材料和试剂

1. 70 µm过滤器（Fisherbrand ，目录号：22363548）

2. 薄纸（Kimberly-Clark White Roll，Fisher Scientific，目录号：12774286）

3. 30G针（Microlance 3,30 ģX 13毫米）（BD ，目录号：304000）

4. 1.5 ml微量离心管（Starlab ，目录号：E1415-1510）

5. 离心管

50 ml管（Starlab ，目录号：E1450-0200 ）

15 ml管（Starlab ，目录号：E1415-0200）

6. 移液器技巧

200 µl 吸头（Starlab ，目录号：S1111-0806）

1毫升吸头（Starlab ，目录号：S1111-6801）

7. 3毫升巴斯德移液器（Starlab ，目录号：E1414-0311）

8. 8-12周大的雄性CD1或C57BL6 / J小鼠（查尔斯河）

9. 纯化的胶原酶（沃辛顿生物化学公司，目录号：CLSPA）

10. PI- 盒TM （Chemometec ，NucleoCounter中，目录号：941-0001）

11. 试剂A100；裂解缓冲液（SKU：910-0003，Chemometec ，NucleoCounter中）

12. 试剂B；稳定缓冲液（SKU：910-0002，Chemometec ，丹麦）

13. XF24 Fluxpak ，包含电池板，由传感器和通用板组成的墨盒以及Seahorse XF校准液（Agilent，Seahorse，目录号：100850-100）

14. 基质胶基质膜基质（Corning，目录号：354234）

15. 二甲基亚砜（DMSO，西格玛，目录号：D2650）

16. 纯正的乙醇（西格玛，目录号：459836）

17. 寡霉素A（Sigma，Merck，目录号：75351）

18. 羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯hydr（FCCP，C2920，Sigma，默克）

19. 来自链霉菌属的抗霉素A。（西格玛（Merck），目录号：A8674）

20. 鱼藤酮（Sigma，Merck，目录号：R8875）

21. DMEM（Sigma，默克，目录号：D5030）

22. L-谷氨酰胺100x（Gibco ，Life Technologies，目录号：25030-081）

23. D-葡萄糖（西格玛公司，默克公司，目录号：G7528）

24. 丙酮酸钠（Sigma，默克，目录号：P8574）

25. 氯化钠（西格玛，默克，目录号：S9888）

26. 氯化钾（西格玛，默克，目录号：P3911）

27. 氯化镁（西格玛，默克，目录号：M1028）

28. 氯化钙（西格玛公司，默克公司，目录号：21115）

29. 细胞外溶液（请参阅食谱）

30. 海马媒体（请参阅食谱）

设备

手术剪刀
水浴
-20°C冷冻室
多通道移液器20- 200 µl
Seahorse XF24细胞外通量分析仪（安捷伦），但也可以使用其他Seahor se通量分析仪
细胞计数器NucleoCounter中® NC-100 TM （900-0004，ChemoMetec ，丹麦）
倒置光学显微镜（GX Microscope XDS-3）

软件

Wave（Seahorse，安捷伦。https：//www.agilent.com）
棱镜（格拉夫派得软件公司，拉霍亚，CA https://www.graphpad.com）

程序

第一天

胰腺腺泡细胞prepar 通货膨胀
使用批准的附表1程序牺牲年轻（8-12周龄）成年CD1或C57BL / 6（野生型）小鼠。
将鼠标向下放在新鲜薄纸上的右手侧。
用镊子和剪刀剪掉腹部一侧的皮毛。去除后，请以类似的方式去除下皮表皮以暴露腹腔。
用镊子将胰腺轻轻置于脾脏下方，并用一小把外科剪刀将其切除。
将新鲜切除的胰腺放入7 ml冰冷的细胞外溶液中，并保持在冰上直至消化。
将1 ml胶原酶溶液（200 U / ml）预热至37 °C在水浴中。
使用30 G针小心地将预热的胶原酶注射到放在称重船上的胰腺样品中，直到胰腺膨胀为止。从称量舟中抽取胰腺中未保留的任何剩余胶原酶，然后重新注入胰腺中。
将膨胀的胰腺放入1.5 ml微量离心管中，并添加任何剩余的胶原酶。
置于37 °C 水浴中17分钟。
注意：此时间取决于所用胶原酶的品牌和浓度。您可能需要优化，让你得到一个实现细胞活力及细胞数量的最佳量。

