材料和试剂

1. 塑料管（1.5毫升）（润滑脂，目录号：616201）

2. 超速离心管（1.5毫升）（Beckman Coulter，目录号：357448）

3. 玻璃小瓶（2毫升）（一次购，目录号：9-852-01）

4. 透析管（Tokyo Garasu Kikai Co.，Ltd，目录号：03272337）

5. 大肠杆菌极性脂质提取物（磷脂）（Avanti Polar Lipids，Inc.，目录号：100600C）

6. 1,2-二油酰基-sn- 甘油（DAG）（默克，目录号：D0138）

7. 2- [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪基] 乙磺酸（HEPES）（Dojindo Laboratories，目录号：342-01375）

8. 二硫苏糖醇（Wako，目录号：048-29224）

9. 氯仿，保证试剂（和光，目录号：038-02606）

10. 丙酮，保证试剂（和光，目录号：012-00343）

11. Ñ - 辛基- β - D- 吡喃葡萄糖苷（OG）（同仁化学实验室，目录号：O001）

12. [ 35 S] -EXPRESS蛋白标记混合物（PerkinElmer Inc，目录号：NEG072）

13. 纯系统（基因前沿，目录号：PF001-0.25）

14. 蛋白酶K（罗氏（Roche），目录号：03115879001）

15. 三氯乙酸，保证试剂（和光，目录号：204-02405）

16. 丙烯酰胺，电泳级（和光，目录号：011-08015）

17. Ñ ，Ñ “ - 亚甲基双（丙烯酰胺），电泳级（和光，目录号：130-06031）

18. 十二烷基硫酸钠（SDS），用于分子生物学（Wako，目录号：194-13985）

19. 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris），保证试剂（和光，目录号：207-06275）

20. Na 2 HPO 4 ，保证试剂（和光，目录号：197-02865）

21. NaH 2 PO 4 ，保证试剂（和光，目录号：192-02815）

22. 甘氨酸，保证试剂（和光，目录号：077-00735）

23. 溴酚蓝（和光，目录号：021-02911）

24. β - 巯基乙醇（和光，目录号：131-14572）

25. 甘油，保证试剂（和光，目录号：075-00611 ）

26. Ffh，如所述纯化（Eisner 等，2003）

27. FtsY，如所述纯化（Koch 等，1999）

28. YidC，如所述纯化（Nishikawa 等，2017）

29. SecYEG，如所述纯化（Moser 等，2013）

30. MPIase，如所述纯化（Nishiyama 等，2010和2012 ）

31. TALON金属亲和树脂（Clontech ，目录号：635503）

32. 成像板（GE，BAS IP MS 2025 E，目录号：28-9564-75）

33. 缓冲区A（请参阅食谱）

34. OG库存（请参阅食谱）

35. 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）（请参见食谱）

设备

浴式超声波仪（布兰森，型号：Bransonic 12 ）
冷冻干燥机（EYELA，型号：FD-80）
真空泵（ULVAC，型号：GCD-051X）
超速离心机（贝克曼库尔特公司，型号：Optima TL）
转子（贝克曼库尔特，型号：TLA-55）
保温箱（Eppendorf，型号：Thermomixer Comfort）
Phosphorimager（GE，型号：Storm 820）
-80 °C冷冻室

