，从而获得更高的脂质消耗效率。
有关更具代表性的Western blotting图像，请参阅我们引用的出版物（An 等人，2017 和2019）。
该协议不适用于特异性富集脂肪组织膜蛋白。

菜谱

RIPA缓冲区
50 mmol / l Tris-HCl（pH 8.0）

0.25摩尔/升氯化钠

5 mmol / l EDTA

1％的Triton X-10 0 （v / v）

致谢

这项研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（P01-DK088761，R01-DK55758和R01-DK099110（PES）），该方案源自An 等人（2017）发表的原始研究论文。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

本研究中进行的所有动物实验均获得德克萨斯大学西南医学中心机构动物护理和研究咨询委员会（APN＃2015-101207）的批准。

参考文献

一个，YA，太阳，K.，Joffin ，N。，章，F.，邓，Y.，东泽，O-。，Kusminski，CM和舍雷尔，PE（2017）.Angiopoietin-2在白色脂肪组织中提高代谢平衡通过增强的血管发生。网上生活6：e24071。
An，YA，Crewe，C.，Asterholm，IW，Sun，K.，Chen，S.，Zhang，F.，Shao，M.，Funcke ，J.-B. ，Zhang，Z.，Straub，L. ，吉野，J。，克莱因，S。，库斯敏斯基，CM和谢勒，PE（2019）。淀粉样前体蛋白的失调损害脂肪组织线粒体功能并促进肥胖自然代谢1（12）：1243-1257。
Benabdelkamel ，H。，马苏德，A.，Alanazi ，IO和Alfadda ，AA（2018）。来自脂肪组织使用差异凝胶电泳的蛋白质沉淀方法的比较。电泳。
Diaz Marin，R.，Crespo-Garcia，S.，Wilson，AM和Sapieha ，P。（2019）.RELi方案：优化从白色，棕色和米色脂肪组织中提取蛋白质的方法 X 6：918-928。
曼，A.，汤普森，A.，罗宾斯，N。和Blomkalns 。，AL（2014）。定位，识别和鼠脂肪切除油库 Ĵ显示精通（94）。d OI：10.3791 / 52174。