孵育17分钟后，从水浴中移出并将1.5 ml微量离心管e的倾析物倒入15 ml的“ Panc ” 猎鹰管中，迅速加入5 ml细胞外溶液。
使用1ml移液管末端，切割在横跨针尖的角度，如图˚F igure 1i和卷集在700微升大力吸取整个胰腺组织上下，进出移液管末端，以允许组织离解（磨碎）。

注意：重复此过程，直到混合物因细胞释放而变得浑浊。

停止移液后，迅速用3 ml 巴氏移液管将细胞溶解物移至新的15 ml管标记的“细胞”中，小心留出任何胰腺组织。
将5 ml细胞外溶液添加到15 ml试管“ Panc ”中。
在比以前所使用的更小的角度使用新鲜1毫升移液管末端，切割小号TEP 甲11穿过移液管尖端，如图˚F igure 1II和卷集在700微升。用力用移液管吸取和移出整个胰组织，以使组织进一步分离。
停止移液后，使用3 ml 巴氏移液器迅速将细胞溶液移入15 ml试管“细胞”中，并小心留下任何胰腺组织碎片。
重复步骤阿14 -A 16用于使用新鲜1毫升移液管尖端切口在横跨针尖角的第三和最后的时间，如图˚F igure 1iii。

˚F igure 1.如何制备1个毫升吸管尖端的解离

丢弃残留在15毫升带“ Panc ” 标签的试管中的所有组织。
将15 ml标记为“细胞”的试管在室温下130 xg离心2分钟。
小心倒出上清液，留下松散的细胞沉淀。
将细胞沉淀重悬于1 ml冷却的细胞外溶液中。
加入额外的9毫升冷藏细胞外溶液。
在50 ml离心管（标有日期和日期）中设置70微米过滤器，并用少量细胞外液预湿。
从15毫升试管中的10毫升细胞悬液通过过滤器过滤到50毫升试管中。
用约30 ml冷却的细胞外液冲洗过滤器和留在过滤器中的所有细胞，直到50 ml离心管充满至40 ml刻度为止。
将50 ml离心管在130 xg 室温下离心2分钟引导“细胞” 。
小心倒出上清液，留下松散的细胞沉淀。
将细胞沉淀重悬于1 ml冷却的细胞外溶液中。
加入额外的9毫升冷藏细胞外溶液。
将装有样品的50 ml离心管在4 °C下放置过夜。

耗氧量和乳酸生成分析细胞板制备和药筒补液
卸下Seahorse XF 24孔细胞板并从包装中取出。
从-80 °C的冰箱中取出预先分装的250 µl Matrigel小瓶，在冰上解冻。
如下将康宁的“薄涂层方法”改用于Seahorse XF24细胞板上：
使用冷却的移液器，将BD Matrigel地下室膜基质混合至均匀。
使用无血清培养基Seahorse培养基稀释Corning Matrigel地下室膜基质。
小心地将36 µl稀释的BD Matrigel地下室膜基质添加到Seahorse XF 24孔细胞板中，确保不会产生任何气泡。
在室温下孵育30分钟。
吸出未结合的物质，弃去并通过将100 µl冷的无血清Seahorse培养基吸移到每个孔中来轻轻冲洗，然后立即使用多通道移液器吸出并弃掉。
将100 µl冷冻的无血清Seahorse培养基移液到每个孔中，并在4 °C下放置直至准备使用。
从包装中取出Seahorse XF 24墨盒。
卸下传感器板（墨盒的绿色上半部分），然后将盖子向下放在工作台上。
吸取1毫升XF 活化剂到实用板的24个孔中，并返回传感器板，这样每个孔的探针浸入XF 活化剂中。
放置在无37 °C CO 2的培养箱中过夜，直至准备使用。