软件

ImageQuant软件（GE Healthcare）

程序

含有蛋白质因子如SecYEG和YidC的蛋白脂质体的制备
将磷脂溶液（25 mg / ml 的氯仿溶液）放在玻璃瓶中。对于一个重建样本，请使用200 μ克磷脂。在N 2 气流下向上干燥磷脂，直到大部分氯仿蒸发为止，然后在真空下的冷冻干燥器中放置1小时。
暂停在缓冲液A（50mM的HEPES-KOH，pH7.5的，1mM的磷脂（200微克/一个重构样品）二硫苏糖醇在）10毫克/米升，接着浴超声处理（约10秒），以形成脂质体，直到得到稍微不透明的悬浮液。
通过添加15％[w / v]的储备液，在1.5 ％[w / v] OG的缓冲液A中增溶脂质体。
混合溶解磷脂（200微克）与SecYEG （〜10 μ 克）和/或YidC （〜10 μ 克在1.5％溶解）[W / V] OG。将体积调节至100〜μ 升，保持OG浓度为1.5％[w / v的] 。将混合物在冰上孵育20分钟。
如果将SecYEG和YidC溶解在DDM或DPC中，则将其用于溶解SecYEG和YidC的清洁剂更改为OG。将样品上样至TALON柱，然后用含1.5％[w / v] OG的缓冲液洗涤，然后用含100 mM咪唑的缓冲液洗脱。对于SecYEG，将40％[w / v] 甘油添加到缓冲液中。保持DDM / DPC浓度尽可能低。
在4°C下用500 ml 缓冲液A 透析混合物至少3 h，以除去OG 形成蛋白脂质体。蛋白脂质体悬浮液变得有点混浊。
向透析的样品中加入0.9 ml 的缓冲液A，然后通过离心（170,000 x g ，1 h，4 °C）回收蛋白脂质体。重悬粒料50μ 升B的uffer甲。
通过冷冻（在液氮中）-融化（在室温下）-超声处理（约10 s）一次，使脂质体成为单层。超声处理后，请确保悬浮液未加热。
解冻和超声处理之前，如有必要，将冷冻的脂质体保存在-80 °C。

含DAG的脂质体的制备。
混合磷脂（1 mg）和DAG（0.05 mg），并按照步骤A1干燥脂质混合物。
暂停在缓冲液A将干燥的残余物以1个0毫克磷脂/米升，接着浴超声处理（〜10秒）。

含有DAG和MPIase的脂质体的制备
按照步骤B1所述，将磷脂和DAG 在氯仿中混合，然后将混合物干燥。通常，将25％[w / w]的DAG添加到磷脂中。
将混合物溶解在溶剂C中（氯仿/乙醇/水= 3/7/4），然后与溶解在溶剂C中的MPIase混合，通常相对于磷脂为25％[w / w]。
在N 2 流下蒸发溶剂C ，然后在真空下蒸发。
悬浮在干燥的残余物的缓冲液A在1个0毫克磷脂/米升，接着浴超声处理（〜10秒）。

蛋白脂质体与MPIase / DAG-脂质体融合以掺入MPIase和DAG
将步骤A中获得的蛋白脂质体悬浮液与MPIase / DAG-脂质体（步骤C）混合，通常以4：1的比例混合，可得到含有5％[w / w] DAG和5％[w / w] MPIase的蛋白脂质体。
重复冷冻（在液氮中）-解冻（在室温下）-超声处理（约10 s）的循环三次，以使脂质体融合。通过这种方式，可以制备含有SecYEG，YidC和MPIase / DAG的蛋白脂质体。