第二天

评估胰腺细胞活力
第二天，将细胞悬液混合，使用1 ml移液器上下轻轻移液，以获得均质的悬液。
从细胞悬液中吸取1 ml细胞样品到1.5 ml微量离心管中。
标注PI- 盒式TM “NV”（非存活）。
通过将卡式盒的末端插入1.5 ml微量离心管中的细胞悬浮液中，将细胞悬浮液吸入PI- Cassette TM中。
保留要分析的“ NV” PI-Cassette™ 。
从1.5 ml微量离心管中吸取100 µl 1ml细胞样品到第二个1.5 ml微量离心管中。将剩余的任何细胞样品返回到原始的细胞悬液50 ml离心管'Cells'中。
向装有100 µl细胞样品的微量离心管中加入100 µl试剂A100。
通过移液混合。
向细胞悬液和试剂A100的混合物中加入100 µl试剂B。
通过移液混合。
标注PI- 盒式TM 'T'（总）。
通过将稀释的细胞悬浮液的尖端插入细胞悬浮液并按下活塞，将稀释的细胞悬浮液吸入PI- Cassette TM中。
立即将加载PI- 纸盒TM 在NucleoCounter中® NC-100 TM 样品盘，按RUN。
大约45 s后，总细胞浓度（cells / ml）显示在右下角。
产生的细胞数通常为x 10 5 。除以10得到x 10 6 用于以下计算。
如下计算总细胞数和生存力百分比：
细胞活力= ['NV' / （'T'x 3）] x 100

总活细胞计数= [（'T'x 3）–'NV'] x细胞悬液体积

表1显示了同时从两个独立的胰腺（取自两只动物）中分离腺泡细胞并汇总以进行分析时先前获得的总细胞数和生存力百分比的示例。

表1.先前获得的总细胞数和存活率百分比的示例

总读出

总细胞数

无效细胞计数

可行性（％）

体积（毫升）

总单元数（x1 0 6 ）

0.324

0.972

0.137

85.9

10

8.35

0.211

0.633

0.091

85.6

10

5.42

0.462

1.386

0.161

88.4

10

12.25

0.351

1.053

0.018

98.3

10

10.35

0.302

0.906

0.165

81.8

10

7.41

0.326

0.978

0.145

85.2

10

8.33

0.238

0.714

0.152

78.7

10

5.62

0.224

0.672

0.101

85.0

10

5.71

0.372

1.116

0.207

81.5

10

9.09

0.364

1.092

0.219

79.9

10

8.73

平均值±SD 。

85.0±5.6

8.1±2.2

将50 ml离心管在130 xg 室温下离心2分钟引导“细胞” 。
小心倒出上清液，留下松散的细胞沉淀。
用1 ml细胞外溶液重悬细胞沉淀。
细胞悬液需要调节至1 x 10 6 / ml的浓度。这可以通过将体积调整为与细胞总数相同的值来实现（活细胞总数= 5 x 10 6 ，将细胞体积调整为5 ml）。将50 ml离心管标签的ed'Cells' 离心2分钟，室温130 xg 。
现在可以将细胞接种到Matrigel涂层的Seahorse XF 24孔细胞板上（图2）。

图2. XF24细胞板的空白孔的孔分配

取出XF 24孔细胞板，并从每个孔中取出100 µl无血清的Seahorse培养基。
在播种过程中，通过上下移液连续混合细胞悬液，将75 µl细胞悬液转移到每个孔中，使以下细胞空白，从而每孔总共产生75,000个鼠类胰腺细胞。
将盖子放回XF24细胞板上，并放入37 °C CO 2的免费培养箱中1 h ，使细胞粘附。
在细胞粘附的同时，XF24弹药筒可以装载包含线粒体“压力”测试的化合物。
一小时后，从细胞中取出75 µl细胞外溶液。快速向每个孔中加入450 µl预热的无血清海马培养基。返回免费使用的37 °C CO 2 培养箱，直至可以使用。

准备和加载用于线粒体“压力”测试的化合物
可以执行两种类型的测定：
标准测定– 仅涉及试剂盒中包含的调节剂的注入。

改良分析法– 包括在寡霉素注射之前额外注射一种测试化合物，并且将端口A用于该测试化合物。

请参阅表2，以了解不同类型化验中化合物的上样体积和端口标记。

表2.线粒体压力测试的加载方式

港口

标准测定

改良分析

港口集中度

端口容量

一个

寡霉素

测试化合物

10倍

50

乙

FCCP

寡霉素

10倍

55

C

鱼藤酮和抗霉素A

FCCP

10倍

62

d

空的

鱼藤酮和抗霉素A

10倍

68

储存在-20 °C的储备溶液中，使工作浓度达到最终所需浓度的10倍，如下所示：
DMSO中的寡霉素储备溶液
在1 ml海马培养基中加入10 µl

对于10 µg / ml的10x溶液，最终浓度为1 µg / ml。

DMSO中的羰基氰化物4（三氟甲氧基）苯hydr（FCCP）储备溶液
1毫升海马培养基中3升

对于3 µM的10x溶液，最终浓度为0.3 µM。

DMSO和抗霉素中的鱼藤酮储备溶液，乙醇中的鱼藤酮储备溶液
在1毫升海马培养基中各10升

对于20 µg / ml的10倍溶液，最终浓度为2 µg / ml。

使用适当量的DMSO /乙醇或用于特定化合物的其他媒介物，为未接受化合物或压力测试的任何井或端口制作媒介物对照溶液。
从37 °C无CO 2的培养箱中同时取下传感器板和相应的公用板，并取下盖子。
将适合于测定类型的每种化合物的相应体积装入传感器板上的相应端口。
将所有化合物添加到端口后，即可将盖放回传感器板上，并返回到无37 °C CO 2的培养箱中，直至准备使用。

耗氧量和乳酸产量分析
对Seahorse细胞外通量仪进行如下编程：
标定。
平衡。
[混合– 2分钟，等待– 2分钟，测量– 2分钟] x 5以确保基线稳定。
注入A口。
[Mix –2分钟，Wait–2分钟，Measure–2分钟] x 3用于标准测定寡霉素注射，或x 5通常用于改良测定，这给任何测试化合物应用都提供30分钟。
注射B口。
[混合– 2分钟，等待– 2分钟，测量– 2分钟] x 3用于标准测定FCCP注射，x 3用于改良测定（寡霉素注射）。
注射端口C 。
[混合- 2分钟，等待2分钟，Measure- 2分钟]×2为标准测定抗霉素A /鱼藤酮注射和X 3为改进的测定，FCCP注射。
注入端口D（仅适用于改良测定）。
[混合– 2分钟，等待– 2分钟，测量– 2分钟] x 2仅用于改良测定，抗霉素A /鱼藤酮注射。
查看组定义，板图布局后，单击“开始运行”。
输入结果文件的保存位置后（测定完成之后），XF24分析仪上的托盘门将打开。

重要！开始校准之前，请确保：

传感器盒正确安装在工具板上。
从传感器盒中取出盖子。
传感器盒在效用板上的正确方向（方向）。
出现提示时，将传感器盒（已水合并装有化合物）和效用板放在托盘上。
按“开始”启动传感器盒校准。
完成校准的时间约为10-20分钟（用于37 °C的测定）。对于在其他37 °C 温度下进行的XF分析，将增加额外的30分钟预校准时间，以确保准确的数据采集。
传感器盒校准完成后，仪器控制器将显示“称重传感器板”对话框。
单击“打开托盘”以弹出实用板并将单元板装载到托盘上。该步骤将传感器盒保留在XF分析仪内部。