（3L-）Pf3涂层整合的反应（图1）
翻译体外底物蛋白，PF3涂层和亩TANT 3L-PF3涂层（基弗和库恩，1999 ; Serek 。等人，2004），使用纯系统，重构无细胞系统在体外翻译（西山等等人，2010；Shimizu 等人，2001）。Pure System（20 µl ）的反应混合物包含[ 35 S]蛋氨酸（2.5〜10 MBq / ml ；〜200 nM），质粒DNA（pT7-3L-Pf3或pT7-Pf3 [ Kawashima 等， 2008；Serek 等，2004 ] ；〜20 µg / ml ）和（蛋白）脂质体（0.4 mg磷脂/ ml ）（表1）。当需要高水平的合成时，向混合物中加入冷蛋氨酸（0.3 mM）。在这些条件下，观察到合成水平提高了约200倍。PURE系统是可商购自基因前沿，但调整缓冲系统customly 如所描述的（西山等人，2010）。为避免蛋白脂质体聚集，请确保Mg浓度为9 mM或更低，并且反应混合物中不包含PEG和多胺，例如腐胺和亚精胺。
在37°C下进行30分钟的翻译/整合反应。
通过在冰上冷却5分钟终止反应。将3 µl 和15 µl 的混合物（20 µl ）倒入新管中。
将3 µl 三氯乙酸（10％[w / v] ）加入等分试样（3 µl ）中以沉淀合成的蛋白质。
将等体积的蛋白酶K（1 mg / ml ）与另一等分试样（15 µl ）混合，然后在25 °C 孵育25分钟以生成MPF。
蛋白酶K消化后，添加30 µl 10％[w / v] 三氯乙酸，然后在56°C孵育5分钟以灭活蛋白酶K。在冰上孵育至少10分钟以沉淀MPF。
通过离心（10,000 xg ，持续5分钟）回收沉淀物（St eps E 4和E 6 ），然后用100％丙酮洗涤。离心（10,000 xg ，5分钟）后，将沉淀在室温下干燥20〜30 分钟。
将沉淀物溶于10 µl SDS样品上样缓冲液A中，然后煮沸3分钟。SDS样品上样缓冲液A由25 mM磷酸钠（pH 7.2），2.5％[w / v] SDS，25％[w / v] 甘油，2.5％[w / v] β- 巯基乙醇和0.0125％组成[w / v] 溴酚蓝。
如Nishiyama 等人所述，将样品加到含有6 M尿素的SDS凝胶上。（2006）。凝胶是由12.5％[W / V] 丙烯酰胺0.27％[W / V] Ñ ，Ñ “ - 亚甲基双（丙烯酰胺）在100 毫如描述磷酸钠缓冲液（pH 7.2）侯赛因等。（1980）。
电泳后，将凝胶浸入10％[v / v] 乙酸中10分钟，然后干燥。
将凝胶暴露在暗盒中的成像板上过夜。

表1.纯系统的组成

能源

2毫米

ATP，GTP

1毫米

CTP，UTP

20毫米

磷酸肌酸

缓冲液

50毫米

HEPES - KOH，pH 7.6

100毫米

谷氨酸钾

9毫米

醋酸镁

1毫米

DTT

其他组件

0.3毫米

除蛋氨酸外有19个氨基酸

10毫克/毫升

10-甲酰基-5,6,7,8-四氢叶酸

56 A 260 nm /毫升

混合RNA

酶混合物（1/20稀释）

1微米

核糖体

〜20微克/立方米升

质粒DNA

约200 nM

[ 35 S]蛋氨酸

0.4毫克/米升

（蛋白）脂质体

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1396--1903033西山健一837295 \ Figs jpg \ Fig1.jpg

图1.（3L- ）Pf3 涂层整合的测定方案

MtlA（甘露醇渗透酶）整合反应
使用pET-MtlA （Kuruma et al。，2005）和Pure System 合成E中的MtlA 。向反应混合物中加入Ffh（50 µg / ml ），FtsY（17 µg / ml ）和冷蛋氨酸（30 µM）。
在37°C下进行翻译/整合反应30分钟后，将5％[w / v] 三氯乙酸加入到等分试样（9 µl ）中，并按照步骤3中所述用蛋白酶K 消化另一等分试样（9 µl ）。小号E4- è 如步骤E5描述5.恢复沉淀。
溶解干燥的沉淀物在10 μ 升SDS样品上样缓冲液B的，随后煮沸3分钟。SDS样品上样缓冲液B由62.5 mM Tris-HCl（pH 6.8），3％[w / v] SDS，10％[w / v] 甘油，5.5％[w / v] β- 巯基乙醇和0.01组成％[w / v] 溴酚蓝。
如所述（Laemmli，1970）将样品加载到SDS-凝胶上。凝胶是由15％[w / v的] 丙烯酰胺的0.4％[w / v的] Ñ ，Ñ ' - 亚甲基双（丙烯酰胺）。
电泳后，将凝胶浸入10％[v / v] 乙酸中10分钟，然后干燥。将凝胶放在成像板上。

数据分析

确定整合活动

使用Phosphorimager检测合成底物和MPF的放射性谱带。
使用ImageQuant软件确定每个波段的放射性（图2）。使用软件手动减去背景水平。
通过将MPF水平除以合成底物的MPF水平来确定整合活性（图2，每个凝胶图像的底部）。考虑底物和MPF中蛋氨酸的数量。

D：\ Reformatting \ 2020-3-2 \ 1396--1903033西山健一837295 \ Figs jpg \ Fig 2.jpg

图2.完整定量分析结果的示例。一。Pf3涂层整合取决于MPIase，并受YidC刺激。乙。MPIase和SecYEG都是MtlA集成必不可少的。此外，YidC刺激MtlA的MPIase / SecYEG依赖性整合。蛋氨酸的数目（MtlA为25，MtlA-MPF为18）被用于活性测定。图像取自Sasaki 等人（2019年）（图3C和3D）。

菜谱

缓冲液A
用ddH 2 O将1 M HEPES-KOH（pH 7.2）和1 M二硫苏糖醇溶液分别稀释至50 mM和1 mM

OG库存
以15％[w / v]将OG溶解在ddH 2 O中，并在4 °C下储存

所以dium磷酸盐缓冲液（pH 7.2）中
准备1 M NaH 2 PO 4 和1 M Na 2 HPO 4 溶液
混合这些溶液，监测pH值，得到1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.2）
室温下的储备溶液

Acknowledg 发言：

这项工作得到了日本促进科学技术援助补助金协会18J21847（对HN）的支持；15KT0073、16H01374、16K15083、17H02209和18KK0197（针对KN）。该方案源自我们的报告（Sasaki et al。，2019）。