重要！在装载细胞板之前，请确保：

取下盖子，取出细胞板。
托盘上单元板的正确方向（方向）。
将细胞板放在托盘上后，单击“加载细胞板”以启动平衡。
完成平衡后，测定将自动开始获取基线测量值（如仪器规程中所述）。
仪器协议中的最终测量命令完成后，Wave Controller软件将显示“卸载传感器盒”对话框。
准备弹出传感器盒和电池板时，单击弹出。如果有必要，可以留待以后进行分析（例如-细胞计数归一化）。
卸下传感器盒和细胞板后，将出现“检测完成”对话框。
单击查看结果以立即打开化验结果文件。下载两个文件进行实验。
Excel文件。
Xfd 。文件。

数据分析

在Wave软件中打开Xfd 文件。
您需要通过选择“另存为”，然后选择，将文件格式更改为Prism文件。pzfx 格式。
现在可以直接在棱镜中打开数据。
每个实验条件每个平板至少需要3孔，而统计需要至少n = 6平板，每次使用从另一只小鼠分离的新鲜胰腺。
排除标准：
基线不稳定，通常是在基线显示稳定下降率时，基线低于或高于200 pMol / min OCR的基线过高或过高。
压力测试对照孔对压力测试化合物的响应不足。
离群数据点- 井的整个序列和/或单个数据点。

笔记

重要！在开始XF分析之前

目视检查进样口是否均匀。液体应在端口中，确保传感器盒顶部没有残留液滴。
在显微镜下查看细胞以：
确认细胞健康，形态，接种均匀性和纯度（无污染）。
对于粘附细胞，确保细胞粘附一致的单层细胞，并且在洗涤步骤中不要被洗涤掉。
菜谱

胞外SOLUT 离子[ （MM），使500 ml的溶液，表3 ]

表3.细胞外液配方

试剂/零件号

最终浓度

量

氯化钠

140毫米

4.09克

KCl （1.0 M溶液）

4.7毫米

0.175克

MgCl 2 （1 M溶液）

1.13毫米

0.565毫升

CaCl 2 （1 M溶液）

D-葡萄糖

HEPES

1毫米

10毫米

10毫米

0.500毫升

0.9克

1.2克

（使用NaOH调节pH到7.25）

海马媒体
通过将800 ml dH 2 O 添加到粉末状DMEM中来制备DMEM
如下表所示，通过在DMEM培养基中补充1 mM丙酮酸，2 mM谷氨酰胺和10 mM葡萄糖来制备测定培养基：

表4.无血清非缓冲海马培养基配方

试剂/零件号

最终浓度

体积

DMEM中

--

1.0升

D-葡萄糖（1.0 M解决方案）

10毫米

1.8克

丙酮酸盐（100 mM溶液）

1毫米

10毫升

L-谷氨酰胺（200 mM溶液）

2毫米

10毫升

将带有补充剂的XF培养基的pH值调节至7.4，并将最终体积调节至1 L ，然后转移至2级微生物安全柜中
用移液管过滤到无菌的50 ml等分离心管中。STOR 在长达1个月冰箱ê

致谢

这项工作得到了惠康基金会（102381 / Z / 13 / Z），医学研究理事会（英国）和美国国立卫生研究院（英国）授予NIHR利物浦胰腺生物医学研究部门的支持。该协议最初由Armstrong 等人在原始文章中发表。（2018）。

利益争夺

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突。

伦理

动物人道通过增加二氧化碳处死2 与利物浦动物福利委员会和伦理审查机构的批准大学设立中许可二千四百零八分之四十零按照动物（科学程序）（附表1个程序）法（1986年）（X70548BEB和PPL 70/8109）。

参考文献

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