利益争夺

我们声明我们没有利益冲突。

参考文献

Alami，M.，Trescher，D.，Wu，LF和Muller，M.（2002）。大肠杆菌中双精氨酸易位（Tat）特异性膜结合和易位的单独分析。生物化学杂志277（23）：20499-20503。
I.Collinson，Breyton，C.Duong，F.Tziatzios，C.Schubert，D.Or，E.，Rapoport，T。和Kuhlbrandt，W。（2001）。细菌核心蛋白转位酶的投影结构和寡聚特性。Embo J 20（10）：2462-2471。
Eisner，G.，Koch，HG，Beck，K.，Brunner，J。和Muller，M。（2003）。配体以新生信号序列拥挤。J细胞生物学163（1）：35-44。
Hussain，M.，Ichihara，S.和Mizushima，S.（1980）。用球霉素处理的大肠杆菌胞质膜中外膜脂蛋白的含甘油前体的积累。生物化学杂志255（8）：3707-3712。
Y.Kawashima，E.Miyazaki，M.Muller，H.Tokuda和K.Nishiyama（2008）。二酰基甘油特异性阻断膜蛋白的自发整合，并允许检测因子辅助整合。生物化学杂志283（36）：24489-24496。
Kiefer，D.和Kuhn，A.（1999）。疏水力驱动噬菌体Pf3外壳蛋白的自发膜插入，而没有拓扑控制。EMBO J 18（22）：6299-6306。
Koch，HG，Hengelage，T.，Neumann-Haefelin，C.，MacFarlane，J.，Hoffschulte，HK，Schimz，KL，Mechler，B。和Muller，M。（1999）。纯化成分的体外研究表明，信号识别颗粒（SRP）和SecA / SecB是大肠杆菌两个独立的蛋白质靶向途径的组成部分。分子生物学细胞10（7）：2163-2173。
Koch，HG和Muller，M.（2000年）。剖析大肠埃希氏菌SecYEG转座子的转位酶和整合酶功能。细胞生物学杂志150（3）：689-694。
Y. Kuruma，K.Nishiyama，Y.Shimizu，M.Muller和T.Ueda（2005）。开发最小的无细胞翻译系统，用于合成分泌型和整合膜蛋白。生物技术进展21（4）：1243-1251。
英国Laemmli（1970年）。T4噬菌头组装过程中结构蛋白的切割。自然227（5259）：680-685。
Moser，M.，Nagamori，S.，Huber，M.，Tokuda，H.和Nishiyama，K.（2013）。糖脂酶MPIase对于蛋白前转运过程中SecG的拓扑反转至关重要。美国国家科学院院刊110（24）：9734-9739。
Newitt，JA和Bernstein，HD（1998）。大肠杆菌secY基因中的一个突变，对内膜蛋白的插入和蛋白输出产生明显的影响。生物化学杂志273（20）：12451-12456。
Nishikawa，H.，Sasaki，M.和Nishiyama，K.（2017）。F 0 F 1 ATPase 的F 0 c亚基的膜插入取决于糖脂酶MPIase，并受YidC刺激。Biochem Biophys Res Commun 487（2）：477-482。
Nishiyama，K.，Ikegami，A.，Moser，M.，Shiltz，E.，Tokuda，H。和Muller，M。（2006）。脂质A的衍生物参与信号识别颗粒/ SecYEG依赖性和非依赖性膜整合。生物化学杂志281（47）：35667-35676。
K.Nishiyama，M.Maeda，M.Abe，T.Kanamori，K.Shimamoto，S.Ksusumoto，T.Ueda和H.Tokuda（2010）。用于最简单的膜蛋白的膜整合的新型完整重组系统。Biochem Biophys Res Commun 394（3）：733-736。
K.Nishiyama，K.Maeda，K.Yanagisawa，Nagase，R.，Komura，H.，Iwashita，T.，Yamagaki，T.，Kusumoto，S.，Tokuda，H.和Shimamoto，K.（ 2012）。MPIase是膜蛋白整合必不可少的糖脂酶。Nat Commun 3：1260。
Samuelson，JC，Chen，M.，Jiang，F.，Moller，I.，Wiedmann，M.，Kuhn，A.，Phillips，GJ and Dalbey，RE（2000）。YidC介导细菌中膜蛋白的插入。自然406（6796）：637-641。
佐佐木M.，西川H.，铃木S.，Moser M.，Huber M.Sawasato K.，松林HT，熊崎K.，冢崎T.，久留米Y.，Nureki ，O.，Ueda，T.和Nishiyama，KI（2019）。细菌蛋白YidC加速了膜蛋白的MPIase依赖性整合。生物化学杂志294（49）：18898-18908。
Serek，J.，Bauer-Manz，G.，Struhalla，G.，van den Berg，L.，Kiefer，D.，Dalbey，R。和Kuhn，A。（2004）。大肠杆菌YidC是非Sec蛋白的膜插入酶。EMBO J 23（2）：294-301。
Y. Shimizu，A。Inoue，Y。Tomari，T。Suzuki，T。Yokogawa，K。Nishikawa和T. Ueda（2001）。用纯化的成分重建无细胞翻译。Nat Biotechnol 19（8）：751-755。
Stiegler，N.，Dalbey，RE和Kuhn，A.（2011）。M13 procoat蛋白插入YidC和SecYEG蛋白脂质体和脂质体中。分子生物学杂志406（3）：362-370。
Ulbrandt，ND，Newitt，JA和Bernstein，HD（1997）。的大肠杆菌信号识别颗粒所需的内膜蛋白的一个子集的插入。细胞88（2）：187-196。
韦尔特·T·库德瓦·R·库恩·P·斯特姆·L·布赖格·D·穆勒·M·沃舍伊德·B·德雷珀尔·F·科赫（2012）。大肠杆菌信号识别颗粒将多聚异位膜蛋白混杂靶向SecYEG或YidC 。分子生物学细胞23（3）：464-479。